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Article de méthode

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

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DOI :

10.3791/50716

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14 novembre 2013

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1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

La fonction des neurones de mammifères adultes-né reste une zone active de l'enquête. Rayonnements ionisants inhibe la naissance de nouveaux neurones. Utilisation de la tomographie par ordinateur guidée irradiation focale (CFIR), le ciblage anatomique tridimensionnelle des populations spécifiques progénitrices neurales peut maintenant être utilisée pour évaluer le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte.

Résumé

La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né demeure un défi important. Approches pour inhiber la neurogenèse adulte via livraison virale invasive ou des animaux transgéniques ont confond potentiels qui rendent l'interprétation des résultats de ces études difficile. De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent d'enquêter de manière non invasive une fonction de certains groupes de neurones adultes-né grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants focale inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et permet le ciblage des régions spécifiques progénitrices neurales. Afin d'éclairer le rôle fonctionnel potentiel que la neurogenèse adulte hypothalamique joue dans la régulation des processus physiologiques, nous avons développé une technique d'irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nés dans l'éminence médiane de l'hypothalamus. Nous décrivons une méthode pour C omputer tomographie guidéef ocal IR (CFIR) pour permettre la livraison anatomique précise et exacte ciblant les petits animaux. CFIR utilise tridimensionnel orientation d'image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose de rayonnement, réduit au minimum l'exposition au rayonnement de régions du cerveau non ciblés, et permet une distribution de dose conforme aux limites de faisceaux tranchants. Ce protocole permet de poser des questions concernant la fonction des neurones adultes-né, mais ouvre aussi des zones à des questions dans les domaines de la radiobiologie, la biologie de la tumeur, et de l'immunologie. Ces outils radiologiques faciliteront la traduction des découvertes sur le banc au chevet.

Introduction

Des découvertes récentes ont démontré que le cerveau des mammifères adultes peuvent subir un degré remarquable de plasticité. neurones adultes nés sont générés à l'âge adulte dans des niches spécialisées du cerveau des mammifères 1. Quelle est la fonction de ces neurones adultes-né? Et d'autant plus, ils jouent un rôle dans ne physiologie et le comportement? Les études sur ce sujet sont traditionnellement concentrées sur la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire de l'hippocampe, mais des études récentes ont caractérisé la neurogenèse dans d'autres régions du cerveau comme l'hypothalamus chez les mammifères 2. Neurogenèse a été rapporté dans le post-natale et l'hypothalamus adulte 2-10, et la fonction de ces neurones hypothalamiques nouveau-nés demeure une zone active de l'enquête.

La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né reste un défi important pour le domaine des neurosciences en général. L'inhibition sélective de specIFIC populations de cellules progénitrices neurales reste limitée par le manque de marqueurs moléculaires disponibles qui sont uniques aux populations progénitrices neurales simples 11. Ainsi, la suppression sélective des neurones adultes nés de ces progéniteurs neuronaux via le ciblage génétique reste difficile. De même, la livraison virale de cibler les neurones adultes-né souffre de variables confondantes potentielles telles que l'introduction des blessures et de l'inflammation dans l'environnement 12.

De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent de contourner ces facteurs de confusion et d'enquêter à ces questions grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et une méthode non invasive permet de cibler les populations progénitrices neurales 13-15. Récemment, nous avons décrit une région germinale de l'éminence médiane de l'hypothalamus chez les mammifères (ME) que nous avons appelé la zone proliférative hypothalamique (HPZ) 2 . Nous avons constaté que lorsque les jeunes souris femelles adultes ont été soumis à un régime riche en graisses (HFD), les niveaux de la neurogenèse chez les souris HFD nourris étaient sensiblement plus élevés que leur bouffe normale (NC) contrôles nourris dans cette région ME 2. Pour tester si la neurogenèse adulte dans le ME hypothalamique régule le métabolisme et le poids, nous avons cherché à perturber ce processus. L'éminence médiane est une petite structure unilatérale à la base du troisième ventricule à partir de laquelle hormones de régulation sont libérés. Afin d'inhiber la prolifération et la neurogenèse ultérieure sans altérer les autres fonctions physiologiques de cette région du cerveau, nous avons développé une technique d'irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nouvellement nés dans l'éminence médiane de l'hypothalamus 2.

Un certain nombre de groupes ont utilisé le rayonnement de supprimer la neurogenèse dans les régions canoniques 14-28. Cependant, les approches radiologiques précédentes ont généralement ciblé les grandes surfaces, ou Often involontairement également ciblé plusieurs zones du cerveau où la neurogenèse a été signalée, ce qui rend difficile d'associer sans ambiguïté les défauts comportementaux observés avec des défauts dans des populations particulières progénitrices neurales. La capacité de l'irradiation plus ciblée est assurée par des plateformes radiologiques qui combinent c omputer imagerie de tomographie guidée avec f ocal ir faisceau rayonnement (CFIR) livraison pour permettre un ciblage précis anatomique 29-36. Faisceaux de rayonnement aussi faibles que 0,5 mm de diamètre sont disponibles pour cibler des populations de cellules progénitrices neurales spécifiques 35. Cette méthode nous permet de cibler le ME hypothalamique et arrêtons prolifération et bloquons la neurogenèse chez les petits animaux. Après le traitement radiologique sur ces populations de cellules progénitrices, des tests physiologiques et comportementales peuvent être effectuées pour éclairer la fonction potentiel des cellules adultes-né. Ciblage focale est particulièrement important pour notre application depuis lehypophyse est situé à proximité de l'éminence médiane de l'hypothalamus, de l'hypophyse irradiation peut affecter la fonction hormonale et ensuite brouiller les résultats.

La base biologique pour la répression de la neurogenèse après irradiation ne sait toujours pas. Études sur les radiations précédents se sont appuyés sur de grosses poutres de la région, et ont conclu que la suppression de la neurogenèse est médiée par une réponse inflammatoire 14, 37. Comme tel, il est difficile de savoir si l'irradiation très focal pourrait supprimer la neurogenèse, car il n'évoque pas une réaction inflammatoire importante. Cependant, des études récentes par notre groupe de la région neurogène classique dans l'hippocampe ont démontré que l'irradiation très focal avec une dose de 10 Gy peut supprimer la neurogenèse pendant au moins 4 semaines après l'irradiation 35.

Pour interroger la fonction des neurones hypothalamiques adultes nés dans l'éminence médiane, nous utilisons un rayonnement de précision dériphérique capable de fournir l'imagerie CT en combinaison avec des faisceaux de rayonnement de faible diamètre ME inhiber la neurogenèse. L'utilisation d'un tube à rayons X fixé à un support mobile qui tourne sur une plage de 360 °, nous fournissons arc-faisceau faisceau de micro-irradiation à l'aide d'une platine porte-objet commandé par robot qui permet la rotation d'un sujet animal au cours du traitement de rayonnement (Figure 1) . Un détecteur de rayons X à haute résolution est utilisé pour acquérir des images lorsque le support mobile est dans la position horizontale 33. Pour cette étude, les images TDM ont été reconstituées avec une taille de voxel isotrope de 0,20 mm. Imagerie de bord CT a permis l'identification d'une cible alors que l'animal se trouve dans la position de traitement. La cible a été localisé à l'aide du logiciel de planification de la navigation dose-CT, qui a été inclus dans notre plate-forme radiologique disponible dans le commerce. Après localisation de notre ROI par imagerie CT, l'animal a été déplacé vers la position de traitement approprié par l'étage robotique de spécimen qui a quatre degrees de liberté (X, Y, Z, θ). Grâce à une combinaison de portiques et la scène de robot angles, poutres peuvent être livrés à partir de presque n'importe quelle direction par rapport à l'animal, et les traitements en forme d'arc stéréotaxiques sont possibles 29. Pour ces tous et d'autres études d'imagerie, les souris ont été placées dans un dispositif d'immobilisation qui permet la livraison de gaz isoflurane anesthésie tout en limitant le mouvement. Le lit d'immobilisation est compatible CT, et se connecte à l'étage de spécimen robotisé 34.

Nous nous attendons à ce que CFIR fournira avancées conceptuelles dans un certain nombre de domaines de recherche. Bien que nous utilisions le ciblage radiologique de l'éminence médiane de l'hypothalamus comme preuve de principe de cette technique, CFIR peut être utilisé pour cibler n'importe quelle région du corps d'un petit organisme modèle en principe. Dans le domaine des neurosciences, par exemple, nous envisageons cette technique pourrait être utilisée pour évaluer la fonction de populations de cellules progénitrices activement prolifératifs qui ont été proposés à exist dans d'autres organes, tels que circumventriculaires la région postrema 38, 39, subfornical organe 40, et 41 l'hypophyse. Controverses de longue date concernant le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte et identifiant un rôle causal dans le comportement peuvent désormais être mieux pris en compte. Dans chanteur, cette technique pourrait aborder le rôle de la neurogenèse adulte dans le maintien du comportement robuste et saisonnière de chants d'oiseaux 42, qui a été entravée par la capacité d'inhiber sélectivement la neurogenèse dans des régions spécifiques du cerveau. La compréhension de ce modèle de comportement robuste pourrait jeter un nouvel éclairage sur le rôle de la neurogenèse adulte dans la régulation d'autres comportements dimorphisme sexuel. En variante, dans le domaine du métabolisme, CFIR pourrait être utilisé pour explorer les aspects du rôle de la prolifération des hépatocytes et son rôle dans le métabolisme et la balance énergétique. La possibilité pour l'avance conceptuelle dans plusieurs disciplines de recherche est renforcée par l'introduction de cette technique.

Dans cet article, nous démontrons les capacités de CFIR de précision anatomique ciblage d'un faisceau d'irradiation focale. Bien que nous avons d'abord développé cette plate-forme de recherche sur les petits rayonnement animale (SARRP) pour nos études, d'autres dispositifs similaires sont maintenant disponibles dans le commerce qui peut accomplir tomodensitométrique similaire irradiation focale 43, 44. Par conséquent, nous généralisons ce protocole de CFIR avec des étapes nécessaires pour toutes les plateformes de recherche plutôt que celles qui sont spécifiques pour SARRP. Les avantages de CFIR par rapport aux approches radiologiques précédentes pour inhiber la neurogenèse sont que cette technique permet tridimensionnel orientation d'image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose, la dose conforme minimise l'exposition de régions du cerveau non ciblés, et de la géométrie du faisceau de haute précision permet une distribution de dose conforme à tranchants limites de faisceau. Nous décrivons comment utiliser l'imagerie CT-guidée de cibler la dose à une région anatomique spécifique, et en faisant ainsi, comment visualiser le rayonnementRépartition de la dose directement dans le tissu en utilisant une coloration immunohistochimique pour γ-H2AX, un marqueur de cassures double brin 35, 45-48. L'utilisation de cette approche pour l'irradiation sélective des niches neurogène peut avoir des conséquences importantes en révélant le rôle fonctionnel de nouveaux neurones adultes-né sur la physiologie et la maladie.

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Protocole

utilisation des animaux

Obtenir l'approbation du Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel pour les protocoles de soins standard et l'utilisation. Le protocole actuel est développé pour des études d'irradiation de 5,5 à 10 semaines d'intervention sur des souris adultes âgés C57BL6 / J, comme décrit précédemment (figure 2) 2. Cependant, d'autres âges et petites espèces animales (rats, hamsters, écureuils terrestres, etc) peuvent également être utilisés, à condition que les protocoles d'anesthésie efficace et radiographiques atlas de référence permettant l'identification de la région d'intérêt (ROI) sont disponibles.

Une. Calibration de la plate-forme radiologique CT-guidée

Effectuer des étalonnages à base de film pour la dose de rayonnement sur la plate-forme radiologique à l'avance pour chaque taille de collimateur et le type de filtre de tube à rayons X utilisés. Afin de cibler un faisceau d'arc de l'irradiation sur le site cible souhaitée, utilisez le logiciel de planification de dose rayonnement 49 en stocke sur la plupart des plates-formes de rayonnement commerciales pour calculer le délai de livraison souhaitée en fonction de la dose de rayonnement, la profondeur de la région d'intérêt (ROI) sur la base de tomodensitométrie de la souris, et la vitesse de rotation de la plate-forme robotique; détails sur cette sont laissés de côté de ce protocole car ils diffèrent entre les plates-formes de rayonnement. Aux fins de la visualisation de l'hypothalamus ventrobasal 2 (figure 3) avec l'imagerie CT, utiliser le tube à rayons X avec une tache focale de 0,4 mm et l'énergie du faisceau de 100 kV avec 1 mm Al filtration. Pour irradiation focale de la HPZ, utiliser le tube à rayons X à 225 kV, 13 mA, et une tache focale de 1 mm avec système de filtration de 0,15 mm Cu, de livrer 10 Gy de rayonnement à une profondeur de tissu de 0,6 cm sur un traitement temps de 4,6 min. Ciblage entre les différentes régions d'intérêt, il faudra calculer des paramètres différents.

  1. Si l'étude des effets de l'alimentation riche en graisses sur la neurogenèse dans l'éminence médiane comme décrit précédemment 2, obtenir quatre semaines-vieux C57B fémininL6 / J souris de laboratoires Jackson souris, et de la maison quatre souris par cage. Mettez la nourriture de bouffe normale à une alimentation riche en gras à l'âge de cinq semaines. Permettre souris s'acclimater à un nouveau logement et de la nourriture. Effectuer le traitement CFIR à l'âge de 5,5 semaines. Transport soumet à la salle d'opération qui contient la plate-forme radiologique. Réduire le niveau de stress pendant le transfert. Préparer la chambre de l'anesthésie au gaz isoflurane. Ensuite, ajoutez un simple clic dans la chambre. En parallèle, préparer coussin chauffant (bas de réglage) pour le post-traitement.
  2. Une fois la souris est sous et ne répond plus à la compression coussinet plantaire, amener le sujet à la plate-forme radiologique et placer sur le lit de l'immobilisation de la scène robotique. Placez la bouche dans le nez cône anesthésie tasse, et les dents de l'objet dans la gouttière occlusale (figure 1D). Lay à plat de la souris sur le lit d'immobilisation et de vérifier pour voir si elle continue à maintenir l'absence de réponse. Si c'est le cas, la bande adhésive souris sur le lit avec du ruban de gaze. Bien coller la souris pour le lit, Assurez-vous que la tête est nivelé à un plan horizontal. Ceci peut être déterminé en le tirant vers le haut des oreilles et de voir si elles sont nivelées. Une fois que la souris est dans la position correcte, fermer le bouclier protecteur de plomb.
  3. Acquérir de l'analyse par ordinateur tomographie utilisant le logiciel de bord de la plate-forme radiologique de l'expérimentateur (ce sera différent entre les plates-formes), qui fournira une analyse structurelle anatomique tridimensionnelle de l'objet de la souris. Vérifiez si la tête de la souris est nivelé au plan horizontal. Si pas, répétez les étapes 1.2 à 1.3 jusqu'à ce que la tête du sujet est nivelé.
  4. Identifier le ROI par l'image CT. Calculer la distance de ROI de la surface du crâne à l'aide d'un angle de 45 ° par rapport au plan horizontal comme le montre la figure 3E.
  5. En utilisant le logiciel de bord, prendre une radiographie de l'objet de la souris au-dessus comme le montre la figure 4A. Ensuite, retirez la souris à partir de la plate-forme radiologique, mettre sur le tapis de chauffage, et de surveiller jusqu'à active.
  6. A partir des images TDM coronale, calculer la profondeur ROI anatomique moyenne d'au moins trois souris afin de déterminer livraison dosage. A titre d'exemple d'une étude précédente 2 où 10 Gy d'irradiation a été administré à l'hypothalamus ventro-basal, la profondeur de la ROI du crâne (à partir d'un angle de 45 °) est de 0,66 cm (voir la figure 3E). Sachant cela, les chercheurs ont utilisé le logiciel de planification de la dose (DPS) installé sur leur plate-forme radiologique pour calculer la vitesse de rotation appropriée et la durée du traitement pour obtenir la dose souhaitée de la ROI.
  7. Après la détermination de la durée du traitement et de la vitesse de rotation de l'étage de robot avec le logiciel de planification de la dose, de mesurer les distributions de dose des paramètres calculés avec GAFchromic films sensibles au rayonnement incorporés dans un modèle souris maquette plastique équivalent dans l'eau. Pour ce faire, intégrer trois films sensibles aux rayonnements GAFchromic entre quatre blocs de plastique empilées verticalement équivalent-eau 29 quereprésenté sur la figure 4B.
  8. Placez modèle de souris maquette contenant des films GAFchromic sur scène robotique, et exécuter le faisceau d'irradiation focale avec les nouveaux paramètres calculés. Par exemple, pour cibler le ventrobasal hypothalamus, l'entrée des paramètres de 0,15 mm filtre de Cu, 225 kVp, 13 mA, 1 mm de réglage de rayonnement de diamètre de faisceau, à 45 ° d'angle de portique, 1,3 rotation ° / sec, et de 4,6 min pour atteindre une ROI dose de rayonnement de 10 Gy.
  9. Après l'irradiation, consultez films pour modèle et l'intensité de la dose de rayonnement. Pour un angle de rotation de 360 ​​° avec les paramètres indiqués à une cible, l'hypothalamus ventro-basal, un anneau foncé dans le film au-dessus de l'isocentre, une petite tache croustillant à la pellicule de l'isocentre, et un anneau plus léger dans le film au-dessous de l'isocentre correspondant au cône administration de faisceau de l'irradiation sera observé (figure 4B).
  10. Superposer isocentre films GAFchromic sur les rayons X de sujets de souris à partir de laquelle les paramètres sont calcalculée. Le point focal irradié à isocentre doit chevaucher avec la région de ROI désirée comme montré dans la figure 4C.

Autre méthode: Si la difficulté à cibler cerveau ROI persiste, utilisez contraste iodé injecté par voie intrathécale à améliorer la visualisation des ventricules dans les images CT. Par souci de concision, cette procédure est laissée hors de ce protocole, mais est décrit précédemment 35, 50. contraste de l'iode fournira sites ventriculaires supplémentaires (figure 5A).

2. Précision de l'irradiation de faisceau déterminer

Confirmer davantage la précision du faisceau CFIR par visualisation directe du faisceau de rayonnement dans le tissu 2, 35, 51. Pour ce faire, effectuez l'immunohistochimie pour détecter γH2AX 51, une protéine histone et un marqueur précoce de cassures double brin. Sujets de souris doivent être perfusés transcardiaque et fixés dans l'heure de l'irradiation. Après l'irradianceation, réparation de l'ADN rapidement s'ensuit, et les niveaux de ΥH2Ax diminuent de façon significative 35.

  1. Répétez les étapes 1.1 à 1.3.
  2. Après la cible est identifiée sur CT, l'objet de la souris est déplacé sous le contrôle robotisé d'aligner cette cible avec le faisceau d'émission de rayonnement. Les paramètres d'entrée calculés (vitesse de rotation et la durée du traitement pour obtenir la dose désirée) à partir de l'étape 1.6 dans un logiciel de planification de la dose et de commencer le traitement. Le traitement est administré avec le portique pointé 45 ° de la verticale alors que la souris tourne autour d'un axe orienté verticalement.
  3. Après l'irradiation, effectuer perfusion transcardial sur des sujets de souris. Effectuer perfusion en une heure 52. Après cerveaux perfusion, immersion fixes dans 4% PFA / PBS et balancer doucement pendant une nuit à 4 ° C.
  4. Le lendemain matin, lavez 5 min dans du PBS 3x pour enlever paraformaldéhyde fixateur. Ensuite, immerger dans 30% de saccharose dans du PBS 1x sur une bascule à 4 ° C.
  5. Secouez doucement à 4 ° C (noussivement 12-16 h), jusqu'à ce que le cerveau tombe au fond du tube. Cela sert comme une étape de cryoprotection. Une fois le cerveau évier, enlever cerveau avec une cuillère perforée pour éviter un excès de 30% sucrose/1x transfert PBS. Intégrer rapidement dans un milieu de congélation sur glace sèche. Agiter milieu de congélation avec la pointe de la pipette et aligner cerveau dans le moule en plastique.
  6. Une fois complètement congelée, transférer des blocs de cerveau de congélateur à -20 ° C pour le stockage.
  7. Le jour où l'immunohistochimie sera effectuée, section coronaire à 40 um d'épaisseur, et flottent dans une plaque de 24 puits contenant du PBS avec un pinceau fin. Les articles doivent être conservés afin de série correct pour immunomarquage pour déterminer la couverture d'irradiation de la région cible.
  8. Préchauffer la solution 0,01 M de citrate de sodium à 80 ° C dans un bain d'eau en vue de l'étape d'extraction de l'antigène. Simultanément, alors que le citrate de sodium est en train de chauffer, effectuer lavages de 5 minutes 3x dans du PBS 0,01 M.
  9. Une fois que la solution de citrate de sodium est à 80 ° C, immerger coupes de cerveau in de la solution de tampon de citrate de sodium. Laisser au bain-marie à 80 ° C pendant 1 heure.
  10. Déposer la partie et laisser la solution de citrate de sodium à atteindre la température ambiante, puis effectuez trois lavages de 5 minutes dans du PBS 0,01 M.
  11. Bloquer des coupes de cerveau pendant 1 h dans du PBS-Triton contenant 5% de sérum de chèvre normal.
  12. Incuber les coupes d'une nuit dans du PBS-Triton cerveau contenant 5% de sérum de chèvre normal à 1:700 concentration de l'anticorps primaire de souris anti-phospho-H2AX à 4 ° C.
  13. Le lendemain, effectuer 15 lavages min 3x à 0,01 M PBS-Triton.
  14. Incuber les coupes de cerveau de PBS-Triton contenant 5% de sérum de chèvre normal avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à 488 nm à une concentration de fluorophore 1:500 pendant 2 h.
  15. Accomplir 15 lavages min 3x dans du PBS 0,01 M-Triton.
  16. Effectuer 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) tache (1:5000 dans du PBS) pendant 10 min pour visualiser noyau. Ensuite, lavez les coupes de cerveau pendant 5 min avec du PBS.
  17. Montez sur électrostatique chmicroscope arged glisse par l'article flottant dans du PBS. Essuyez l'excès de PBS et permettent lames sécher. Lamelle les diapositives à l'aide milieu de montage et laisser les lames sécher à l'obscurité à température ambiante jusqu'au lendemain.
  18. Prenez des photos de coupes coronales série avec microscope à fluorescence. ΥH2Ax immunologique (vert) indique le site de l'irradiation. DAPI (bleu) est un colorant nucléaire (figure 5B).

3. Préparation de souris Sujets pour l'irradiation focale

Examiner les résultats d'immunomarquage ΥH2Ax. Une fois satisfait de l'étalonnage et le ciblage du faisceau d'irradiation, procéder à l'expérience. À ce stade, le temps total nécessaire pour traiter une souris (de configuration de l'animal à l'achèvement de la prestation de faisceau) est d'environ 10-15 minutes pour un traitement de 10 Gy avec un faisceau de 1 mm.

  1. Commandez-quatre semaines, âgé de souris femelles C57BL6 / J de laboratoires Jackson souris. Maison quatre souris par cage, et passer la nourriture de bouffe normaleà un régime alimentaire riche en matières grasses à l'âge de cinq semaines. Souris oreille de punch pour leur donner des marques d'identification uniques. Surveiller la santé de souris tous les jours. Remarque: marqueurs métalliques ne peuvent pas être utilisés tels qu'ils résulteront en stries artefacts sur le CT.
  2. Peser souris le jour avant la radiothérapie ou fictive. souris divisé en deux cohortes de radiothérapie ou de simulacre et de s'assurer qu'il n'y a pas de différence significative de poids entre les cohortes. Le jour du traitement, lorsque les souris sont de six semaines, la réévaluer toutes les souris et enregistrer leur masse. Transporter doucement les deux cohortes de la plate-forme radiologique. Prendre soin de minimiser le niveau de stress.
  3. Préparer la chambre de l'anesthésie au gaz isoflurane. Anesthésier deux souris, l'une dans le groupe d'irradiation prédéterminée, et une autre dans le groupe témoin factice. Préparer coussin chauffant réglé dans la bas pour le traitement post-opératoire.
  4. Suivez les étapes 1.2 à 1.4 pour la souris à une irradiation. Pour la souris imposture, garder la souris dans la chambre anesthésie tandis que le traitement est en cours. Faire sure que la chambre de l'anesthésie est proche de la plate-forme de CFIR si les effets sur le rayonnement ambiant sont pris po Après la cible est identifiée sur CT, déplacer l'objet de la souris sous le contrôle robotisé d'aligner cette cible avec le faisceau d'émission de rayonnement. Entrée calculé paramètres (vitesse de rotation et la durée du traitement) dans le logiciel dose de planification.
  5. Une fois le traitement d'irradiation est terminée, retournez imposture et souris irradiées à coussin chauffant, et suivre jusqu'à ce qu'ils se réveillent.
  6. Retour à la fois factice et souris irradiées à l'animalerie. Surveillance de tous les jours. Peser la souris toutes les demi semaines. Pour confirmer l'irradiation de la zone proliférative hypothalamique ciblée, administrer des injections intra-péritonéales de BrdU (50 mg / kg), trois jours après le traitement et examiner la neurogenèse entre les groupes par co-marquage de l'immunohistochimie pour BrdU et un marqueur neuronal un mois après l'exposition au BrdU initiale (Figure 6) 2.

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Résultats

Évaluation de ciblage tomodensitométrique et précision

L'étalonnage du système mécanique est essentielle pour assurer que les faisceaux de différents angles tous se coupent en un seul point. L'étalonnage a été réalisé avec un procédé à base de formation d'image à semi-automatique, où la précision de l'alignement bout-à-bout a été mesuré à 0,2 mm 29. Cette précision est très critique à mesure que le volume de la structure de l'éminence médiane de l'hypothalamus...

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Discussion

Irradiation focale tomodensitométrique (CFIR) est une approche nouvelle et complète du système capable de fournir des champs de rayonnement à des cibles dans les petits animaux sous contrôle robotique utilisant CT-guidage 32. La capacité de CFIR à fournir des faisceaux très ciblés à de petits modèles animaux offre de nouvelles possibilités de recherche pour combler la recherche en laboratoire et la traduction clinique. Ce document décrit l'approche de CFIR pour la livraison de rayonnement précis pour cibl...

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Déclarations de divulgation

JW a une entente de financement et de consultation avec la recherche Xstrahl, Inc.

Remerciements

Nous remercions C. Montojo, J. Reyes, et M. Armour pour obtenir des conseils et une assistance technique. Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health subvention F31 NS063550 (DAL), à un prix Basil O'Connor Starter Scholar et des subventions du Fonds Klingenstein et NARSAD (à SB). SB est un WM Keck Distinguished Scholar jeune en recherche médicale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plateforme de recherche SARRPXstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
Bunker d’irradiation SARRPXstrahlFacultatif, mais l’exposition aux rayonnements doit être contenue avec un blindage au plomb alternatif
GAF film chromiqueIPSGAFchromic ETB2
Souris fantômeGammex457Achetez des dalles d’eau pleine de 0,5 cm x 30 cm x 30 cm chez Gammex et coupez-les à la taille souhaitée.
Anticorps anti-phospho-histone H2AX Ser139 de sourisMillipore, Inc.05-636clone JBW301
Régime alimentaire riche en graisses pour rongeursRechercheRégimes D12492i60 % des calories sous forme de graisse, les aliments doivent être irradiés
IsofluraneBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0,01 M Citrate de sodiumFisher Scientific1,471 g de citrate de sodium dissous dans 500 ml d’eau déminéralisée
Lames Superfrost PlusScientific12-550-15
DAPIFisher ScientificContre-colorant nucléaire
Milieu de montageFisher ScientificVectashield ou Gelvatol est préféré
Fisher

Références

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