Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Un Exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser DmWRNexo, orthologue humain progéroïde WRN Exonuclease, et son application à d'autres nucléases

4.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/50722

⸱

23 décembre 2013

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

Dans cet article

Résumé

Les exonucléases jouent un rôle essentiel pour assurer la stabilité du génome. La perte de la fonction de l’exonucléase WRN entraîne un vieillissement prématuré. L’étude des substrats et d’autres exigences de la nucléase in vitro peut aider à élucider son rôle in vivo. Ici, nous démontrons un test rapide et reproductible basé sur la fluorescence pour mesurer son activité nucléase.

Résumé

WRN L’exonucléase est impliquée dans la résolution des dommages à l’ADN qui se produisent soit lors de la réplication de l’ADN, soit à la suite d’une exposition à des génotoxines endogènes ou exogènes. Il est probable qu’il jouera un rôle dans la prévention de l’accumulation d’intermédiaires recombinogènes qui s’accumuleraient autrement au niveau des fourches de réplication transitoirement bloquées, ce qui correspond à un phénotype hyper-recombinant de cellules dépourvues de WRN. Chez l’homme, le domaine de l’exonucléase comprend une partie N-terminale d’une protéine beaucoup plus grande qui possède également une activité hélicase, ainsi que des sites supplémentaires importants pour l’interaction entre l’ADN et les protéines. En revanche, chez la drosophile, l’activité exonucléase de WRN (DmWRNexo) est codée par un locus génétique distinct de l’hélicase présumée, permettant une dissection biochimique (et génétique) du rôle de l’activité de l’exonucléase dans les mécanismes de stabilité du génome. Ici, nous démontrons une méthode fluorescente pour déterminer l’activité des exonucléases WRN à l’aide de DmWRNexo recombinant purifié et d’oligonucléotides fluorescents marqués en bout. Ce système permet une plus grande reproductibilité que les tests radioactifs, car les oligonucléotides du substrat restent stables pendant des mois, et fournit une méthode plus sûre et relativement rapide pour l’analyse détaillée de l’activité des nucléases, permettant de déterminer la polarité, la processivité et les préférences du substrat des nucléases.

Introduction

Les nucléases jouent un rôle essentiel dans les cellules en éliminant l’ADN endommagé, en résolvant les structures non duplex telles que les jonctions de Holliday et en fournissant une capacité de relecture lors de la réplication de l’ADN, à la fois intrinsèques aux ADN polymérases et extrinsèques à celles-ci1. Les nucléases peuvent agir soit en dégradant séquentiellement l’ADN des extrémités libres (exonucléases), soit en clivant les liaisons phosphodiester internes au sein d’une molécule d’ADN plus longue (endonucléases). La perte d’activité des nucléases peut entraîner des phénotypes d’instabilité du génome très spécifiques. Alors que la mutation du membre de la famille des hélicases RecQ BLM entraîne des taux excessivement élevés d’échange de chromatides sœurs et des taux de cancer globalement élevés (examiné par Payne et Hickson2), la mutation de la protéine WRN hautement apparentée conduit à un vieillissement prématuré3 ; la différence significative majeure entre ces deux membres de la famille est la présence d'un domaine d'exonucléase 3'-5' avec dans WRN4. Les preuves d’un rôle critique de l’exonucléase WRN dans le maintien de la stabilité du génome se sont accumulées à partir de l’analyse des génotypes chez les patients atteints de WS5, ainsi que des études de mutation ponctuelle et de délétion dans des cellules humaines, étayées par des études cristallographiques du domaine isolé de l’exonucléase6. Cependant, la coopération et l'interaction entre l'activité exonucléase de WRN et son activité hélicase centrale7 rendent difficile de démêler la fonctionnalité de chacun et leurs contributions relatives à la stabilité du génome. Chez les plantes et les animaux à métazoaires inférieurs, l’activité de l’exonucléase WRN est présente sur un seul polypeptide dépourvu d’activité hélicase8-10 (examiné dans Cox et Boubriak11) ; il a été démontré biochimiquement chez Arabidopsis que cette exonucléase agit de manière coordonnée avec l’hélicase WRN apparentée, reconstituant efficacement les activités enzymatiques combinées observées chez les vertébrés WRN9. Nous avons étudié l’exonucléase WRN chez la drosophile car les excellents outils génétiques permettent d’analyser l’impact de la mutation de l’exonucléase (sans impact sur l’hélicase apparentée présumée) au niveau de l’organisme entier et tout au long du développement10,12. De plus, nous avons cloné, exprimé et purifié l’exonucléase recombinante de Drosophila WRN (DmWRNexo) permettant une analyse biochimique complète de ses propriétés enzymatiques13,14.

L’analyse in vitro des nucléotides a traditionnellement été réalisée à l’aide d’oligonucléotides radiomarqués, évaluant la dégradation en recherchant une échelonnement des produits sur des gels d’acrylamide4,8,15. Bien que sensibles, ces tests ne sont pas quantitativement reproductibles au jour le jour en raison de la désintégration radioactive des substrats marqués. De plus, la manipulation et l’élimination des réactifs radioactifs posent d’importants problèmes environnementaux et sanitaires. L’approvisionnement en radiolabel devient également de plus en plus problématique. Une autre méthode récente consiste à évaluer la quantité de produit final de dégradation par spectrométrie de masse16. Cependant, cela prend du temps (cela prend plusieurs jours), nécessite un équipement spécialisé, et la lecture est la quantité de produit final (nucléotide unique) et ne convient donc pas à la mesure sensible d’aspects tels que la processivité enzymatique ou pour déterminer si certains nucléotides, séquences ou modifications entraînent une pause ou un arrêt des nucléases. Pour surmonter ces problèmes, nous avons adapté les tests traditionnels à base de gel pour une utilisation avec des substrats d’oligonucléotides fluorescents, générant des substrats marqués de manière stable qui peuvent être utilisés de manière reproductible sur de longues périodes de temps et permettent ainsi une comparaison directe des activités des nucléases dans différentes conditions.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation des oligonucléotides de substrat

  1. Synthétiser des oligonucléotides personnalisés.
    1. Concevez un oligonucléotide simple brin avec une molécule de fluorescéine conjuguée à 5' ; ce sera l'épine dorsale de chaque substrat. (Notez qu'il s'agit d'une exonucléase 3'-5' ; pour une exonucléase de polarité 5'-3', utilisez un brin de squelette conjugué 3'). Si la polarité n'est pas connue, les valeurs 3' et 5' doivent être testées.
    2. Concevoir des brins complémentaires de sorte que, lorsqu’ils sont recuits à l’oligonucléotide marqué par fluorescence, le ou les substrats duplex de leur choix se forment. Notez que le brin complémentaire n’est pas conjugué à un fluorophore. Lors de la commande, spécifiez PAGE-purification (le dessalage n’est pas suffisant).
    3. Stocker les stocks d’oligonucléotides tamponnés dans 10 mM à 1 nmol/μl à −20 °C et dans l’obscurité.
  2. Mélanger l’oligonucléotide marqué du squelette avec chaque oligonucléotide complémentaire non marqué dans un rapport molaire de 1:1,2 tampon marqué :non marqué dans (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl). (Remarque : un rapport de 1:1 est le plus souhaitable, mais il est plus important que TOUT le brin étiqueté soit lié. Des rapports de 1:1 à 1:1,5 peuvent fonctionner.)
  3. Chauffez un bain-marie ou un bloc chauffant à 95 °C et placez-y le mélange de recuit pendant 3 minutes, puis éteignez et laissez l’ensemble refroidir lentement (1 °C/min) jusqu’à moins de 30 °C.
  4. Vérifiez le recuit complet de l’oligonucléotide marqué en exécutant le substrat duplex résultant sur un gel natif de polyacrylamide à 10 % (10 % d’acrylamide :bis-acrylamide dans 1x Tris-Borate-EDTA (TBE, 89 mM de base Tris, 89 mM d’acide borique, 2 mM d’EDTA) polymérisé avec 0,05 % p/v de persulfate d’ammonium (APS) et 0,005 % v/v TEMED). Visualisez via PhosphorImager (voir section 5 ci-dessous).

2. Préparation des gels d’acrylamide

  1. Installez le système de coulée de gel, par exemple le gréement de gel Hoefer SE400, avec des plaques de 16 cm x 18 cm et des entretoises de 1,5 mm.
    1. Nettoyez soigneusement les plaques de verre et les entretoises avec un détergent et de l’eau. Portez des gants propres pour éviter de salir à nouveau les plaques avec l’huile des doigts, ce qui entraverait la formation uniforme de gel.
    2. Rincez abondamment les plaques avec de l’eau distillée (déminéralisée) pour éliminer les résidus de détergent, puis essuyez avec un chiffon non pelucheux (par exemple des lingettes Kimwipes).
    3. Enfin, vaporisez de l’éthanol à 70 % et essuyez - les plaques de verre doivent grincer si elles sont propres. Mettez-le de côté à la verticale pour permettre au reste de l’éthanol de s’évaporer.
    4. Nettoyez le reste de l’équipement de formation de gel avec de l’eau distillée (utilisez d’abord un détergent si nécessaire) et séchez-le.
    5. Assemblez les plaques de verre et les entretoises dans le dispositif de formation de gel, en vous assurant que le système est étanche.
  2. Préparez la solution de gel au pourcentage de polyacrylamide souhaité
    1. Pour le dosage des nucléases, utilisez des gels de polyacrylamide dénaturants à 14 % avec de l’urée 8 M dans 1x TBE.
    2. Pour obtenir 100 ml (assez pour 2 gels avec beaucoup d’excédent pour les fuites), prenez 48,05 g d’urée dans un bécher large et ajoutez 35 ml de solution d’acrylamide 19:1 à 40 % et 10 ml de TBE 10x (890 mM de Tris, 890 mM d’acide borique, 20 mM d’EDTA, pH 8,3 avec NaOH). ATTENTION : Portez des gants - l’acrylamide est une neurotoxine puissante. Dissoudre l’urée à l’aide d’une barre d’agitation et d’une plaque d’agitation magnétique (cela prendra un certain temps).
    3. Une fois dissoute, ajouter de l’eau désionisée au milliQ dans 100 ml. Stériliser par filtre à l’aide d’une membrane de 0,22 μm. S’il ne doit pas être utilisé immédiatement, dégazez brièvement à l’aide d’un équipement d’aspiration et stockez-le dans l’obscurité (se conservera quelques jours). Ne pas réfrigérer car l’urée va précipiter.
  3. Polymériser et couler le gel.
    1. Prenez l’urée-acrylamide et ajoutez 0,5 ml de persulfate d’ammonium à 10 % (p/v) (APS, mélangé à de l’eau distillée) et 50 μl de TEMED. Faites tourner lentement le récipient pour mélanger sans laisser d’air (ce qui inhibera la polymérisation) et versez dans le gélifiant. Agissez rapidement ou le gel peut prendre avant la fin du versement.
    2. Ajoutez le peigne approprié pour former des puits pour le chargement de l’échantillon (choisi en fonction de l’appareil de gel et du numéro d’échantillon à analyser, par exemple, les peignes à 15 ou 29 dents conviennent pour une utilisation avec l’appareil de gel Hoefer). Vérifiez qu’aucune bulle d’air n’est introduite sous les dents du peigne.
    3. Laisser prendre. Surveillez les fuites. La polymérisation complète est retardée au niveau des rayons en raison du contact avec l’atmosphère. Lorsque les puits sont fermes, le reste du gel sera pris.
    4. Retirez les rayons et rincez l’acrylamide non polymérisé à l’aide d’eau et d’une pipette.
  4. Installez le gel pour la course.
    1. Placez le gel coulé dans le système de coulée de gel et ajoutez la quantité appropriée de 1x tampon de coulée TBE dans la chambre inférieure et dans les puits de gel. Le gel est maintenant prêt à être chargé.

3. Préparation de la protéine DmWRNexo recombinante marquée par his

  1. Expression bactérienne de la protéine DmWRNexo
    1. À l’aide d’une boucle d’inoculation, prélever les bactéries en grattant la surface des stocks de glycérol maintenus à -80 °C (les bactéries sont des E. coli T7 Iq LysY (NEB) transformées avec pIVEX2.3d-DmWRNexo). Étalez sur des plaques de gélose LB (10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl, 15 g de gélose jusqu’à 1 L avec de l’eau distillée et un pH ajusté à 7,4) avec 50 μg/ml d’ampicilline. Incuber à l’envers pendant la nuit à 37 °C.
    2. Prélever une seule colonie de la plaque dans 50 ml de LB (10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl jusqu’à 1 L avec de l’eau distillée) complétée par 50 μg/ml d’ampicilline (préparée dans de l’eau et stérilisée par filtre à 0,22 μm). Cultiver en secouant à 220 tr/min 37 °C pendant la nuit.
    3. Inoculer 1,8 L (aliquotes de 600 ml chacune dans trois flacons coniques de 2 L pour assurer une aération adéquate) de LB-ampicilline avec la culture de 50 ml pendant la nuit et augmenter jusqu’àOD 600 ~ 0,8. Ajouter IPTG à une concentration finale de 0,7 mM et incuber à 26 °C (pour éviter l’agrégation des protéines) en agitant pendant 4 à 8 heures.
    4. Récoltez la pastille cellulaire par centrifugation à 8 000 tr/min 4 °C pendant 10 min - utilisez 6 bouteilles de centrifugeuse en plastique stériles de 500 ml avec 300 ml de suspension cellulaire dans chacune. Jetez le surnageant et remettez en suspension le granulé dans un petit volume (10 ml) de l’ampli LB d’origine, transférez-le dans un tube Falcon de 15 ml, puis respirez à 5 000 tr/min pour granuler les cellules - retirez à nouveau le surnageant et congelez-le à -80 °C (cela aide à la lyse).
  2. Lyse cellulaire bactérienne
    1. Compléter 3,2 ml de tampon de lyse contenant 1 ml de 5 M NaCl, 1 ml de 1 M DTT, 200 μl de benzamidine 1 M et 1 ml de lysozyme à 10 mg/ml (remis en suspension dans de l’eau distillée).
    2. À chaque pastille dérivée d’une suspension bactérienne de 300 ml, ajouter un tampon de lyse de 320 μl. Remettez en suspension autant que possible - utilisez une pointe p1000 « sciée » et remuez ainsi que le pipetage de haut en bas. Incuber sur glace 20 min. Ajoutez un tampon de lyse supplémentaire de 100 μl et mélangez bien, puis transférez autant que possible le lysat remis en suspension dans un tube microfuge (il sera très visqueux et difficile à pipeter).
    3. Centrifuger le lysat à 14 000 tr/min dans un rotor de microfuge prérefroidi à 4 °C pendant 30 min, puis amener le surnageant dans un tube de microfuge propre : celui-ci contient la protéine recombinante.
  3. Purification de son piège
    1. Préparation des réactifs : Étiqueter 5 tubes de microfuge pour chacune des concentrations suivantes d’imidazole : 40 mM, 60 mM, 100 mM, 300 mM et 500 mM (par exemple l’étiquette 40-1, 40-2, 40-3, etc.), qui seront utilisés pour recueillir les fractions de colonne. Conservez les tubes sur de la glace dans une grille avec les couvercles ouverts (mais couvrez sans serrer avec un film alimentaire ou similaire pour rester propre pendant que vous préparez tout le reste). Préparer 25 ml d’imidazole de 20 mM et 10 ml de souches de chacune des autres concentrations d’imidazole dans des tubes universels de 25 ml, en utilisant 1 PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, pH ajusté à 7,4 et porté à 1 L avec de l’eau distillée) comme diluant.
    2. Ajuster le lysat bactérien à 20 mM d’imidazole à l’aide d’un volume approprié de solution mère d’imidazole de 2 M, et ajuster le volume à au moins 1 ml (<5 ml) à l’aide d’un volume d’imidazole de 20 mM.
    3. Laver une colonne His-Trap de 1 ml (Amersham) avec 10 ml d’eau MilliQ à l’aide d’une seringue de 5 ou 10 ml avec Luer lock et une légère pression manuelle, puis équilibrer la colonne en passant dans 10 ml d’imidazole à 20 mM constitué de PBS (voir l’étape 3.3.1 ci-dessus).
    4. Chargez le lysat sur la colonne. Lorsque le lysat est chargé sur la colonne, une contre-pression importante peut être ressentie ; C’est tout à fait normal. Ne soyez pas tenté d’appliquer trop de force sur la seringue et maintenez une pression constante et uniforme. Il est habituel de voir un léger changement de couleur lorsque le lysat pénètre dans la colonne. Recueillir le débit dans un flacon bijou Sterilin (capacité de 7 ml) et le conserver sur de la glace.
    5. Lavez la colonne avec 10 ml d'imidazole de 20 mM et recueillez-le dans un tube universel de 25 ml sur de la glace, étiqueté comme « lavage ».
    6. Faites passer 5 ml d’imidazole 40 mM dans la colonne, en recueillant les fractions de 1 ml dans chacun des tubes microfuges (étiquetés 40.1, 40.2, 40.3, etc.) : surveillez attentivement le piston de la seringue car cela permet de mesurer 1 ml.
    7. Passez maintenant séquentiellement 5 ml de chacun des 60 mM, 100 mM, 300 mM et 500 mM d’imidazole, en recueillant à nouveau 5 fractions de 1 ml à chaque concentration de sel.
  4. Analyse des fractions de colonne
    1. Dot blot : Dot 2 μl de chaque fraction de colonne (et également charger, écouler et laver) sur une feuille de nitrocellulose - c’est plus facile si cela est préréglé avec une grille à l’aide d’un crayon doux). Laisser sécher à l’air libre. Traiter le dot blot en le bloquant pendant 15 minutes à 1 heure à température ambiante dans du lait écrémé à 5 % de lait écrémé préparé dans du PBS avec 0,2 % v/v Tween 20, puis laver plusieurs fois dans PBS-Tween et incuber avec l’anticorps anti-his HRP dilué 1:500 dans du PBS-Tween pendant 30 à 60 min. Laver abondamment avec PBS-Tween puis PBS, et détecter les anticorps liés à l’aide de la chimiluminescence améliorée (ECL), visualisée sur Hyperfilm MP. Ce transfert de points donne une excellente idée des fractions de pic avant l’analyse SDS-PAGE, et peut informer les étapes de purification ultérieures si nécessaire (par exemple, si la stabilité des protéines est un problème, il est possible de regrouper les fractions de pic sur la base des résultats du transfert de points et de les charger directement sur des colonnes de filtration sur gel - voir l’étape 3.5 ci-dessous).
    2. SDS-PAGE : Collectez 50 μl de chaque fraction de colonne dans un tube microfuge étiqueté contenant 50 μl de colorants de chargement 2x SDS-PAGE (4 % p/v SDS, 20 % v/v glycérol, 120 mM Tris-HCl pH 6,8 avec 200 mM DTT). Faites bouillir ces échantillons pendant 5 minutes à 95-100 °C (notez que si vous utilisez un bloc chaud sans couvercle chauffant, faites un petit trou dans le couvercle de chaque tube avec une aiguille de seringue de calibre étroit pour éviter que les tubes n'explosent lorsqu'ils chauffent). Exécutez 10 % de minigels SDS-PAGE chargeant 10 μl de chaque fraction de colonne et colorez au bleu brillant Coomassie pour vérifier les fractions de pic et le % de pureté de la protéine. Si nécessaire, il est également possible de transférer Western Blot pour la protéine his-marquée en transférant des protéines séparées par SDS-PAGE sur de la nitrocellulose ; bloquez les membranes avec 5 % de lait écrémé dans du PBS-0,2 % Tween 20, puis lavez et sondez avec un anticorps anti-his conjugué HRP (1:500) comme pour le dot blot.
  5. Pour augmenter la pureté, les fractions de pic de la colonne his-trap peuvent être regroupées et chargées sur une colonne de filtration sur gel Superdex 75 avec élution en sel croissant (comme décrit précédemment Boubriak et al.13 et Mason et al. 14).

4. Dosage des nucléases

  1. Réaliser des stocks de travail de substrats.
    1. Utilisez un substrat de 20 pmol par réaction (bien que cela puisse varier en fonction de la question à aborder), de sorte qu’un stock de travail pratique est de 200 pmol/μl (c’est-à-dire 10x). Les stocks de travail sont constitués en petits volumes de tampon de recuit (10 mM Tris-HCl pH7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl) ou en 10 mM Tris-HCl pH 7.0 (jusqu’à pH 8.5, selon nucléase) sans sel ni EDTA, en fonction de la sensibilité enzymatique ou du dosage à effectuer.
    2. Conserver à 4 °C et dans l’obscurité (enveloppé dans du papier d’aluminium). Les substrats durent plusieurs semaines sans perte d’intégrité duplex ou de signal fluorescent.
  2. Dosage de la concentration en protéines d’exonucléase par analyse colorimétrique, ou spectrométrie UV à Abs260.
    1. Conserver dans de petites aliquotes à -80 °C.
    2. Si les échantillons sont congelés/décongelés une fois, supposer un taux de mauvais repliement des protéines de 5 % (ou définir empiriquement pour chaque protéine à doser) et ajuster les concentrations en conséquence.
    3. Éliminer les protéines pour l’analyse de l’activité des exonucléases après deux cycles de congélation/décongélation, et noter l’état de la protéine pour chaque expérience.
  3. Concevoir, expérimenter et calculer les quantités de master mix (MM) pour les échantillons.
    1. Faites un MM contenant tous les composants communs aux échantillons testés (généralement tout sauf l’enzyme ou le substrat) pour réduire la variation entre les échantillons.
    2. Tenir compte de l’erreur de pipetage lors de la préparation du MM, par exemple calculer les volumes pour N échantillons en faisant suffisamment pour les échantillons (N + 0,1N).
    3. Mettre en place des réactions dans un volume total de 20 μl/échantillon, contenant 1 pmol d’enzyme et 20 pmol de substrat (par défaut avant l’optimisation - évidemment, les quantités varient en fonction de ce qui est testé, par exemple modifier la quantité d’enzyme si l’effet de la concentration enzymatique est testé). Pour le DmWRNexo, le tampon optimal pour l’activité des nucléases s’est avéré empiriquement contenir 40 mM de Tris-HCl pH 8,0, 4 mM de MgCl2, 5 mM de dithiothréitol, avec 0,1 mg/ml de BSA de biologie moléculaire.
  4. Configurez des réactions.
    1. Conservez tous les réactifs à 4 °C (seau à glace ou grille cryogénique).
    2. Mélangez et aliquote dans le nombre approprié de tubes microfuges stériles de 0,5 ml sans DNase. Inclure un contrôle sans enzyme pour visualiser le substrat initial (contrôle non dégradé).
    3. Régler un bloc chauffant à la température appropriée pour l’activité enzymatique (37 °C, avec un point temporel final de 30 min était optimal pour DmWRNexo, bien qu’il puisse être nécessaire de le déterminer empiriquement en comparant l’activité de l’enzyme choisie à une gamme de températures et de temps). Les inhibiteurs enzymatiques potentiels couramment présents dans les tampons doivent être soigneusement testés (par exemple, l’EDTA inhibe le DmWRNexo, tout comme l’excès d’ATP14, probablement par chélation du Mg2+ essentiel à l’activité des nucléases). Notez que même des concentrations élevées d’imidazole (>300 mM) n’ont aucun impact sur l’activité de l’enzyme DmWRNexo ni n’éteignent la fluorescence.
    4. Solution d’appoint STOP (80 % Formamide, 1x TBE). C’est à 3x. Celui-ci peut contenir des colorants tels que le bleu de bromophénol si nécessaire. Magasin chez RT.
    5. Installez les éléments suivants près du bloc thermique : le(s) réactif(s) final(s) à ajouter au mélange réactionnel (généralement une enzyme), une pipette et des pointes de 1 à 10 μl, une minuterie, un cryorack ou un seau à glace, et la solution STOP.
  5. Lancez la réaction.
    1. Réglez la minuterie sur l’ajout de l’enzyme dans le premier tube. Placez le tube dans le bloc chauffant.
    2. Continuez à ajouter de l’enzyme au reste des tubes à des intervalles appropriés. (15 secondes suffisent pour les réactions simples qui ne nécessitent que la solution STOP). Placer dans le bloc de chaleur dès que l’enzyme a été ajoutée.
  6. Arrêtez la réaction.
    1. Lorsque la minuterie atteint le temps correct (par exemple 15 min), ajoutez 10 μl de solution STOP au premier échantillon et mélangez par pipetage. Placer immédiatement sur de la glace/dans le cryorack.
    2. Continuez à arrêter les réactions aux intervalles de temps appropriés et dans le même ordre qu’elles ont été mises en place afin que chaque réaction ait eu exactement le même temps d’incubation.
  7. Les échantillons sont maintenant prêts à être chargés sur le gel dénaturant préparé.
    1. Chargez la moitié (ou la totalité) de chaque échantillon à l’aide d’embouts de chargement de gel pour un pipetage précis. Aux niveaux d’oligonucléotides utilisés dans la réaction, la moitié de la réaction donnera un bon rendement pour la visualisation et permettra de répéter l’opération (par exemple, si le gel initial ne fonctionne pas correctement).
    2. Il est pratique de charger 1 solution STOP contenant un colorant (par exemple du bleu de bromophénol) dans une ou plusieurs voies pour déterminer comment le gel fonctionne.
    3. Des oligonucléotides fluorescents de tailles connues peuvent être analysés à côté des échantillons comme marqueur de taille.
  8. Faites couler le gel.
    1. Ajoutez la chambre tampon supérieure à l’appareil à gel et remplissez-la de tampon courant (1x TBE), en vous assurant que les échantillons ne sont pas perturbés. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite de tampon.
    2. Connectez le gel rig à une alimentation électrique et faites-le fonctionner à 200 V (tension constante) pendant 150 à 200 minutes ou jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol (le cas échéant) soit à environ les deux tiers de la longueur du gel (il tourne autour du niveau d’ADN de 10nt dans ce pourcentage de gel). Surveillez les fuites de tampon, qui peuvent fausser ou empêcher la séparation.
    3. Arrêtez le gel et retirez-le de l’appareil en marche.

5. Analyse et imagerie sur gel

  1. Déterminez la sensibilité de l’imageur à utiliser, par exemple le Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager peut détecter la fluorescence de la fluorescéine à l’aide d’un laser bleu de 473 nm, en utilisant son réglage de sensibilité maximal de F1000 et le plus petit pixel lu (résolution) de 50 μm.
  2. Scannez le gel.
    1. Retirez soigneusement les entretoises et une plaque de gel. Rincez abondamment (mais soigneusement) le gel restant sur l’autre plaque de gel pour éliminer les traces d’urée précipitée qui interféreraient autrement avec le balayage.
    2. Placez la plaque (avec le gel toujours attaché) sur la face en verre du porte-gel et placez-la dans l’imageur. Notez les coordonnées du gel sur le verre (s’il ne remplit pas toute la surface).
    3. Ouvrez le logiciel approprié sur l’ordinateur connecté et scannez la zone indiquée de la zone de balayage où se trouve le gel. Utilisez les meilleures conditions déterminées à l’étape 5.1. Le fichier résultant sera relativement volumineux (plusieurs Mo) mais l’image peut être recadrée et compressée si nécessaire.
    4. Enregistrez, puis exportez sous forme de fichier pouvant être lu par un logiciel d’analyse, par exemple exportez en tant que .tiff pour l’analyse à l’aide d’ImageJ.
  3. Analysez les données.
    1. Un test d’exonucléase réussi provoquera une dégradation du substrat séquentiellement le long de l’oligonucléotide vers le fluorophore, ce qui entraînera un motif caractéristique en forme d’échelle de fragments d’ADN fluorescent sur le gel. Les espèces ayant une mobilité plus élevée sur le gel (qui courent plus loin) sont plus petites que le substrat de départ non dégradé et représentent donc des produits de dégradation des exonucléases.
    2. Utilisez l'outil 'Gels' d'ImageJ pour quantifier les intensités relatives des espèces dans chaque voie en fonction de leur mobilité, afin de déterminer les niveaux de dégradation et donc l'activité d'exonucléase dans chaque échantillon.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L'analyse in vitro de l'activité exonucléase nécessite plusieurs étapes préparatoires en plus de l'analyse proprement dite. Un aperçu des procédures est présenté dans la Figure 1.

Avant de réaliser des dosages d'exonucléase basés sur la fluorescence, il est essentiel d'optimiser la détection de l'oligonucléotide marqué par fluorescence après séparation sur gel d'acrylamide-urée, à l'aide d'un système d'imagerie fluorescent approprié. Le choix du filtre est particulièr...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La détermination de l’activité exonucléase des protéines purifiées nécessite l’analyse des produits de clivage de l’ADN. Le clivage séquentiel de l’ADN par les exonucléases peut être visualisé par séparation des produits de clivage marqués sur des gels d’acrylamide. Historiquement, cela impliquait le marquage final du substrat d’ADN avec un radiomarqueur (par exemple 32P ou 35S), mais avec les inconvénients inhérents à l’utilisation du radiomarqueur (coût, problèmes de sécurité et instabili...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le programme inter-conseils New Dynamics of Ageing pour le financement de ce travail [ES/G037086/1] et le professeur Dave Sherratt (Département de biochimie, Université d’Oxford) pour l’accès au Fuji FLA-3000.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif/Matériel
Oligonucléotides personnalisésEurogentecIl est nécessaire d’obtenir ces derniers à haute pureté par exemple avec purification PAGE.
5'FLOfluorescéine-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTCTGA
CTACGTACAAGTCACC - 3'
bulle5'- GGTGACTTGTACGT
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
 % 19:1 Solution d’acrylamideSevern Biotech20-2400-05ATTENTION : neurotoxine puissante, il faut donc porter des gants en tout temps
Colonnes His-Trap (1 ml)GE Healthcare17-5247-01
Tous les autres réactifsde tout fournisseurUne qualité de biologie moléculaire est nécessaire (sans DNase) ; de même, les tubes à microfuge doivent être exempts de DNase et de RNase
EquipmentHoefer SE400 appareil de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (phosphore et fluorescence
imageur)Fuji
Image Reader V2.02Jauge
V3.3FujiFilm
réputé d’image FujiFilm

Références

  1. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
  2. Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome). Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).
  3. Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science. 272, 258-262 (1996).
  4. Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease. Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).
  5. Goto, M. Syndrome-causing mutations in Werner syndrome. Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).
  6. Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).
  7. Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).
  8. Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).
  9. Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).
  10. Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity. Aging Cell. 7, 418-425 (2008).
  11. Cox, L. S., Boubriak, I. DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging. Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).
  12. Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).
  13. Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease. Biogerontology. 10, 267-277 (2009).
  14. Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordr). , (2012).
  15. Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains. BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).
  16. Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry. Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).
  17. Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities. Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).
  18. Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA. Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Caract risation de DmWRNexoactivit exonucl asique de WRNsubstrat d ADN fluorescentgel d acrylamide ur eimagerie de fluorescenceanalyse de la polarit de la nucl ased termination de la processivittest de pr f rence du substratquantification de l activit nucl asique
Un Exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser DmWRNexo, orthologue humain progéroïde WRN Exonuclease, et son application à d'autres nucléases
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.