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Article de méthode

Cultures neuronales stratifiées selon le sexe pour étudier les voies de mort des cellules ischémiques

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DOI :

10.3791/50758

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9 décembre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado School of Medicine, 2Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University, 3Department of Pharmacology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les cultures neuronales embryonnaires primaires dissociées de l’hippocampe sont utiles pour étudier les mécanismes de signalisation impliqués dans la mort des neurones. Le sexage des embryons avant l’isolement et la dissociation de l’hippocampe permet de préparer des cultures masculines et féminines distinctes, ce qui permet au chercheur d’identifier et d’étudier la signalisation cellulaire spécifique au sexe.

Résumé

Des différences entre les sexes en matière de susceptibilité neuronale aux lésions ischémiques et aux maladies neurodégénératives ont longtemps été observées, mais les mécanismes de signalisation responsables de ces différences restent incertains. La culture neuronale embryonnaire primaire dissociée fournit un modèle expérimental simplifié permettant d’étudier la signalisation cellulaire neuronale impliquée dans la mort cellulaire à la suite d’une ischémie ou d’une maladie ; Cependant, la plupart des cultures neuronales utilisées aujourd’hui dans la recherche sont mixtes. Les chercheurs peuvent tester et testent les effets du traitement aux stéroïdes sexuels dans des cultures neuronales mixtes dans des modèles de lésions et de maladies neuronales, mais de plus en plus de preuves suggèrent que le cerveau féminin réagit aux androgènes, aux œstrogènes et à la progestérone différemment du cerveau masculin. De plus, les rongeurs mâles et femelles nouveau-nés réagissent différemment aux lésions ischémiques, les mâles subissant des lésions plus importantes à la suite d’une ischémie cérébrale que les femelles. Ainsi, les cultures neuronales mixtes pourraient obscurcir et confondre les résultats expérimentaux ; Des informations importantes peuvent être manquées. Pour cette raison, le laboratoire Herson de la faculté de médecine de l’Université du Colorado prépare régulièrement des cultures neuronales embryonnaires primaires dissociées stratifiées selon le sexe à partir de l’hippocampe et du cortex. Les embryons sont sexés avant le prélèvement du tissu cérébral et les tissus mâles et femelles sont dissociés, plaqués séparément et conservés séparément. À l’aide de cette méthode, le laboratoire Herson a démontré un rôle spécifique chez l’homme pour le canal ionique TRPM2 dans la mort cellulaire ischémique. Dans ce manuscrit, nous partageons et discutons de notre protocole de sexage des souris embryonnaires et de préparation de cultures de neurones primaires dissociés de l’hippocampe stratifiés selon le sexe. Cette méthode peut être adaptée pour préparer des cultures corticales stratifiées selon le sexe, et la méthode de sexage de l’embryon peut être utilisée conjointement avec d’autres protocoles pour toute étude dans laquelle le sexe est considéré comme un déterminant important du résultat.

Introduction

Les mammifères sont sexuellement dimorphes, les mâles et les femelles présentant des traits et des caractéristiques différents. Les différences entre les sexes s’étendent même au cerveau et sont évidentes dans la susceptibilité neuronale aux blessures et aux maladies (examiné dans1-5). Par exemple, le cerveau masculin est plus sensible aux lésions neuronales ischémiques causées par un accident vasculaire cérébral ou un arrêt cardiaque, suivi d’une réanimation (examiné dans6). La maladie de Parkinson (examinée dans7) et la schizophrénie (revue dans8) sont plus fréquentes chez les hommes que chez les femmes, tandis que le cerveau humain féminin semble plus sensible à la maladie d'Alzheimer (examinée dans9) et aux troubles de l'humeur tels que la dépression (revue dans10). Malgré des différences observables entre les sexes en ce qui concerne la susceptibilité aux lésions et aux maladies neuronales, la plupart des paradigmes de traitement actuels ne tiennent pas compte du sexe et sont similaires chez les hommes et les femmes. On pourrait obtenir un plus grand succès si les différences entre les sexes étaient prises en compte et comprises.

Les modèles animaux in vivo de lésions et de maladies neuronales présentent un dimorphisme sexuel similaire à celui des humains et sont essentiels pour améliorer notre compréhension des différences entre les sexes et de la manière dont ces différences contribuent à la survie et au fonctionnement neuronaux. Des preuves ont démontré, par exemple, que les rongeurs mâles sont plus sensibles que les femelles aux lésions neuronales ischémiques11-15. On pense que cette différence dépend au moins partiellement de la signalisation moléculaire de la testostérone, la principale hormone stéroïde sexuelle masculine, et de l’œstrogène, la principale hormone stéroïde sexuelle féminine. Des études avec des rongeurs mâles et femelles gonectomisés révèlent que la testostérone et le métabolite de la testostérone, la dihydrotestostérone (DHT) exacerbent et que l’œstrogène diminue les lésions neuronales après une ischémie cérébrale12-14,16-18. Cependant, des différences entre les sexes dans l’ischémie cérébrale sont présentes chez les animaux nouveau-nés et adultes19,20. Les nouveau-nés connaissent des poussées d’œstrogène ou de testostérone in utero au cours du développement, mais ont des niveaux d’hormones relativement faibles après la naissance jusqu’à la puberté (examiné dans21). Ainsi, la présence ou l’absence d’hormone sexuelle primaire n’est pas le seul déterminant de la susceptibilité neuronale aux lésions influencée par le sexe. En effet, il est probable que des dimorphismes sexuels s’établissent au cours du développement, ce qui entraîne des différences dans la signalisation cellulaire et la réponse à l’ischémie, même lorsque les niveaux d’hormones sont faibles.

Que les différences entre les sexes dépendent de la présence d’hormones stéroïdes sexuelles ou qu’elles soient dues à des dimorphismes établis au cours du développement, il devient clair avec des études plus approfondies qu’il existe des différences dans la signalisation cellulaire entre les mâles et les femelles dans le cerveau. Dans le laboratoire Herson de la faculté de médecine de l’Université du Colorado, nous avons identifié une telle différence. Nous avons constaté que le canal ionique perméable au calcium, au sodium et au potassium, TRPM2 (examiné dans22,23), induit la mort des cellules neuronales à la suite d’une agression ischémique in vivo chez la souris mâle mais pas chez la souris femelle24. Nous démontrons que l’inhibition pharmacologique ou l’inhibition génétique de TRPM2 est protectrice chez la souris mâle mais pas chez la souris femelle dans notre modèle in vivo d’occlusion artérielle carotide moyenne (MCAO) de l’AVC24.

Malgré leur utilité, les modèles animaux in vivo de lésions neuronales ischémiques peuvent parfois être limités pour les études moléculaires de la mort neuronale, en raison de la difficulté ou de l’incapacité à cibler spécifiquement les neurones à étudier. Pour cette raison, notre laboratoire utilise in vitro des neurones primaires corticaux ou hippocampiques dissociés pour compléter nos travaux in vivo. Les cultures de neurones primaires dissociés constituent un outil utile pour étudier les voies de signalisation cellulaire impliquées dans les lésions et les maladies neuronales. Les neurones en culture peuvent être maintenus dans un environnement étroitement contrôlé, avec ou sans apport glial. En l’absence de glie, toutes les réponses observées en culture sont neuronales. Les agents pharmacologiques peuvent être administrés en culture sans se soucier de l’absorption à travers la barrière hémato-encéphalique, ce qui permet l’inhibition ou l’activation de composants spécifiques d’une voie de transduction de signal donnée. La biologie moléculaire peut être utilisée pour surexprimer ou neutraliser diverses protéines d’intérêt, et des mesures électrophysiologiques peuvent être effectuées sur des cellules individuelles, ce qui ne serait pas possible dans un système modèle in vivo.

Le laboratoire Herson élargit l’utilité des cultures neuronales primaires dissociées en sexant d’abord les embryons utilisés pour préparer les cultures. Les cultures de neurones mâles et femelles stratifiées en fonction du sexe montrent clairement que les neurones mâles sont plus sensibles que les neurones femelles à la mort des cellules neuronales suite à une privation d’oxygène et de glucose25. La privation d’oxygène et de glucose est un modèle in vitro accepté de l’ischémie neuronale, car l’ischémie réduit la disponibilité de l’oxygène et du glucose dans le cerveau. De plus, nous avons démontré par des expériences électrophysiologiques dans des neurones dissociés et stratifiés en fonction sexuelle que TRPM2 est activé dans les neurones mâles mais pas dans les neurones femelles24,26. Nous étudions actuellement les régulateurs moléculaires spécifiques au sexe de l’activité24,26 de TRPM2. Ici, nous partageons et discutons de notre protocole pour établir des cultures de neurones embryonnaires primaires dissociés de l’hippocampe stratifiés selon le sexe et présentons des données représentatives utilisant cette méthode qui suggèrent que l’enzyme de réparation de l’ADN, PARP-1, contribue à la mort cellulaire ischémique d’une manière spécifique au sexe similaire à TRPM2. PARP-1 est activé par la rupture de l’ADN due au stress oxydatif (examiné dans27,28). Lorsque les dommages à l’ADN sont minimes, l’activité de PARP-1 améliore la survie cellulaire, mais lorsque les dommages sont excessifs, l’activité accrue de PARP-1 exacerbe la mort cellulaire. PARP-1 produit du poly-(ADP)ribose, un activateur connu du canal TRPM228-31, et certaines preuves suggèrent que PARP-1 est activé préférentiellement dans le cerveau masculin mais pas féminin en réponse au stress oxydatif32,33. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que PARP-1 active TRPM2 chez le mâle mais pas chez la femelle, induisant la mort des cellules neuronales en réponse à la privation d’oxygène et de glucose.

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Protocole

Toutes les procédures de ce protocole ont été menées conformément aux directives de l’Institut national de la santé pour le traitement et les soins éthiques des animaux, et conformément à un protocole d’utilisation des animaux approuvé par l’IACUC.

1. Préparation des boîtes de culture tissulaire, des milieux de culture et des instruments de dissection à effectuer au moins un jour avant la dissection

  1. Préparez 1 L de tampon de borate : 3,1 g/L d’acide borique et 4,75 g/L de borax dans du H2O. Ajustez le pH à 8,4. Filtrer-stériliser et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Diluer la poly-D-lysine à 0,1 mg/ml.
    1. Sous un capot de culture tissulaire à flux laminaire, placez suffisamment de poly-D-lysine diluée pour couvrir généreusement le fond de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire stérile à plusieurs puits, traitée par culture. (Si vous le souhaitez, des lamelles de verre prénettoyées, stériles peuvent être ajoutées au fond de chaque puits avant l’ajout de poly-D-lysine. Les lamelles peuvent flotter après l’ajout de poly-D-lysine, elles doivent donc être poussées vers le bas avec une pince stérile si nécessaire.)
    2. Incuber les plaques pendant la nuit dans l’incubateur à 37 °C.
  3. Préparez 1 L de tampon de dissection : 350 mg/L de NaHCO3, 2,38 g/L de HEPES, 1,44 g/L de MgSO4 et 300 mg/L de BSA dans 1 solution saline équilibrée Hanks sans Ca, Mg, pyruvate de sodium ou rouge de phénol. Ajustez le pH à 7,3. Filtrez-stériliser et conservez à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
  4. Préparez un milieu de placage de 500 ml : 10 % de sérum de veau fœtal, 100 unités/ml de pénicilline et de streptomycine, et 2,5 mM de glutamine dans du MEM sans rouge de phénol. Filtrer-stériliser. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Jetez tout support non utilisé après 1 mois.
  5. Préparez un milieu d’alimentation de 500 ml : un supplément de B-27 à 2 %, 100 unités/ml de pénicilline et de streptomycine, et 2,0 mM de GlutaMAX (pas de glutamine) dans Neurobasal sans rouge de phénol. Filtrer-stériliser. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Jetez tout milieu d’alimentation restant après 1 mois.
  6. Préparez 10 ml de 100 mM de CaCl2, 500 mM d’EDTA et 1 M de NaOH selon les méthodes standard selon les méthodes standard.
  7. Autoclavez les instruments chirurgicaux/de dissection et stockez-les dans des conditions stériles jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Cette procédure nécessite deux pinces à pointe extra-fine et pointues, une pince incurvée à pointe fine, une pince incurvée dentelée, une petite pince à dents de rat, une paire de ciseaux microchirurgicaux, une paire de ciseaux chirurgicaux fins et étroits, une paire de ciseaux à pointe moyenne et une sonde de dissection à extrémité émoussée. Des instruments stériles supplémentaires peuvent être ajoutés selon les préférences personnelles.

2. Préparation des boîtes de culture tissulaire, des milieux de culture, des instruments de dissection et de la zone de dissection à effectuer le jour de la dissection

  1. Lavez les plaques de culture tissulaire enrobées de poly-D-lysine. Sous l’enceinte de biosécurité à flux laminaire, aspirez la poly-D-lysine à l’aide d’une conduite à vide ou d’une pipette, ajoutez de l’eau dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant ~5 min. Aspirez l’eau et remplacez-la par de l’eau propre et stérile. Répétez l’opération 3 fois.
    1. Laissez les plaques sécher complètement à température ambiante.
  2. Préparez la zone de dissection en essuyant le compteur et l’endoscope de dissection avec de l’éthanol à 70 %.
    1. Saturez un grand Kimwipe avec de l’éthanol à 70 % et disposez les outils de dissection autoclave. Couvrir avec un autre Kimwipe.
    2. Remplissez un grand plat plat de glaçons. Étiqueter et remplir un nombre approprié de boîtes de culture de 60 mm avec une solution de dissection à froid. Préparez suffisamment de plats pour garder les têtes, le cerveau et l’hippocampe masculins et féminins séparés (le cas échéant).
    3. Remplissez deux boîtes de culture plus grandes de 100 mm avec un tampon de dissection à froid.
    4. Réservez un plat séparé de 100 mm sans tampon (sec).
    5. Établir une zone pour les déchets à risque biologique et une autre pour les tissus animaux (à éliminer de manière appropriée après la dissection, conformément aux normes institutionnelles).
  3. Milieu de placage chaud de 30 ml dans un bain-marie à 37 °C. Cette solution chaude sera utilisée dans la phase de dissociation cellulaire du protocole.
  4. Placez 1 ml de milieu de placage dans chaque puits de plaque de culture tissulaire à 24 puits, recouverte de poly-D-lysine. Utilisez un volume plus petit approprié si des plaques plus petites sont utilisées. Placez la plaque couverte dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 pour la réchauffer et l’équilibrer avec le CO2 pendant la dissection.
  5. Préparez la solution de papaïne.
    1. Étiquetez deux tubes coniques stériles de 15 ml, l’un comme « mâle » et l’autre comme « femelle ».
    2. Ajouter dans chaque tube les éléments suivants : 10 ml de tampon de dissection, 150 μl 100 mM CaCl2, 10 μl 500 mM EDTA, 10 μl 1 M NaOH et 150 U de papaïne.
    3. Mélangez délicatement en retournant le tube trois fois, puis réchauffez-le au bain-marie à 37 °C. Remarque : Chaque flacon de papaïne aura une unité d’activité différente par mg de papaïne, donc le volume de papaïne ajouté à la solution différera d’un flacon à l’autre. La papaïne sera trouble au début, mais la solution s’éclaircira lorsque la papaïne se dissoudra complètement.

3. Récolte, sexage et dissection d’embryons E18

  1. Anesthésez la souris femelle enceinte avec de l’isoflurane ou un autre anesthésique approprié. Euthanasier la souris sous anesthésie profonde par décapitation ou luxation cervicale.
  2. En travaillant rapidement, nettoyez l'abdomen de la femelle avec de l'éthanol à 70 %. Si vous le souhaitez, l’abdomen peut être rasé avant d’être pulvérisé avec de l’éthanol pour réduire les risques de contamination. Soulevez la peau abdominale à l’aide de la pince à dents de rat. Faites une grande incision dans l’abdomen avec les ciseaux à pointe moyenne, en coupant la peau et les muscles abdominaux, exposant les organes internes.
  3. Retirez soigneusement les embryons, en soulevant chaque corne utérine entière de l’abdomen, en faisant attention de ne pas la laisser entrer en contact avec des tissus externes si possible (pour éviter la contamination). Placez les cornes utérines contenant les embryons dans un plat avec une solution saline de dissection froide et transférez-les dans de la glace.
  4. Retirez soigneusement chaque chiot des cornes utérines et du sac embryonnaire. Les chiots sont fragiles, il est donc préférable de couper le tissu utérin entre chaque embryon pour exposer le sac embryonnaire, puis de trancher soigneusement le sac à la surface avec le bord des petits ciseaux étroits. Le liquide embryonnaire et le petit peuvent ensuite être doucement poussés à travers l’ouverture sans endommager l’embryon.
    1. Si l’incision dans le sac embryonnaire n’est pas assez grande pour que le liquide et le chiot sortent facilement, élargissez soigneusement l’incision jusqu’à ce que le chiot glisse avec une force minimale.
    2. Ne pressez pas le sac trop fort pour forcer l’embryon à sortir, car cela pourrait également endommager les embryons.
  5. Retirez la tête d’un seul embryon. Laissez la tête dans un plat de dissection saline sur de la glace. Placez le corps de l’embryon sur le dos sur la boîte sèche de 100 mM sous le scope de dissection. À l’aide de la pince incurvée à pointe moyenne dans une main et de la pince incurvée dentelée dans l’autre, aplatissez doucement le chiot, en poussant les pattes arrière vers le bas et ventrales, les pattes avant vers le bas et dorsalement.
  6. Retirez la queue avec des ciseaux si nécessaire ; la queue a tendance à s’enrouler sur l’abdomen et peut gêner la dissection.
  7. Relâchez les pattes arrière et pincez l’abdomen à la racine du cordon ombilical, appelée ombilic. Soulevez doucement. Relâchez les pattes avant et avec l’autre main et les micro-ciseaux, faites un petit « v » inversé dans l’abdomen juste au-dessus de l’ombilic avec la pointe du « v » pointant vers le crânien.
  8. Remplacez les ciseaux par la pince incurvée. Retournez la pince de manière à ce que la pointe soit vers le haut et loin de l’animal. Avec une force douce, appuyez vers le bas et dorsale sur la cage thoracique avec le bord fermé et arrondi de la pince incurvée, tout en tirant vers le bas et ventralement avec l’autre pince, en écartant le chiot ventralement à dorsal. Ce mouvement d’étalement ouvrira la cavité abdominale, exposant les intestins, le foie et d’autres organes internes.
  9. À l’aide de la pince incurvée, poussez très doucement les intestins et le foie vers le crâne en effectuant des mouvements de balayage répétés. Cela exposera progressivement les reins, la vessie et, surtout, les organes sexuels internes.
    1. Les petits mâles sont identifiés par la présence de testicules striés situés juste en dessous des reins de chaque côté. Les testicules font environ 1/3-1/2 de la taille des reins et auront parfois baissé pour se trouver juste au-dessus de la vessie.
    2. Les femmes sont plus facilement identifiées par l’absence de testicules, mais peuvent également être identifiées par le petit utérus qui se trouve au-dessus de la vessie et les trompes de Fallope qui s’étendent vers les reins. Sous une puissance élevée sur l’endoscope de dissection, les ovaires peuvent également être identifiés comme de petits organes sombres à l’extrémité des trompes de Fallope immédiatement en dessous et parfois sous les reins bilatéralement.
  10. Une fois le sexe déterminé, jetez le corps et placez la tête dans un plat étiqueté de manière appropriée (mâle ou femelle). Gardez les têtes sur de la glace dans la solution de dissection.
  11. Répétez les étapes 3.5 à 3.10 jusqu’à ce que chaque petit ait été sexé. Pour de meilleurs résultats, essuyez le plat avec un Kimwipe entre chaque dissection ; Le liquide rend les petits glissants et difficiles à saisir pour la dissection.
  12. Une fois que tous les embryons ont été sexés et que les têtes mâles et femelles ont été séparées, procédez au reste de la dissection en prenant un soin particulier à garder tous les tissus dérivés mâles et femelles séparés.
  13. Transférez un cerveau à la fois dans une parabole de 100 mM remplie d’un tampon de dissection à froid. Sous la portée de dissection, utilisez la pince incurvée pour percer les yeux de l’embryon afin de l’ancrer pour la dissection. À l’aide des ciseaux microchirurgicaux, faites une incision médiane peu profonde, en divisant la peau et le crâne le long de la ligne médiane, de la base du crâne au sommet de la tête juste au-dessus du passage nasal.
  14. Écartez doucement la peau et le crâne de manière bilatérale et extrayez très doucement le cerveau en le ramassant soigneusement du cerveau antérieur vers le tronc cérébral avec la base des ciseaux microchirurgicaux ou avec une pince fermée et inclinée.
    1. Utilisez soigneusement la pince pour transférer le cerveau extrait dans une boîte propre et étiquetée remplie d’un tampon de dissection à froid. Gardez le plat sur de la glace.
    2. Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les cerveaux aient été récoltés.
    3. Cette étape devrait permettre d’obtenir deux plaques de cerveaux entiers dans un tampon de dissection, l’une pour les tissus masculins et l’autre pour les tissus féminins.
  15. Placez un plat propre sous l’endoscope de dissection et remplissez-le d’un tampon de dissection. Versez juste assez de solution pour garder le cerveau humide tout au long de la dissection de l’hippocampe ; Trop fera flotter le cerveau et rendra la manipulation difficile. Si vous le souhaitez, pré-enduire le plat de dissection de cire stérile. La cire fournit une surface antidérapante sur laquelle travailler et protège les pointes des instruments de dissection délicats ; Rayer le fond d’un plat non revêtu peut plier ou émousser les arêtes vives des outils.
  16. Réglez la portée de dissection sur un réglage de puissance élevée et ajustez la mise au point en conséquence. Transférez soigneusement un cerveau à la fois dans une boîte de dissection. À l’aide de la pince à pointe extra-fine, séparez chaque hémisphère cérébral et pincez-les du tronc cérébral.
  17. Très soigneusement, retirez les méninges de chaque hémisphère. (Les méninges sont une membrane rosâtre, riche en vaisseaux sanguins, et sont une source fréquente de contamination gliale dans une culture de neurones.)
    1. Pour enlever les méninges, pincez, soulevez et tirez délicatement sur la membrane, en faisant attention de ne pas percer le tissu cérébral en dessous.
    2. Retirez les méninges du cerveau, en permettant au cerveau de rouler un peu sous la pince, mais en le maintenant en place pour que la membrane puisse être retirée.
  18. À ce stade, vous pouvez disséquer davantage le cerveau pour utiliser le tissu de votre choix. Par exemple, disséquez l’hippocampe de chaque hémisphère. Placez un hémisphère avec le côté latéral vers le bas. Observez la grande cavité ventricale, qui crée un rabat recouvrant l’hippocampe. Ramenez doucement ce rabat jusqu’à ce que l’hippocampe en forme de croissant puisse être observé. L’hippocampe est légèrement surélevé et se trouve entre le mésencéphale et le cortex.
  19. À l’aide de deux paires de pinces pointues et extra-fines, tenez l’hémisphère cérébral ouvert d’une main et coupez l’hippocampe loin du cortex et du cerveau moyen de l’autre.
    1. Placez l’hippocampe dans une coupelle correctement étiquetée (mâle ou femelle) remplie d’un tampon de dissection et conservée sur de la glace.
    2. Disséquez l’hippocampe de l’hémisphère restant et répétez ce processus avec chaque cerveau.
  20. Transférez l’hippocampe dans des tubes coniques de 15 ml étiquetés de manière appropriée.
    1. Laver délicatement deux fois avec un tampon de dissection à froid. Utilisez l’aspiration sous vide avec beaucoup de précaution à ce stade. L’hippocampe est petit et peut être irrémédiablement perdu dans le vide. Pour éviter cela, laissez le tissu se déposer au fond du tube, retirez autant de liquide que possible du tube à l’aide d’une pipette, jetez la solution et remplacez-la par un tampon de dissection frais et propre.
    2. Répétez l’étape 3.20.1.

4. Dissociation neuronale

  1. Transférez l’hippocampe dans une solution de papaïne préchauffée et correctement étiquetée. Placer dans un bain-marie à 37 °C et incuber pendant 8 à 10 min, en inversant doucement les tubes pour mélanger toutes les 2 à 3 min.
  2. Retirez le mélange de papaïne et le mouchoir du bain-marie. Laissez le tissu se déposer, puis retirez soigneusement la plus grande partie possible de la solution de papaïne à l’aide d’une pipette, en laissant le tissu au fond du tube. Lavez le mouchoir 3 fois avec un support de placage. Le sérum dans le milieu de placage éteint la digestion enzymatique de la papaïne. Un inhibiteur de la trypsine est nécessaire si le sérum n’est pas utilisé dans le milieu de placage.
  3. Retirez le support de placage.
    1. Ajouter 2 ml de milieu neurobasal frais et dissocier doucement les tissus à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml réglée sur la vitesse la plus lente.
    2. La dissociation s’effectue en pipetant doucement de haut en bas 8x. Attention à ne pas introduire de bulles dans la solution. Pour de meilleurs résultats, prélevez la solution et le tissu dans la pipette, puis libérez la solution sur le côté du tube conique, permettant au tissu de glisser sur le côté et de revenir au fond du tube.
  4. Après la 8ème trituration, laissez le tissu se déposer et recueillir le milieu trouble sur le dessus. Ce média contient des cellules dissociées.
    1. Transférez-le dans un nouveau tube étiqueté.
    2. Ajouter 2 ml supplémentaires au tissu non dissocié.
    3. Triturer à nouveau 8 fois.
    4. Récoltez le milieu trouble.
    5. Répétez ce processus 3 à 5 fois. Il restera des tissus non dissociés. Bien qu’il soit possible de triturer jusqu’à ce que tous les tissus soient dissociés, une trituration excessive entraîne une mauvaise santé neuronale et n’est pas recommandée.
  5. Ajoutez du milieu supplémentaire aux tubes coniques si nécessaire pour égaliser les volumes et les poids entre les tissus mâles et femelles. Centrifuger les cellules dans une centrifugeuse à godets rotatifs à 228 x g pendant 5 min. Retirez délicatement le surnageant.
  6. Remettez doucement les cellules en suspension dans un milieu de placage frais de 2 ml et filtrez la solution à travers une crépine à cellules maillées dans un tube conique propre et étiqueté de 50 ml.
  7. Ajouter une suspension cellulaire de 50 μl à 450 μl de bleu trypan à 0,4 %. Incuber les cellules pendant 2 min dans Trypan Blue, mélanger doucement et charger 10 μl sur un hémocytomètre. Comptez les cellules à l’exclusion de celles qui ont absorbé le colorant Trypan Blue ; Les cellules bleu foncé sont mortes ou en voie de disparition.

5. Entretien de l’ensemencement et de l’élevage

  1. Calculez le volume correct de suspension cellulaire à ajouter à chaque puits de la plaque de culture tissulaire pour obtenir la densité cellulaire souhaitée. Les cultures de neurones sont très sensibles à la densité cellulaire et fonctionnent mieux à une densité moyenne à élevée, à moins d’être co-cultivées avec des cellules gliales ou nourries avec des milieux conditionnés gliaux. Dans ce protocole, les cellules sont plaquées à 150 000-200 000 cellules/cm2.
  2. Retirez la plaque de culture tissulaire préremplie de milieu de placage de l’incubateur (préparée à l’étape 2 ci-dessus).
    1. Faites tourner doucement la suspension cellulaire dans le tube conique de 50 ml, puis pipetez le volume souhaité de suspension cellulaire (calculé ci-dessus à l’étape 5.1) au centre de chaque puits.
    2. Répétez l’opération, en faisant tourner la suspension cellulaire à chaque fois avant le pipetage pour assurer une densité cellulaire égale dans chaque puits. Les cellules se stabilisent rapidement et la densité cellulaire peut changer de puits à puits si l’étape de tourbillon est sautée.
  3. Une fois les cellules ajoutées à chaque puits, faites tourner doucement la plaque pour disperser les cellules, puis replacez immédiatement la parabole dans l’incubateur. Laissez les cellules intactes pendant au moins 24 heures.
  4. Au moins 24 heures après le placage des cellules, réchauffez le milieu d’alimentation neurobasal complet à 37 °C. Aspirez le milieu de placage de chaque puits et remplacez-le par un milieu d’alimentation. Aspirez et remplacez un puits à la fois pour minimiser le stress neuronal et améliorer la survie cellulaire.
  5. Les cultures de neurones doivent être nourries tous les 4 à 7 jours en retirant soigneusement la moitié du milieu et en ajoutant un volume égal de milieu frais. Dans ces conditions, les cultures peuvent être conservées pendant deux semaines. Avec les cultures neuronales primaires, une certaine mort cellulaire est attendue. Ainsi, à mesure que les cultures mûrissent, la densité diminuera. Dans ce protocole, la densité cellulaire diminue d’environ 30 % au jour 10 in vitro.

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Résultats

Le sexage correct des souriceaux embryonnaires est une étape cruciale dans la préparation de cultures primaires de neurones stratifiées par sexe. Afin de s'assurer que les hippocampes mâles et femelles étaient cultivés séparément à partir de souriceaux correctement sexés, les embryons ont été séparés par sexe et leur cortex ainsi que leur hippocampe ont été isolés. L'ADN génomique a été extrait des tissus isolés de chaque embryon selon des procédures standard, en veillant à maintenir la séparation par sexe. Une réaction ...

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Discussion

Les cultures neuronales primaires dissociées de l’hippocampe stratifiées selon le sexe dans lesquelles les hippocampes mâles et femelles sont disséqués, dissociés et cultivés séparément présentent un outil utile pour étudier la signalisation cellulaire spécifique au sexe dans la mort cellulaire des neurones. Bien que les neuroscientifiques utilisent couramment des cultures neuronales primaires, les protocoles varient d’un laboratoire à l’autre en fonction de leurs objectifs et intérêts expérimentaux spécifiques. De nombr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Travail soutenu en partie par la Fondation Walter S. et Lucienne Driskill et NIH R01NS058792.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Supplément B27Invitrogen17504-044
BoraxSigma71997
Acide boriqueSigmaB6768
Sérum bovin AlbumineSigmaA4503
Sérum bovin fœtalInvitrogen26140-079
GlutaMAXInvitrogen35050-061
GlutamineInvitrogen25030-081
HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénolInvitrogen14175-095
MEM, sans glutamine, sans rouge de phénolInvitrogen51200-038
Neurobasal, sans glutamine, sans rouge de phénolInvitrogen12348-017
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15070-063
Poly-D-lysine, MW 70,000-150,000SigmaP0899
Trypan Blue 0.4 %Invitrogen15250-061
ÉQUIPEMENT
Dumont #5/45 Pince coudéeFine Science Tools11251-35
Dumont #7 &ndash ; Pince incurvée fineOutils de science fine11274-20
Dentelée (Londres) Pince FineScience Tools11080-02
Pince Graefe extra fine 1 x 2 dentsOutils de science fine11153-10
Ciseaux à ressort MoriaOutils de science fine15396-00
Ciseaux opératoires moyensRoboz SurgicalRS-6812
Ciseaux de microdissection extra finsRoboz SurgicalRS-5880
Plaques de culture tissulaire à 24 puitsFisher87721
Passoire cellulaire, 40 & micro ; M Nylon MeshBD Biosciences352340

Références

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