Article de méthode

Un protocole rapide pour l’intégration de puces extrachromosomiques à haut taux de transmission dans le génome de C. elegans

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DOI :

10.3791/50773

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9 décembre 2013

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1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une procédure rapide et peu consommatrice de matériaux pour l’intégration de réseaux extrachromosomiques transgéniques dans le génome de Caenorhabditis elegans en utilisant l’irradiation ultraviolette (UV). De plus, ce protocole est particulièrement bien adapté aux lignées transgéniques qui transmettent des réseaux extrachromosomiques à un rythme élevé.

Résumé

La micro-injection d’ADN dans le cytoplasme de la gonade syncytiale de Caenorhabditis elegans est la principale technique utilisée pour établir des lignées transgéniques qui présentent des taux de transmission partiels et variables de réseaux extrachromosomiques à la génération suivante. De plus, les animaux transgéniques sont mosaïques et expriment le transgène dans un nombre variable de cellules. Des réseaux extrachromosomiques peuvent être intégrés dans le génome de C. elegans à l’aide de l’irradiation UV pour établir des souches transgéniques non mosaïques avec un taux de transmission de 100 % du transgène. Dans cette mesure, les descendants F1 d’animaux transgéniques irradiés aux UV sont dépistés pour les animaux porteurs d’une intégration hétérozygote du transgène, ce qui conduit à un taux de transmission mendélienne de 75 % à la descendance F2. L’un des défis de cette méthode est de distinguer le pourcentage de transmission de transgènes dans une population avant (X % d’animaux transgéniques) et après intégration (≥75 % d’animaux transgéniques F2). Ainsi, cette méthode nécessite de choisir une lignée transgénique non intégrée avec un pourcentage d’animaux transgéniques nettement inférieur à la ségrégation mendélienne de 75 %. Par conséquent, les lignées transgéniques non intégrées avec un taux de transmission extrachromosomique à la génération suivante ≤60 % sont généralement préférées pour l’intégration, et l’intégration transgénique dans les souches à forte transmission est difficile. Nous montrons ici que l’efficacité de l’intégration des puces extrachromosomiques dans le génome est augmentée lors de l’utilisation de lignées transgéniques à forte transmission (≥80 %). Le protocole décrit permet de sélectionner facilement plusieurs lignées indépendantes avec intégration de transgènes homozygotes dans le génome après irradiation UV de vers transgéniques présentant un taux élevé de transmission extrachromosomique. De plus, cette méthode est assez rapide et consomme peu de matériaux. La possibilité de générer rapidement différentes lignées qui expriment un transgène intégré particulier est d’un grand intérêt pour les études axées sur le modèle et la régulation de l’expression des gènes, la localisation et la surexpression des protéines, ainsi que pour le développement de marqueurs subcellulaires.

Introduction

Les transgènes sont largement utilisés chez C. elegans pour une large gamme d’applications. Les souches transgéniques sont généralement générées par injection d’ADN dans la gonade hermaphrodite syncytial1,2. L’ADN porteur du transgène d’intérêt est co-injecté avec des plasmides codant pour les marqueurs de co-injection1,3,4. Les marqueurs de co-injection sont des transgènes établis conduisant soit à l’expression d’une protéine fluorescente, soit à un phénotype comportemental ou morphologique spécifique. Les ADN injectés se réorganisent pour former des réseaux extrachromosomiques à copies multiples ; Ainsi, le transgène d’intérêt et le marqueur de co-injection sont transmis ensemble5,4. Les lignées transgéniques sont sélectionnées dans la génération F2 des animaux injectés en suivant le phénotype induit par l’expression du marqueur de co-injection (fluorescence ou phénotype spécifique)1. Les lignées transgéniques présentent des taux de transmission partiels et variables des réseaux extrachromosomiques à la génération suivante. Selon la souche, 10 à 100 % (100 % étant un événement rare) des animaux héritent de réseaux extrachromosomiques. De plus, les animaux transgéniques sont mosaïques et expriment le transgène dans un nombre variable de cellules. Ce mosaïcisme est probablement corrélé au taux de transmission à la génération suivante. En effet, dans les cellules germinales et somatiques, le taux de transmission dépend de la ségrégation des réseaux extrachromosomiques lors des divisions cellulaires. Une façon d’éviter ce problème est d’intégrer le transgène dans le génome. Classiquement, l’intégration d’un transgène dans un chromosome repose sur l’irradiation (ultraviolette ou gamma) de vers transgéniques porteurs de réseaux extrachromosomiques3. En bref, 50 à 100 animaux hermaphrodites sont irradiés au stade larvaire L4. Dans la génération F1, 200 à 800 animaux transgéniques sont sélectionnés et élevés individuellement sur des plaques. Selon la ségrégation mendélienne, les animaux transgéniques F1 porteurs d’une intégration hétérozygote du transgène dans le génome produiraient 1/2 des descendants transgéniques hétérozygotes pour la puce intégrée, 1/4 des descendants transgéniques étant homozygotes pour la matrice intégrée, et 1/4 des descendants qui n’ont pas intégré la matrice (Figure 1). Ainsi, les plaques contenant la génération F2 sont criblées visuellement pour ≥75 % d’animaux transgéniques, comme observé par l’expression du marqueur de coinjection. Environ 1/3 des animaux F2 sélectionnés pour être des candidats intégrants sont supposés être homozygotes pour la matrice intégrée et produire 100 % des animaux F3 homozygotes. Par conséquent, à partir de chaque plaque sélectionnée, trois à huit animaux transgéniques F2 sont élevés individuellement et des plaques avec 100 % de descendants transgéniques sont sélectionnées. Ensuite, huit animaux F3 sont cultivés individuellement pour confirmer l’hérédité à 100 % du transgène.

Les principaux inconvénients de cette méthode sont les suivants :

  1. il nécessite un écran visuel de plusieurs centaines de plaques F1 pour ≥75 % de descendance F2 transgénique, ce qui prend du temps en raison du pourcentage variable et imprévisible de transmission des puces extrachromosomiques non intégrées. Alternativement, pour éviter le criblage des plaques F1, plusieurs étapes ultérieures de famine peuvent être effectuées après l’irradiation des animaux P0 ; suivi de la sélection de 100 animaux transgéniques et du dépistage de la progéniture 100 % transgénique3.
  2. Il n’est pas adapté aux souches présentant un pourcentage de transmission extrachromosomique supérieur à 60 %, car ce pourcentage est difficile à distinguer de 75 %.
  3. comme seules des souches ayant un taux de transmission relativement faible peuvent être utilisées, un nombre élevé d’animaux transgéniques P0 irradiés est nécessaire ainsi que l’observation de nombreux animaux F1 et F2, ce qui prend beaucoup de temps et nécessite un nombre considérable de plaques.

L’irradiation des vers induit probablement des cassures double brin dans l’ADN et l’intégration de réseaux extrachromosomiques dans les chromosomes se produit pendant la réparation de l’ADN. Ainsi, il est probable que les chances d’obtenir une intégration réussie par l’intermédiaire de l’irradiation sont directement proportionnelles au nombre de cellules germinales porteuses d’un réseau extrachromosomique. Les souches ayant un taux de transmission élevé peuvent contenir plus de puces d’ADN transgéniques que les souches ayant un faible taux de transmission, comme suggéré en2, et présenter un plus grand nombre de cellules germinales portant des puces extrachromosomiques. Ainsi, nous avons estimé que dans les lignées à forte transmission, les transgènes pourraient être plus faciles à intégrer que dans les lignées à faible taux de transmission. Cependant, le protocole standard exclut la possibilité d’intégrer des transgènes à haute fréquence de transmission car le pourcentage d’animaux transgéniques avec une matrice extrachromosomique non intégrée peut difficilement être distingué de celui de la descendance d’un animal F1 porteur d’une intégration hétérozygote du transgène dans le génome (Figure 1).

Ici, nous montrons que pour un transgène particulier, le nombre de lignées intégrées récupérées après irradiation avec de la lumière ultraviolette (UV) dépend du pourcentage initial de transmission du réseau non intégré. Nous présentons un protocole amélioré pour l’intégration des transgènes médiée par l’irradiation UV qui est particulièrement pertinent pour les lignées présentant un taux élevé de transmission par réseau de transgènes.

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Protocole

1. Culture de nématodes transgéniques avant l’intégration

Les lignées transgéniques peuvent être générées comme décrit en1. Ces lignées contiennent généralement un plasmide marqueur de co-injection conduisant soit à l’expression d’une protéine fluorescente, soit à un phénotype comportemental ou morphologique spécifique à un stade de développement donné1,3. Ce protocole d’intégration peut être appliqué à des souches exprimant des marqueurs de coinjection fluorescents ou non fluorescents. Dans l’exemple ci-dessous, une souche avec un marqueur de co-injection fluorescent a été utilisée.

  1. Préparez les plaques de culture :
    1. Préparez environ 500 boîtes de Pétri de 60 mm de large versées de manière aseptique avec 10 ml chacune de milieu de croissance des nématodes (NGM)6,7.
    2. Ensemencer chaque boîte avec 0,3 ml de culture d’Escherichia coli OP50 saturée en suivant la procédure standard6,7.
  2. Évaluer le taux de transmission de la lignée transgénique à intégrer :
    1. Pour chaque lignée transgénique, prélever dix adultes gravides fluorescents sur dix plaques de culture distinctes sous un stéréoscope fluorescent à l’aide d’un pic à vers, comme décrit aupoint 7.
    2. Cultivez les animaux dans un incubateur de vers à 15-25 °C (selon le patrimoine génétique) pour permettre aux vers de se reproduire.
    3. Observez la descendance chaque jour pour évaluer à quel stade de développement le marqueur de co-injection est exprimé et peut être le mieux observé. L’expression de la plupart des marqueurs de co-injection actuellement utilisés est observée au stade larvaire L4 ou à l’âge adulte.
    4. Évaluer le taux de transmission de la descendance en déterminant le pourcentage de descendance fluorescente par observation sous un stéréoscope fluorescent
      5. .
  3. Choisissez une lignée transgénique pour l’intégration transgénique :
    1. Sélectionnez la lignée transgénique ayant le taux de transmission le plus élevé possible (idéalement ≥80 %).
  4. Obtenir une population d’animaux transgéniques synchronisée au stade larvaire L4 pour l’intégration :
    1. Choisissez 30 adultes gravides fluorescents sur cinq plaques de culture (six animaux par plaque).
    2. Laissez les vers pondre des œufs pendant 3-4 heures à 15 °C.
    3. Éliminez les adultes des plaques après avoir vérifié la présence d’au moins 30 œufs par plaque.
    4. Cultivez les animaux dans un incubateur à vers à une température de 15 à 25 °C jusqu’à ce que la progéniture atteigne le stade larvaire L4 (96 heures à 15 °C ou 36 heures à 25 °C).

2. Irradiation UV et récupération des vers transgéniques

  1. Irradiation par ver :
    1. Prélever 30 à 100 animaux transgéniques fluorescents L4 sur des plaques de culture séparées (15 à 20 animaux par plaque).
    2. Placez les plaques, avec les couvercles retirés, dans un réticulant UV. Irradier les vers à 0,012 J/cm2. Notez que les souches sont plus ou moins sensibles aux UV et que les résultats peuvent être variables en fonction de l’irradiateur UV utilisé. Une gamme de doses comprise entre 0,010 et 0,015 J/cm2 peut être testée.
  2. Récupération du ver après irradiation :
    1. Placez les plaques avec les vers irradiés pendant la nuit à 15 °C pour la récupération.
    2. Vérifiez le nombre d’animaux vivants. Entre nos mains, un taux de survie d’environ 80 à 90 % est adapté pour une irradiation efficace.
    3. Faire pousser les animaux irradiés à 15-25 °C jusqu’à ce que la progéniture ait atteint le stade de développement, ce qui permet d’observer l’expression du marqueur de coinjection, comme établi à l’étape 1.2.

3. Isolement des lignées transgéniques intégrées

  1. Sélection d’animaux F1 :
    1. Isoler 150 à 200 animaux fluorescents F1 sur des plaques de culture séparées. Pour les lignées à forte transmission (≥80 %), 100 animaux F1 suffisent.
    2. Maintenir ces plaques F1 à 15-25 °C jusqu’à ce que la progéniture atteigne un stade approprié pour l’observation des animaux F2 fluorescents.
    3. Jeter toutes les plaques F1 ne présentant soit i) aucune descendance, indiquant que l’animal F1 était stérile ou mort, soit ii) aucun ou seulement quelques animaux F2 fluorescents, indiquant que l’animal F1 n’a pas transmis le transgène au taux attendu. Cette étape est rapide et représente un réel avantage par rapport au protocole standard qui nécessite une estimation du pourcentage de vers F2 fluorescents afin de sélectionner des plaques F1 présentant une descendance ≥75 % fluorescente (Tableau 1).
  2. Sélection des animaux F2 :
    1. Isoler quatre animaux fluorescents transgéniques F2 de chaque plaque F1 sélectionnée. Lorsque vous utilisez des transgènes fluorescents (par exemple mCherry8, gfp9 ou dsRed10), choisissez des vers F2 avec un niveau élevé de fluorescence car cela pourrait indiquer que ces animaux sont homozygotes pour le réseau intégré. Notez que lors de la cueillette d’animaux F2, il est essentiel de ne pas emporter d’œufs ou de larves, afin d’éviter les faux négatifs à l’étape suivante.
    2. Faites pousser des animaux F2 à 15-25 °C.
  3. Isolement et validation de souches transgéniques intégrées :
    1. Plaques d’écran F2 pour vers F3 transgéniques 100 % fluorescents. L’écran est assez rapide car la présence d’un seul ver non fluorescent indique que la plaque doit être jetée. Un animal homozygote F2 pour le transgène intégré donnera une descendance fluorescente 100 % homozygote.
    2. Isoler huit animaux F3 fluorescents à partir de plaques sélectionnées pour confirmer l’hérédité à 100 % du transgène. En théorie, il suffit de choisir un seul animal à cette étape. Cependant, il peut être nécessaire de choisir huit animaux F3 fluorescents pour éviter de sélectionner des animaux non fertiles ou en mauvaise santé, car l’irradiation peut induire au hasard des mutations qui affectent des gènes importants pour la physiologie des vers.
    3. Si possible, conservez plusieurs souches transgéniques intégrées indépendantes, c’est-à-dire des souches récupérées sur différents animaux F1.

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Résultats

Des intégrations de transgènes dans deux lignées différentes transmettant des réarrangements extrachromosomiques à une fréquence similaire (50-60 %) ont été réalisées à l’aide des protocoles standard et amélioré (Tableau 1). Le protocole standard a permis d’obtenir trois lignées intégrées indépendantes après irradiation UV de 91 animaux transgéniques au stade L4, tandis que le protocole amélioré a permis d’obtenir une lignée intégrée après irradiation UV de 30 animaux transgéniques au stade L4. Cela sugg...

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Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode efficace pour intégrer des réseaux transgéniques extrachromosomiques dans le génome de C. elegans. En utilisant différentes lignées non intégrées, qui transmettaient le même transgène Pdyc-1 ::d yc-1 ::gfp (pKG45) à des taux différents (10-15 %, 50-60 % et >80 %), nous avons montré que le nombre de souches intégrées récupérées après irradiation UV dépend du niveau initial de transmission de la lignée non intégrée (tableau 2). Par conséquent, l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêt financier concurrent.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Claire Lecroisey et Laurent Ségalat pour la génération non intégrée de Pdyc-1 ::d yc-1 ::gfp ; souches transgéniques Pmyo-2 ::d sRed et Pmyo-3 ::gfp. Nous remercions Andy Fire pour le don du plasmide Pmyo-2 ::d sRed et Pamela Hoppe pour le don du plasmide Pmyo-3 ::gfp. Ces travaux ont été fondés par le Centre national de la recherche scientifique (CNRS) et l’Université Claude Bernard de Lyon.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgarProlabo20768.292pour la préparation NGM (milieu de croissance des nématodes) (6,7)
NaClChimie-Plus40045pour la préparation NGM
Bacto-peptoneBD211820pour la préparation NGM
KH2PO4Roth3904-1pour la préparation NGM
K2HPO4Prolabo26930.293pour la préparation NGM
MgSO4RothP027.2pour la préparation NGM
CaCl2Prolabo22317.297pour la préparation NGM
CholestérolRectapurpour la préparation NGM
LB-brothSigmaL3022pour la culture de OP50
bactéries ÉQUIPEMENT Réticulant
UVFischer ScientificLongueur d’onde 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Boîtes de Pétri, 60 mmCMLBPS55E6
fil de platinium 0,25 mmAlfa Aesar7440-06-4Pour faire une pioche pour les vers (7)

Références

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

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Mots-clés

Irradiation UVS lection de lign es transg niquesCriblage fluorescentInt gration homozygoteAnalyse du taux de transmissionCriblage de la prog niture F1S lection de plaques F2G n ration de souches ind pendantes

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