Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

Résumé

Biomarqueurs de mesure dans des échantillons biologiques complexes est de plus en plus guident prise de décision clinique. Nous décrivons une méthode très sensible pour mesurer simultanément la myosine cardiaque protéine de liaison-C, la créatine kinase MB et la troponine I cardiaque dans le sérum de sujets atteints d'infarctus du myocarde et de sujets témoins en bonne santé.

Résumé

Les biomarqueurs sont de plus en plus en plus important dans la prise de décision clinique, ainsi que la science fondamentale. Diagnostic de l'infarctus du myocarde (IM) est en grande partie entraînée par la détection de protéines spécifiquement cardiaque dans le sérum ou le plasma de patients comme indicateur de la lésion du myocarde. Ayant récemment montré que la myosine cardiaque protéine de liaison-C (cMyBP-C) est détectable dans le sérum après un IM, nous avons proposé comme un biomarqueur potentiel de MI. Les biomarqueurs sont généralement détectés par alternance enzyme-linked tests immuno traditionnels. Toutefois, cette technique nécessite un grand volume de l'échantillon, a une faible plage dynamique, et permet de mesurer une seule protéine à la fois.

Ici, nous montrons un test immunologique multiplex dans lequel trois protéines cardiaques peuvent être mesurés simultanément avec une grande sensibilité. Mesure cMyBP-C dans Uniplex ou avec de créatine kinase MB et la troponine I cardiaque ont montré une sensibilité comparable. Cette technique utilise la méso échelle Discovery(MSD) méthode de multiplexage dans une plaque de 96 puits combiné avec électrochimiluminescence pour la détection. Bien que de petites quantités d'échantillons sont nécessaires, une grande sensibilité et une grande plage dynamique sont atteints. Grâce à cette technique, nous avons mesuré cMyBP-C, la créatine kinase MB et la troponine cardiaque niveaux I dans des échantillons de sérum de 16 sujets atteints d'IM et comparé les résultats avec 16 sujets témoins. Nous avons pu détecter tous les trois marqueurs dans ces échantillons et découvert les trois biomarqueurs être augmentée après MI. Cette technique est donc adapté à la détection sensible des biomarqueurs cardiaques dans des échantillons de sérum.

Introduction

La mesure de faibles quantités de protéines dans des échantillons biologiques complexes comme le sérum, est d'une importance croissante pour la gestion clinique des patients, ainsi que la science fondamentale. Par exemple, une augmentation des taux sériques de biomarqueurs cardiaques, tels que la troponine I, dans un contexte clinique est compatible avec infarctus aigu du myocarde (MI) ^1. Pour détecter les protéines dans des échantillons de sérum, le dosage immuno-enzymatique standard (ELISA) est la technique la plus souvent utilisée car elle a une sensibilité élevée et permet une quantification absolue de l'analyte. Toutefois, les tests ELISA trad....

Protocole

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. La veille de l'expérience, manteau de la plaque standard nu 96 puits MSD avec l'anticorps de capture. Pour cMyBP-C, utiliser un volume 30 ul d'anticorps anti-cMyBP-C monoclonal de souris (sans gélatine) à une concentration de 5 ug / ml dilué dans un tampon phosphate salin (PBS).
2. Comme le puits est hydrophobe, une pipette de la solution dans le coin inférieur du puits; puis sur les côtés de la plaque pour propager la solution sur l'ensemble de puits.
3. La plaque est recouverte d'un agent de scellement de la plaque et on incube O / N à 4 ° C sans agitation.
4. Retirer la solution d'ant....

Résultats

Les principes de base et le workflow de l'essai 3-plex sont présentés dans la figure 1, et le flux de travail global est décrite dans le tableau 1. Dosages Uniplex travaillent sur le même principe sauf que l'ensemble de fond de puits est recouvert d'un anticorps de capture. la détection du signal est effectuée par ECL dans lequel un signal électrique est appliqué à la partie inférieure du puits. Ceci, en retour, initie une production locale de la lumière à travers une réaction chimique .......

Discussion

Dans cette étude, nous montrons l'applicabilité d'un test immunologique multiplex pour la détection de multiples biomarqueurs cardiaques dans le sérum de patients. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport ELISA classique. Tout d'abord, ECL dans le kit de dosage est utilisé à la place de la détection colorimétrique. En ECL, un signal électrique stimule la production locale de la propriété mesurée (lumière), ainsi découpler l'événement de stimulation du signal, ce qui réduit fond ^14........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) avec tensioactif	Meso Scale Discovery	R92TC-2	;
Tween-20	Acros	9005-64-5	;
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1	;
Solution saline tamponnée au phosphate, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filtrer avant utilisation
Anticorps de la protéine C de liaison à la myosine, monoclonal de souris (E7), sans gélatine	Santa Cruz	SC-137180L	Pour l’enrobage, l’anticorps doit être sans
Plaques et équipement
Multi-Array Plaque standard à 96 puits	Meso Scale Discovery	L15XA-3
Un prototype de plaque 3-plex, quatre points, à 96 puits avec cMyBP-C, cTnI et CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1	.
Pellicule d’étanchéité ThermaSeal	Produits des sciences de la vie Inc.	ST-3098	;
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery		;
Agitateur de microtitration numérique MTS 2/4	IKA	3208001	;