Article de méthode

La culture et entretien

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DOI :

10.3791/50787

⸱

14 septembre 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Clostridium difficile est une bactérie pathogène qui est une bactérie anaérobie stricte et provoque la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA). Ici, des méthodes d'isolement, la culture et le maintien C. des cellules et des spores végétatives difficile sont décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui nécessite un entretien régulier pour assurer des conditions adéquates pour optimale C. culture difficile.

Résumé

Clostridium difficile est un anaérobie, bactérie à Gram positif sporogène qui est principalement responsable de la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA) et est un agent pathogène nosocomial important. C. difficile est notoirement difficile à isoler et à cultiver et est extrêmement sensible à même les niveaux d'oxygène dans l'environnement faibles. Ici, les procédés d'isolement de C. difficile à partir d'échantillons fécaux et la culture de la suite C. difficile pour la préparation des stocks de glycérol pour le stockage à long terme sont présentés. Des techniques pour la préparation et l'énumération des stocks de spores dans le laboratoire pour une variété d'applications en aval, y compris des études de microscopie et animaux sont également décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui maintient un milieu anaérobie cohérente afin de garantir des conditions adéquates pour optimale C. croissance difficile. Nous fournissons des protocoles pour le transfert de matériaux dans et hors de la chambre sans caen utilisant une contamination importante de l'oxygène ainsi que des suggestions pour l'entretien régulier nécessaire pour préserver l'environnement anaérobie approprié pour efficace et cohérente C. culture difficile.

Introduction

Clostridium difficile est une bactérie sporulée Gram positif qui est un anaérobie strict et un agent pathogène gastro-intestinal potentiellement mortelle de l'homme et les animaux. Initialement décrit en 1935 comme un organisme commensal trouvé dans les échantillons de selles des nouveau-nés 1, C. difficile a été démontré plus tard d'être l'agent causal de la colite pseudomembraneuse associée à un traitement antibiotique 2. C. infections difficile (ICD) sont généralement précédés par un traitement antibiotique qui se traduit par la perturbation de la flore colique normale, la création d'une niche pour C. difficile de prospérer 2. C. difficile est transmis sous forme d'une spore dormante par l'intermédiaire de la voie fécale-orale et par la suite germe dans le tractus gastro-intestinal, la production de cellules végétatives capable de générer plusieurs toxines et provoquer une maladie grave et la colite 3. CDI sont souvent réfractaires aux traitements conventionnels et ceux-ci enperfections sont souvent récurrentes 4. En conséquence, le CDI sont responsables de jusqu'à 4,8 milliards de dollars en coûts de soins de santé aux États-Unis 5-7.

C. difficile est très sensible même pour les niveaux d'oxygène dans l'environnement de faibles. Pour C. difficile de persister dans l'environnement et être efficacement transmis d'hôte à hôte, la formation d'une spore métaboliquement inactif est critique 8. Étant donné que le maintien et la manipulation de laboratoire de C. difficile nécessite un environnement anaérobie contrôlée, ces techniques nécessitent l'utilisation d'une chambre anaérobie. L'utilisation de chambres d'anaérobie a abouti à la récupération accrue et l'isolement des anaérobies stricts 9-11, et a permis un certain nombre de techniques moléculaires devant être exécutés dans une atmosphère anaérobie.

En plus de C. difficile, l'anaérobie utilisation de la chambre et l'entretien décrits ici sont applicablesà d'autres anaérobies stricts tels que d'autres espèces de Clostridium (par exemple C. perfringens), d'autres espèces gastro-intestinaux (par exemple, les espèces Bacteroides 12) et pathogènes parodontaux (par exemple, les espèces Peptostreptococcus 13).

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Protocole

Remarque: C. difficile est un agent pathogène humain et animal qui peut provoquer une maladie gastro-intestinale. Les expériences impliquant C. difficile doit être effectué avec des précautions appropriées de biosécurité (BSL-2).

Une. Anaérobie Chambre utilisation et d'entretien

C. difficile est une bactérie anaérobie stricte et est extrêmement sensible à de faibles concentrations d'oxygène dans l'atmosphère. Par conséquent, un environnement anaérobie contrôlée est nécessaire pour sa manipulation réussie. L'utilisation d'une chambre anaérobie (figure 1A) fournit l'environnement le plus stable et les conditions idéales pour la culture efficace de C. difficile et d'autres bactéries anaérobies 14. Ici, une atmosphère contenant un mélange gazeux (5% de CO 2, 10% H 2, 85% N 2) peut être maintenu de manière stable.

D'introduire des éléments dans la chambre sans contamination importante de l'oxygène,un sas doit être utilisé (figure 1B). Ce dispositif fonctionne comme un échangeur gaz et fonctionne automatiquement, semi-manuellement ou manuellement. Le sas comporte deux portes: une fourniture d'accès à l'extérieur du sas à air et l'autre fournissant un accès à l'intérieur de la chambre anaérobie. Selon le modèle, le sas peut avoir une porte supplémentaire, ce qui peut offrir l'accès à une chambre anaérobie adjacent, ce qui économise le coût d'un sas séparé. À moins de déplacer activement articles dans ou hors de la chambre, les deux portes doivent rester fermées en tout temps pour éviter la contamination de l'oxygène. Le sas possède un interrupteur marche / arrêt sur la face avant et un panneau contenant quatre boutons. Les conduites de gaz et la pompe à vide tuyau sont reliées à l'arrière du sas, à proximité de la face où se trouvent les commutateurs pour un fonctionnement entièrement manuel de l'appareil. Il est recommandé que les deux cycles de purge, en utilisant de l'azote gazeux (N 2), on utilise avant remplissage de l'échangeur avec un mélange de gaz (5% de CO 2, 10% H 2, 85% de N 2) pour réduire la quantité d'oxygène introduite dans la chambre. Il est également important de ne jamais laisser soit la porte ouverte plus longtemps que la quantité de temps nécessaire pour déplacer des éléments dans et hors de l'échange et de planifier soigneusement expériences pour réduire la fréquence des éléments mobiles dans et hors de la chambre. Les procédures d'exploitation différents pour les chambres d'anaérobie de vinyle sont décrits ci-dessous. Avant de suivre ces protocoles, veiller à ce que ceux-ci sont compatibles avec les instructions du fabricant fournies avec la chambre.

  1. Mode Automatique
    Il s'agit d'un mode programmable et personnalisable et est entièrement réalisée par le sas. Pour programmer le sas, reportez-vous aux instructions du fabricant. Un programme recommandé pour entrée typique dans la chambre comporte deux cycles de purge avec de l'azote, suivie par le remplissage du sas avec un mélange de gaz qui correspond le mieux à l'atmosphère maintenue dans la chambre debre. Au cours de chaque cycle de vide, les procédures standard d'usine proposent un vide à 20 inHg et purge à 1 inHg.
    1. Assurez-vous que la porte du sas intérieur est complètement fermée.
    2. Ouvrez la porte du sas extérieur.
    3. Placer des éléments dans le sas et fermer la porte du sas extérieur. Si l'introduction de liquides, dévisser les bouchons à mi-chemin pour assurer l'échange efficace de gaz. Emballages et récipients scellés doivent être ouvertes avant le début du cycle, en s'abstenant de le faire peut se déformer et dommages en plastique et des conteneurs. Pour maintenir la stérilité, ouvrir les emballages suffisamment pour permettre que les échanges gazeux efficace.
    4. Appuyez sur le bouton Démarrer.
    5. Attendez jusqu'à ce que le sas a pédalé à travers le programme et l'écran affiche "anaérobie".
    6. Ouvrir la porte du sas intérieur.
    7. Déplacer des éléments dans la chambre.
    8. Fermez la porte intérieure.
  2. Mode semi-manuel
    Ce mode peut être utilisé lors du déplacement des éléments dans ou hors de la chambre et est si nécessaire cycling le gaz dans la chambre est nécessaire.
    1. Assurez-vous que la porte du sas intérieur est complètement fermée.
    2. Ouvrez la porte du sas extérieur.
    3. Placer des éléments dans le sas et fermer la porte du sas extérieur. Si l'introduction de liquides, dévisser les bouchons à mi-chemin pour assurer l'échange efficace de gaz. Des emballages scellés, tels que des boucles d'inoculation et des plaques à 96 puits, doivent être ouvertes avant le début du cycle.
    4. Appuyez sur Menu.
    5. Appuyez sur Start. Le sas indique la fonction de chaque bouton et ne répond pas jusqu'à ce que cela est terminé:
      • Flèche vers le haut: active la pompe à vide.
      • Flèche vers le bas: lance l'azote (purge) du débit de gaz.
      • Lancer: lance le flux de mélange de gaz.
      • Menu: revenir à l'affichage par défaut.
    6. Appuyez sur «Up», éliminer le gaz dans le sas, jusqu'à ce que l'écran affiche 20 inHg.
    7. Appuyez sur "Down", le remplissage du sas avec de l'azote, jusqu'à ce que l'écran affiche moins de 1 inHg. Ne pas overshoot, car cela créera une pression positive dans le sas, qui peut affecter son intégrité.
    8. Répétez les étapes 6 et 7 pour effectuer un cycle de purge supplémentaire.
    9. Appuyez sur "Up" jusqu'à ce que l'écran affiche 20 inHg.
    10. Appuyez sur "Démarrer", remplissant l'échange avec un mélange de gaz, jusqu'à ce que l'écran affiche moins de 1 inHg.
    11. Ouvrir la porte du sas intérieur.
    12. Déplacer des éléments dans la chambre.
    13. Fermez la porte intérieure.
  3. Mode manuel
    Ce mode peut être utilisé chaque fois que les modes automatiques ou semi-manuels ne fonctionnent pas ou il n'y a pas le pouvoir de le sas. Ce mode ne fonctionne pas lorsque le sas est, par conséquent, il est difficile de déterminer la pression à l'intérieur du sas. Parce que le vide tirer et temps de purge de gaz dépend de taux de vide et de flux de gaz, respectivement, l'utilisation d'une jauge de pression à l'intérieur de l'échangeur est nécessaire pour surveiller la pression et réduire le risque de blessures et de dommages à la sas.
    1. Assurez-vous que la porte du sas intérieur est complètement fermée.
    2. Ouvrez la porte du sas extérieur.
    3. Placez les articles, y compris la jauge de pression, dans le sas et fermer la porte du sas extérieur. Si l'introduction de liquides, dévisser les bouchons à mi-chemin pour assurer l'échange efficace de gaz. Des emballages scellés, tels que des boucles d'inoculation et des plaques à 96 puits, doivent être ouvertes avant le début du cycle.
    4. Repérez les trois interrupteurs situés à l'arrière du sas intitulée «aiguillages à commande manuelle." Ceux-ci sont marqués individuellement en tant que:
      • Pour aspirateur
      • Azote
      • Gaz Mix
    5. Basculez l'interrupteur à bascule au vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.
    6. Basculez l'interrupteur de l'azote à bascule jusqu'à ce que le manomètre indique environ 1 inHg.
    7. Basculez l'interrupteur à bascule au vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.
    8. Basculez l'interrupteur de l'azote à bascule jusqu'à ce que le manomètre indique environ 1 inHg.
    9. Basculez l'interrupteur à bascule au vide jusqu'à ce que le manomètre indique environ 20 inHg.
    10. Basculez l'interrupteur à bascule de gaz jusqu'à ce que le mélange manomètre indique environ 1 inHg.
    11. Ouvrir la porte du sas intérieur.
    12. Déplacer des éléments dans la chambre.
    13. Fermez la porte intérieure.

2. La culture, l'énumération et l'entreposage C. difficile à partir des échantillons de selles

Cette procédure vise à récupérer C. difficile à partir d'échantillons fécaux contenant des spores et maintient par la suite des colonies isolées que les cellules végétatives ou de spores dans le stockage à long terme des stocks de glycérol. Sinon, cette procédure peut être utilisée pour énumérer le nombre de C. présent difficile dans les échantillons de selles (par exemple provenant d'études animales). Pour enrichir sélective et différentielle pour C. difficile, l'agar-taurocholate céfoxitine-cyclosérine-fructose (TCCFA) est utilisé pour inhiber la croissance de la flore fécale normale de 15 à 16. Cyclosérine est bactériostatique pour les bactéries Gram-négatives, tandis que la céfoxitine inhibe de façon plus générale la croissance des bactéries à la fois Gram-négatifs et positifs, à l'exception de C. difficile et plus entrent souches de cocci. Un indicateur de pH, le rouge neutre, peut être incluse dans le milieu, comme la fermentation du fructose se traduira par une diminution du pH et un changement de couleur ultérieur du rouge / orange au jaune. Pour récupérer efficacement les spores de C. difficile que les bactéries végétatives, le taurocholate de sodium et de sel biliaire est utilisée pour induire la germination de 17 à 18. Parce C. forme des spores difficile, l'alcool ou le traitement thermique des échantillons peut être utilisée pour réduire ou éliminer les cellules végétatives, ce qui limite la croissance de la flore contaminante, ce qui peut augmenter l'efficacité de C. récupération difficile 19. Comme mentionné ci-dessus, il est essentiel d'effectuer une pré-réduire toutes les plaques pendant au moins 1-2 heures dans la chambre anaérobie avant l'utilisation pour assurer l'élimination de l'oxygène résiduel. dryi de l'airng les plaques avant de les utiliser dans la chambre peuvent réduire la condensation. Le milieu liquide peut nécessiter jusqu'à 24 heures pour réduire en fonction du volume et le rapport surface-air du récipient utilisé.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie:

  • échantillon de selles
  • Écouvillons
  • Boucles d'inoculation stériles
  • 1x PBS (voir Matériaux)
  • Plaques TCCFA (voir Matériaux)
  • BHIS (Brain Heart Infusion milieu d'extrait de levure) plaques et le bouillon (voir Matériaux)
  • 50% de glycérol (stérilisé)
  • 10% de L-cystéine (stérilisé)
  • Flacons de stockage cryogéniques

* En variante, des colonies isolées peuvent être étalés sur des plaques de gélose BHIS, et ensuite raclées et remises en suspension dans un milieu liquide BHIS avec 15% de glycerol pour stockage à long terme à -80 ° C. ** Il est important de noter que la coloration de Gram n'est pas une stratégie efficace pour identifier C. Difficile directement à partir d'échantillons de selles 23 ; C. difficile doit d'abord être isolé des autres flore présente dans les selles.

  1. Reprendre l'échantillon de selles dans PBS 1x (ce peut être réalisée dans des conditions aérobies), et veiller à ce que l'échantillon de selles est entièrement remis en suspension dans du PBS 1x par vortex. Si l'énumération C. difficile dans les selles, peser l'échantillon de selles, avant l'addition de 1 x PBS.
  2. Faire des dilutions en série de l'échantillon de selles remis en suspension dans du PBS 1x pour l'isolement ou l'énumération approprié d'unités formant des colonies (UFC) par gramme de selles.
  3. En utilisant une technique aseptique, appliquer 100 ul de chaque dilution en série de plaques TCCFA.
  4. Grâce à une série de boucles d'inoculation stériles, série la culture appliqué des colonies isolées ou diffuser la culture appliquée sur la surface de la plaque TCCFA pour le dénombrement des colonies uniformément.
  5. Incuber la plaque pendant 48 h en anaérobiose à 37 ° C. Il est possible de détecter et d'identifier C. DIFFICILE colonies dans les 24 heures basées surl'appartement irrégulière, l'apparence, rez-de-verre des colonies de 15, bien que l'identification et l'énumération plus précise est obtenue après 48 heures.
  6. Utilisation des boucles d'inoculation stériles, repiquer des colonies qui semblent C. difficile sur pré-réduits des plaques d'agar BHIS, complété par 0,03% de L-cystéine 20. Choisissez une colonie individuelle, et une rayure sur la plaque dans les quadrants, en utilisant une nouvelle anse stérile pour chaque quadrant, à obtenir des colonies isolées. Sinon, compter le C. DIFFICILE colonies de chaque dilution (ce peuvent être effectuées dans des conditions aérobies), et calculer le nombre de colonie unités par gramme d'échantillon de selles former.
  7. Confirmez C. identification difficile par la coloration de Gram. Après coloration de Gram, C. difficile apparaît que des tiges pourpres et certaines cellules peut contenir des endospores terminaux. réaction en chaîne de la polymérase (PCR) l'identification des gènes qui codent pour la toxine B peut fournir une confirmation supplémentaire desouches toxinogènes de C. difficile alors que 21 multilocus sequence typing (MLST) est un succès pour l'identification et le typage précis des souches inconnues et non toxigènes de C. Difficile 22.
  8. Afin de maintenir un stock de C. difficile à -80 ° C, choisissez un individu, colonie isolée de la plaque de gélose BHIS utilisant une anse stérile et remettre en suspension la colonie dans 10 ml de BHIS pré-réduits milieu liquide complété avec 0,03% de L-cystéine. *
  9. Incuber une nuit en anaérobiose à 37 ° C, ou jusqu'à ce que la culture devient trouble.
  10. Ajouter 333 ul de glycérol à 50% et 666 pi de la C. culture difficile à un tube cryogénique de 1,8 ml à créer un stock de glycérol de la souche isolée de 15%.
  11. Bien plafonner le tube cryogénique, bien mélanger et retirer immédiatement le stock de la chambre anaérobie et le placer dans un congélateur -80 C ° pour le stockage à long terme.

3. La culture de C. difficile de stocks congelés glycérol

Cette procédure prévoit le recouvrement de C. difficile à partir des stocks de glycerol stockées à -80 ° C. Parce que des cycles répétés de gel-dégel peuvent tuer les cellules végétales, il est important de garder les stocks de glycérol congelés en tout temps. Nous ne recommandons pas l'utilisation de la glace sèche pour le transfert de souches dans et hors de la chambre que l'évaporation de la glace sèche peut modifier l'environnement dans la chambre. Au lieu de cela, nous vous recommandons d'utiliser des supports de refroidissement congelés de conserver des stocks de glycérol congelés pendant le transport. Pour diverses fins sélectives et différentielles, trois médias sont couramment utilisés pour la culture de C. difficile. TCCFA, tel que discuté ci-dessus, est sélectif pour C. difficile et contient le taurocholate de sodium, un germinant. l'infusion de coeur de cerveau supplémenté avec de l'extrait de levure (BHIS) est un milieu enrichi couramment utilisé, non sélectif qui permet la croissance d'une grande variété d'organismes (figure 2A) 24. Foire, L-cystéinee est ajouté à BHIS comme agent réducteur 20. Enfin, l'addition de sang dans le milieu (figure 2B) permet de sporulation plus efficace que sur TCCFA et permet la détection de la fluorescence verdâtre ou chartreuse uniques présentée par C. difficile sous ultraviolet à onde longue (UV) 15 (figure 2C). Lorsque la culture de C. difficile à partir des stocks de spores, il est essentiel de rappeler que le taurocholate de sodium doit être ajouté au milieu pour assurer la germination.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie:

  • Frozen stock de glycérol (en rack de refroidissement)
  • Boucles d'inoculation stériles
  • Plaques TCCFA ou BHIS (voir Matériaux)
  • BHIS bouillon (voir Matériaux)
  • 50% de glycérol (stérilisé)
  • Flacons de stockage cryogéniques
  1. Placez le glycérol stock congelé de C. difficile dans un support de refroidissement qui a été stocké à -80 ° C prIOR à utiliser pour éviter la décongélation.
  2. Apportez le stock de glycérol congelés sur glace sèche dans la chambre anaérobie.
  3. En utilisant une technique aseptique et une anse stérile, placez une petite quantité du stock sur la plaque et zèbrent un quadrant de la plaque.
  4. Faites pivoter la plaque de 90 ° et, en utilisant une nouvelle anse stérile, continuer à zèbrent le deuxième quadrant.
  5. Répéter pour les troisième et quatrième quadrants pour assurer l'isolement de colonies individuelles.
  6. Enlever immédiatement le stock de glycérol congelés de la chambre anaérobie et revenir à -80 ° C.
  7. Incuber la plaque par voie anaérobie pendant une nuit à 37 ° C. Colonies isolées individuelles doivent être observées après une nuit de croissance.

4. Purifiant spores de C. difficile

Comme sporulation est nécessaire pour la survie dans des environnements riches en oxygène et pour une transmission efficace de la maladie 8, la préparation des stocks de spores est Often nécessaire pour les applications en aval, ne se limitant pas à des études de microscopie et animaux. Il est important de noter que l'énumération des spores nécessite répétition pour assurer la reproductibilité de la numération. Introduire à la pipette de haut en bas plusieurs fois entre dilutions réduit également la perte depuis spores adhèrent au plastique bien.

La sporulation de C. difficile n'est pas aussi rapide ou homogène que d'autres espèces sporogènes. Pour optimiser la production de spores et de récupération, soit du milieu de sporulation (SMC) 17,25 ou 26 70:30 moyenne est recommandée. D'autres médias couramment utilisés sont BHIS, qui nécessite 4-5 jours de croissance avant la sporulation efficace est considéré 27, et Clospore, un milieu liquide qui produit des titres élevés de spores (10 juillet-10 août spores par millilitre) après 72 heures de croissance. D'autres protocoles utilisent de l'eau refroidie à la glace, plutôt que du PBS 1x 20, mais l'utilisation d'une solution isotonique peut réduire les spores de coller les uns aux autres et des surfaces plastiques. Autrement,certains chercheurs purifier davantage leurs spores en utilisant un gradient de saccharose à supprimer complètement les cellules végétatives et les débris 29.

Avant de commencer, les éléments suivants doivent être placés dans la chambre anaérobie:

  • Boucles d'inoculation stériles
  • BHIS, SMC et / ou 70:30 plaques (voir Matériaux)
  • BHIS bouillon (voir Matériaux)
  • 1x PBS, stérilisée par filtration (voir Matériaux)
  1. Souches Culture congelé stock de glycérol sur des plaques BHIS pré-réduits et incuber en anaérobiose nuit à 37 ° C.
  2. Restreak sur plusieurs pré-réduit ou SMC 70:30 plaques et incuber en anaérobiose à 37 ° C pendant 24 à 48 heures. formation de spores peut être suivie par microscopie à contraste de phase. Les spores apparaissent phase tout lumineux végétative et cellules mères apparaîtront phase sombre. * En variante, les spores peuvent être purifiés à partir de 70:30 milieu liquide après 24 à 48 heures, ce qui donne 10 5 -10 6 spores par ml, en fonction de la strain utilisé.
  3. En utilisant une boucle d'inoculation stérile, racler les plaques et remettre en suspension les cellules dans 10 ml stérile 1x PBS.
  4. Jeter plaques et retirer la suspension de spores de la chambre anaérobie. Sédimenter les cellules à 3000 g pendant 15 minutes. Laver les cellules deux fois dans du PBS 1x, la remise en suspension entièrement le culot de cellules à chaque fois.
  5. Incuber pendant une nuit à 4 ° C pour faciliter la lyse des cellules végétatives et maternelles.
  6. Incuber à 70 ° C pendant 20 min pour tuer toutes les cellules végétatives résiduelles.
  7. Pour déterminer colonie unités (CFU) par millilitre, diluer en série chaque préparation de spores dans PBS 1x et la plaque sur BHIS + de taurocholate de sodium à 0,1%. Incuber les plaques pendant au moins 24 heures avant d'énumérer les colonies.
  8. Les spores peuvent être stockées dans du PBS 1x, soit à température ambiante ou à 4 ° C pour stockage à long terme. Si elles sont stockées à 4 ° C, il peut être utile de réchauffer la préparation de spores à 55 ° C pendant 15 minutes pour rétablir la germination efficace.

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Résultats

Un exemple de C. difficile cultivé sur BHIS Britannique et anaérobie moutons milieux de gélose au sang peut être vu sur la figure 2. C. difficile forme des colonies irrégulières qui sont à plat et possèdent un aspect de verre dépoli qui est évident sur ​​les deux médias. Ici, un isolat clinique érythromycine sensible de C. difficile, 630E 30, est cultivé sur gélose BHIS, un milieu non sélectif enrichi, pendant 24 heures à 37 ° C (Figure 2A). Colonie...

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Discussion

Les méthodes décrites ici permettent de récupération simple et rapide de C. difficile à partir d'une variété d'échantillons de matières fécales, y compris les humains, les souris et les hamsters, ainsi que le stockage à long terme de C. difficile comme le glycérol ou spores des stocks. C. difficile peut être un organisme difficile à cultiver, mais une maintenance rigoureuse d'un environnement anaérobie et l'application des techniques d'asepsie peut prévoir une forte croissa...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Nous tenons à remercier Coy laboratoires pour fournir aimablement des photos de la chambre anaérobie. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé subvention DK087763 (SMM) et un curriculum STEP / HHMI développement de la fraternité (ANE).

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Matériaux

TCCFA agar


24
24

4










BHIS Medium











SMC Sporulation Medium



424








70:30 Moyen

BactoPeptone 63 g
Protéase peptone 3,5 g
Infusion de cerveau et de cœur 11,1 g
Extrait de levure 1,5 g
(NH4)2SO4 0,7 g
Tris base 1,06 g

Pour les assiettes, ajouter 15 g d’agar. Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et de l’autoclave à 121 ° ; C pendant 20 min pour stériliser. Après l’autoclavage, ajouter 3 ml de L-cystéine à 10 % (p/v) (concentration finale, 0,03 %).

Blood agar

L’utilisation de plaques de gélose au sang de mouton anaérobie Columbia préfabriquées (Fisher Scientific, L21928)35 est recommandée.

1X Saline tamponnée au phosphate (PBS)

NaCl 8,01 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,27 g

Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Filtre Stériliser avant utilisation.
Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Proteose Peptone n° 2BD212120
Na2HPO4FisherS373
KH2PO4FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO4 (anhydre)FisherM65
á'...-FructoseFisherL96
Taurocholate de sodiumSigmaT4009
á'...-cyclosérineSigmaC6880
CefoxitinFlukaC4786
Cerveau cœur perfusion moyenBD237300
Proteose PeptoneBD211684
(NH4)2SO4SigmaA5132
Tris baseFisherBP152
AgarBD214010
L-cystéineSigmaC7755
BactoPeptoneBD211684
gélose au sang de mouton colombienFisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
GlycérolFisherBP2291
Boucles d’inoculation stérilesFisher22363596
Écouvillons stérilesFisher1495990
Coy Chambre anaérobie en vinyle et accessoiresCoy Laboratory Products, IncSpécifié par le clientCes articles sont commandés sur mesure selon les besoins
Materials<
du laboratoiretd colspan="4"> Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g NaHPO 5 g KHPO 1 g NaCl 2 g MgSO (anhydre) 0,1 g Fructose 6 g gélose 20 g Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et un autoclave à 121 ° ; C pendant 20 min pour stériliser. Après autoclavage, ajouter : 10 ml de taurocholate de sodium à 10 % (p/v), stérilisé par filtre (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,1 %) 25 ml de 10 mg/ml á'...-cyclosérine, stérilisé par filtre (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 250 &mu ; g/ml) 1,6 ml de céfoxitine à 10 mg/ml, stérilisée par filtre (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 16 &mu ; g/ml) Infusion de cerveau 37 g Extrait de levure 5 g Pour les assiettes, ajoutez 15 g d’agar. Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et de l’autoclave à 121 ° ; C pendant 20 min pour stériliser. Facultatif (ajouter après autoclavage) : 3 ml de L-cystéine à 10 % (p/v) (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,03 %) 10 ml de taurocholate de sodium à 10 % (p/v) (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,1 %) BactoPeptone 90 g Protéase peptone 5 g (NH)SO 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Porter à 1 L avec de l’eau déminéralisée et un autoclave à 121 ° ; C pendant 20 min à stériliser. Facultatif (ajouter après autoclavage) : 3 ml de 10 % (p/v) L-cystéine (dissoudre dans l’eau ; concentration finale, 0,03 %)

Références

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