L'étude des interactions de Staphylococcus aureus Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

Résumé

Nous présentons les méthodes pour étudier l'effet du PSM et d'autres toxines sécrétées par Staphylococcus aureus Sur les neutrophiles en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence.

Résumé

Nous présentons les méthodes pour étudier l'effet de modulins solubles phénol (PSM) et d'autres toxines produites et sécrétées par Staphylococcus aureus sur les neutrophiles. Pour étudier les effets des MPS sur les neutrophiles nous isolons neutrophiles frais en utilisant un gradient de densité centrifugation. Ces neutrophiles sont chargées avec un colorant fluorescent qui lors de la mobilisation du calcium. L'activation des neutrophiles par les MSP lance une augmentation rapide et transitoire de la concentration de calcium intracellulaire libre. Dans une expérience de cytométrie en flux cette mobilisation rapide peut être mesurée en surveillant la fluorescence d'un colorant pré-chargé qui réagit à l'augmentation de la concentration de Ca ^{2 +} libre. En utilisant cette méthode, nous pouvons déterminer la concentration de PSM nécessaire d'activer le neutrophiles, et de mesurer les effets des inhibiteurs spécifiques et générales de l'activation des neutrophiles.

Pour étudier l'expression des MPS dans l'espace intracellulaire, we ont construit fusions rapporteurs du promoteur de l'opéron PSMα à la GFP. Lorsque ces souches rapporteuses de S. aureus sont phagocytés par les neutrophiles, l'induction de l'expression peut être observée en utilisant la microscopie à fluorescence.

Introduction

Neutrophiles (PMN) sont des phagocytes professionnels qui jouent un rôle clé dans la réponse immunitaire innée contre le Staphylococcus aureus ^1. La bataille constante entre l'hôte et microbe a conduit à une course aux armements des deux. Récemment, la communauté-associés souches (CA) de résistant à la méticilline S. aureus (MRSA) ont vu le jour qui semble être très efficace dans la neutralisation des neutrophiles meurtre ^2,3. Modulin (PSM), la production soluble phénol excessif de CA-MRSA a été associée avec une plus grande virulence ^4,5. Neutrophiles humains peuvent reconnaître ces PSM via FPR2 qui conduisent à l'activation de cette protéine-G récepteur couplé à ^6. Un des premiers événements est la mobilisation des réserves intracellulaires de calcium (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} agit comme un messager secondaire pour une variété de fonctions effectrices des PMN dont la dégranulation et la phagocytose ^7. Par conséquent Ca ^{2 +} est un indicateur très sensible de lala capacité fonctionnelle du PSM pour activer PMN. Pour étudier les effets de PSM sur les neutrophiles, les neutrophiles frais sont isolées et chargées avec un colorant fluorescent qui lors de la mobilisation du calcium. Dans une expérience de cytométrie en flux cette mobilisation rapide peut être mesurée. En utilisant cette méthode, il est possible d'étudier les effets directs des composants toxiques et d'autres sur les neutrophiles, et de déterminer la concentration minimale à laquelle ceux-ci sont actifs. Pour nous, c'est un outil très utile pour étudier l'effet de nombreuses protéines produites par S. aureus impliquée dans l'évasion immunitaire, comme FPR2 protéine inhibitrice (FlipR) ^8, FlipR-like ⁷ et Chemotaxis protéine inhibitrice de Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Toutes ces protéines ont été montré pour empêcher la mobilisation du calcium dans les neutrophiles en se liant au récepteur reconnaissant l'agoniste.

Récemment, notre groupe a indiqué que les MSP sont fonctionnellement inhibés par les lipoprotéines du sérum ^{10 <}/ Sup>. Ces lipoprotéines sont abondamment présents dans le sang et les tissus humains, ce qui indique que les MSP exercent leur fonction principalement dans le milieu intracellulaire. La disponibilité du test de mobilisation du calcium permis de mesurer précisément l'effet des lipoprotéines du sérum sur l'activation des neutrophiles par les PSM, indiquée par l'inhibition considérable par de très faibles concentrations de sérum.

Depuis les PSM sont fonctionnellement inhibée par le sérum, nous avons émis l'hypothèse qu'il existe une fonction importante pour PSM que les toxines intracellulaires. Nous avons donc cherché à déterminer le rôle de PSM après phagocytose. Pour étudier l'expression des MPS dans l'espace intercellulaire, nous avons construit des fusions rapporteurs du promoteur de l'opéron psmα à la GFP. Lorsque ces souches rapporteuses de S. aureus ont été phagocytés par les neutrophiles, l'induction de l'expression était observable en utilisant la microscopie à fluorescence ^10. Évidemment, cette technique permet l'étude de l'expression d'un grand nombre de gènes de S. aureus ou d'autres agents pathogènes après phagocytose. Étant donné que pour S. aureus survivre dans la niche intercellulaire est très important pour surmonter le système immunitaire inné ^{11 10 12,} étudier le rôle des gènes activés dans ce créneau est très pertinente pour la compréhension de sa virulence.

Protocole

1. Isolation des PMN du sang humain par centrifugation par densité

1. Dessinez 5 9 tubes ml de sang veineux hépariné.
2. Préparer double couche gradients Ficoll (4 gradients de 5 tubes de sang), comme suit: verser 12 ml d'une solution de ficoll de densité 1,119 g / ml dans un tube de 50 ml et la couche soigneusement 10 ml d'une solution de ficoll de densité 1,077 g / ml sur le dessus.
3. Diluer le sang avec un volume égal de PBS.
4. La couche de sang dilué avec soin sur la couche double gradient Ficoll; 20-25 ml par gradient.
5. Centrifuger 20 min à 396 x g dans un rotor à godets oscillants, 22 ° C sans freinage.
6. Préparer RPMI froid contenant 0,05% de l'albumine sérique humaine (RPMI-HSA). Préparez aussi 9 ml stérile déminéralisée H ₂ O. Pré-cool à la fois le RPMI et H ₂ O sur la glace.
7. Aspirer la couche de Ficoll supérieure contenant le plasma (de couleur jaune) et des PBMC, et la seconde couche de Ficoll (couleur blanche) avec l'utilisation d'une pompe à vide (mettre une pointe de pipette stérile surla pipette).
8. Recueillir les PMN en tubes de 50 ml à l'aide d'une petite pipette en plastique (1 Tube pour les fractions de PMN tous les 2 gradients), et les placer sur la glace.
9. Ajouter froid RPMI-HSA pour un volume total de 50 ml et centrifuger pendant 10 min à 249 xg à 4 ° C.
10. Enlever le surnageant à l'aide d'une pompe à vide et le culot vortex doucement (érythrocytes et PMN).
11. Ajouter 9 ml stérile déminéralisée H ₂ O et lancer le chronomètre. Arrêter le choc osmotique hyper après 30 secondes exactement, en ajoutant 1 ml 10 fois concentré PBS. Note: le 30 sec sont très critiques.
12. Ajouter froid RPMI-HSA pour un volume total de 50 ml et centrifuger pendant 10 min à 249 xg à 4 ° C.
13. Enlever le surnageant à l'aide d'une pompe à vide et de recueillir le PMN culot dans 1 tube avec un volume défini (2.1 ml) de milieu RPMI-HSA.
14. Déterminer la quantité de cellules et ajuster la concentration de 1.10 ⁷ cellules / ml. Selon le donateur, le rendement du PMN isolés sont betweFR 5 x 10 ⁶ et 3 x 10 ⁷ PMN de chaque tube 9 ml de sang

2. Débit Assay Cytometric pour l'évaluation de la mobilisation de calcium dans PMN humains

1. Les cellules de charge (5 x 10 ⁶ cellules / ml) avec 2uM Fluo-3-AM dans RPMI-HSA et incuber pendant 20 min à température ambiante bascule lentement, en utilisant par exemple une plate-forme à bascule shaker, à l'abri de la lumière.
2. En attendant préparer une dilution en série (par exemple 3 fois) du stimulus à 10x la concentration finale. PSMα3 est utilisé dans ce protocole, mais tout stimulus de GPCR qui agit sur les neutrophiles est approprié.
3. Préparer inhibiteur concentré 10x du récepteur dans RPMI-HSA. Lorsque l'inhibiteur agit sur ​​la stimulation (par exemple HDL sur PSMα3) pré-incuber 25 stimulus ul avec un volume égal d'inhibiteur pendant 10 min à température ambiante.
4. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de RPMI-HSA et centrifugeuse pour 249 g à température ambiante. Remettre les cellules à 5 x10 ⁶ cellules / ml.
5. Juste avant l'expérience, diluer les cellules à 2x10 ⁶ cellules / ml dans du RPMI-HSA et ajouter 200 pi de cellules par tube FACS. PMN dilué sont très fragiles. Les garder trop longtemps à cette concentration va conduire à l'activation automatique; la même chose pour secouer vigoureusement ou pipetage.
6. Attachez le tube à la cytométrie en flux, attendre 3 secondes et lancer l'acquisition. Après une période de temps fixe (par exemple 8 sec), enlever le tube et ajouter rapidement 50 stimulus ul de l'échantillon. Immédiatement ré-attacher le tube sur le porte-échantillon et de continuer l'acquisition.
7. Commencez par le bas et à la fin avec la plus forte concentration de stimulus. Laver l'aiguille de cytomètre de flux régulièrement après chaque course avec RPMI-HSA.
8. Analyser des données avec le logiciel d'analyse de cytométrie en flux. Comparer le signal de fluorescence moyenne avant l'ajout du stimulus pour que, après plus de stimulus et d'utiliser les contrôles positifs et négatifs appropriés pour calculer l'acrésistance à la vation mesurée pour chaque dilution.

En variante lorsque l'inhibiteur agit sur les récepteurs de pré-incuber les cellules avec l'inhibiteur.

3. Analyse par microscopie de fluorescence de la GFP bactéries expression après phagocytose par les PMN

1. Croître S. souches de Staphylococcus contenant une construction reporter d'intérêt pendant la nuit dans un bouillon (avec des antibiotiques lorsque cela est nécessaire pour maintenir le plasmide rapporteur). Dans ce cas, la souche de MW2 contenant une construction rapporteur GFP PSMα ¹⁰ est utilisé, cultivées dans un tube en matière plastique de 50 ml avec 5 ml de milieu de culture LB.
2. Pour supprimer tous GFP de l'expression O / N, diluer les cultures à OD ₆₆₀ 0,01 croître et à OD ₆₆₀ 0.1. Redilute ce 1h30 de culture, et de surveiller la croissance jusqu'à ce que la culture atteint une _DO660 de 0,1. Recueillir les bactéries par centrifugation et les laver une fois dans DPBS. Reprendre en 1h10 du volume initial pour obtenir une DO ₆₆₀ de 1,0 ou roughly 5.10 ⁸ ufc / ml.
3. Mélanger les bactéries (1.10 ⁷ / ml) avec PMN fraîchement isolés (1.10 ⁶ / ml) dans du RPMI-HSA (10:1) dans un microtube de 1,5 ml et ajouter le sérum humain mis en commun à une concentration finale de 10%. Secouez sur une plate-forme agitation pendant 10 min à 37 ° C pour stimuler la phagocytose. Diluer les PMN chargées de bactéries à 5.10 ⁵ PN / ml et pipette 250 ul dans un puits d'une lamelle bien chambré 8.
4. Image PMN avec des bactéries sur un microscope. Un microscope inversé équipé d'un objectif NA 40X/0.85 fonctionne bien et ne doit être enfermé dans une chambre à environnement sombre pour maintenir l'environnement de manière stable à 37 ° C. Acquérir les images pour un certain nombre de positions prédéfinies à l'aide de la caméra toutes les 5-10 min à la fois dans le champ lumineux et le canal GFP de suivre la production de GFP dans le temps.

Résultats

Débit test de cytométrie pour l'évaluation de la mobilisation du calcium dans les PMN humains

Incuber des neutrophiles avec une série de concentrations de PSMα3 synthétiques résultant en une activation rapide, tel que mesuré par le flux de calcium, qui est représenté par une augmentation du signal dans FL-1. La pré-incubation de synthèse PSMα3 avec 0,01%, 0,1% ou 1% de sérum humain inhibé de manière significative la capacité de susciter des flux de calcium (Figure 1).

Discussion

Dans les procédés décrits ici quelques étapes sont très critiques. Nous allons mettre en évidence ces ici.

Pour l'isolement des neutrophiles par centrifugation en gradient de densité, il est important de ne pas perturber les couches pendant ou après les étapes de centrifugation. Lors de l'aspiration des neutrophiles à l'aide d'une pipette en plastique, assurez-vous de ne pas presser le ballon alors que dans la couche de cellules, comme éjecter un liquide va perturber les couc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fluo-3, AM	Sondes moléculaires / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	densité 1,077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	densité 1,119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contient 25 mM HEPES et L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystèmes, Pays-Bas	TCS SP5	objectif : HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Il est très important que le tube puisse être retiré et remplacé pendant le processus de mesure