Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse

Résumé

Ce document décrit l'application de la microscopie électronique cryoanalytical à la mesure quantitative de la teneur en calcium total et la répartition à la résolution subcellulaire dans des échantillons biologiques physiologiquement définies.

Résumé

Dans cet article, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour des mesures quantitatives de contenu élémentaire intracellulaire en utilisant la technique dite de la microsonde électronique (EPMA) sont décrits. Calcium intramitochondrial est une attention particulière en raison du rôle essentiel que la surcharge calcique mitochondriale joue dans les maladies neurodégénératives. La méthode est basée sur l'analyse des rayons X générés dans un microscope électronique (EM), par l'interaction d'un faisceau d'électrons avec l'échantillon. Afin de maintenir la distribution d'éléments native diffusibles dans les échantillons en microscopie électronique, EPMA nécessite "cryofixation" du tissu suivie de la préparation de coupes cryogéniques ultraminces. La congélation rapide des cellules en culture ou des cultures de tranches organotypiques est effectuée par congélation plonger dans de l'éthane liquide ou un gel par le claquement contre un bloc de métal froid, respectivement. Cryocoupes nominalement 80 nm d'épaisseur sont coupées à sec avec un couteau de diamant à ca. -16076, C, monté sur carbone / grilles de cuivre pioloform revêtu, et cryotransferred dans un cryo-EM en utilisant un support de cryospecimen spécialisé. Après inspection visuelle et la cartographie de l'emplacement à une température ≤ 160 ° C et une faible dose d'électrons, cryosections congelés-hydraté sont lyophilisés à -100 ° C pendant ~ 30 min. les images au niveau des organites de cryosections séchées sont enregistrées, également à faible dose, au moyen d'une caméra CCD à balayage lent et les régions sous-cellulaires d'intérêt sélectionné pour analyse. les rayons X émis par ROI par une sonde fixe, concentré, à haute intensité électrons sont collectés par un X-ray à dispersion d'énergie (EDX) spectromètre, traitée par l'électronique associée, et présenté comme un spectre de rayons X, qui est un terrain de l'intensité des rayons X vs énergie. Logiciel supplémentaire facilite: 1) l'identification des composants élémentaires par leur énergie et leur empreinte digitale de pointe «caractéristiques», et 2) l'analyse quantitative par extraction de zones de pic / fond. Ce document se termine par deux exemples qui illustrent typiqueApplications EPMA, celui dans lequel l'analyse du calcium mitochondrial fourni des informations essentielles sur les mécanismes de blessures excitotoxic et un autre qui a révélé la base de la résistance à l'ischémie.

Introduction

Les ions calcium sont sans doute entité de signalisation cellulaire le plus important et polyvalent en biologie, en jouant un rôle essentiel dans les processus normaux aussi divers que la transmission synaptique et l'expression des gènes. D'autre part, le calcium est également important dans la mort cellulaire. En particulier, la déréglementation de calcium est un facteur clé dans les lésions neuronales dans l'AVC, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et autres maladies neurodégénératives ^3,5. Ainsi, il est important de comprendre quantitativement comment le calcium est distribué dans les cellules, et comment cela change suivant ....

Protocole

L'approche décrite ici a été développé en utilisant des instruments, des outils et des logiciels. Parce que les laboratoires ne seront pas utiliser le même dispositif expérimental de la démarche est généralisée, si possible.

Une. La congélation rapide

La méthode d'analyse d'être décrite est tout à fait dépendante de méthodes cryogéniques pour: 1) la "cryofixation" des cellules ou des tissus d'une manière qui préserve quantitativement la distribution des composants des tissus diffusibles et éléments chimiques comme ils l'étaient dans des cellules vivantes à l'instant de congélation et 2) l....

Résultats

Les cellules du cerveau subissent généralement des blessures excitotoxic à la suite de la libération de neurotransmetteurs pathologique qui se produit dans des conditions ischémiques. EPMA était essentiel pour découvrir comment la capacité des mitochondries neuronales pour séquestrer des quantités massives de calcium sous-tend le mécanisme de la blessure. La micrographie électronique de la figure 3 illustre l'aspect des mitochondries dans les cryosections lyophilisées de neurones d'hippocampe en culture.......

Discussion

La méthode analytique basée microscope à électron présenté ici permet la détection, l'identification et la quantification de plusieurs éléments d'intérêt biologique, notamment Na, K, P, Ca et surtout. Ces analyses peuvent être effectuées à subcellulaire, soit intra-organite, la résolution en raison de la capacité de localiser et d'identifier les structures d'intérêt dans les images de haute qualité de cryosections préparés à partir de spécimens congelés rapidement. Notez qu'aucune coloration.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox lamelles en plastique	Thermo Fischer Scientific	72280
Inserts de culture	BD Falcon	353090	Pour plaques à 6 puits
Cryopins	Leica Microsystems	16701952
Applicateurs en bois	EM Sciences	72300
Grilles EM pliantes	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Feuille d’indium	Alfa Aesar	13982	0,25 mm d’épaisseur
EQUIPMENT
Appareil de congélation plongeante	Leica Microsystems	KF-80
Appareil de congélation Slam	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryofixation pour microtome	Leica Microsystems	FC6
Outil de cryorognage diamant	Diatome	Cryotrim 45
Cryoknife diamant	Diatome	Cryo 35
Dispositif antistatique	Diatome	Hauf Ligne statique
Cryomicroscope électronique	Carl Zeiss Microscopie	EM912 Omega
Porte-échantillon cryogénique EM	Gatan	CT3500
Caméra CCD à balayage lent, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Logiciel
d’acquisition d’images	Olympus SIS	iTEM suite
Détecteur de rayons X ED	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Processeur d’impulsions	Oxford Instruments	XP-3
Fond de panier PCI carte	4pi Systems	Spectral Engine II
Ordinateur de bureau	Apple	Tout modèle
Logiciel d’analyse par rayons X	NIST	DTSA, DTSA II
Tableur	Microsoft	Excel
Le CF100 n’est plus vendu dans le commerce, bien que l’appareil soit disponible dans de nombreux établissements universitaires, et des machines ou des pièces complètes peuvent être trouvées en ligne. Un tutoriel vidéo pour le support de cryotransfert CT3500 est disponible à l’adresse http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. Le SEII est obsolète ; le moteur spectral universel est un produit ultérieur, compatible avec les PC, avec des fonctionnalités comparables. 4pi a cessé sa fabrication et ses ventes, mais fournit toujours un support technique à la clientèle. Les systèmes usagés se trouvent souvent en ligne. La DTSA originale est désormais obsolète. Le NIST propose dans le domaine public un successeur mis à jour, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)

rainuré compatible OS9