Levure et luminométrique Xenopus ovocytes électrophysiologiques examens de la mécanosensibilité moléculaire de TRPV4

Résumé

Pour compléter les méthodes couramment utilisées pour étudier TRPV4 de, deux méthodes sont décrites: Son mécanosensibilité peut être étudiée par le Ca ^{2 +} luminométrie-aequorine dans la levure transgénique lors de l'épreuve de l'hypo-osmotique. Il peut également être consultée en TRPV4-ARN injecté des ovocytes de Xenopus par cellule entière à deux électrodes de verrouillage de tension ou de patch clamp dans la cellule ou le mode excisé.

Résumé

TRPV4 (Transient Receptor potentiels, famille vanilloid, type 4) est largement exprimée dans les tissus des vertébrés et est activée par plusieurs stimuli, y compris par des forces mécaniques. Certaines mutations de TRPV4 provoquent os héréditaire complexe ou pathologies neuronales chez l'homme. De type sauvage ou mutant TRPV4 transgènes sont souvent exprimés dans des cellules de mammifères en culture et examinés par Fura-2 fluoro et par des électrodes. En termes de mécanisme de mécanosensibilité et les bases moléculaires des maladies, la littérature actuelle est confuse et controversée. Pour compléter les méthodes existantes, nous décrivons deux méthodes supplémentaires pour examiner les propriétés moléculaires de TRPV4. (1) Rat TRPV4 et un transgène de l'aequorine sont transformées en levure bourgeonnante. Un choc de la population de transformants hypo-osmtic donne un signal de luminométrique due à la combinaison de l'aequorine avec Ca ^{2 +,} libéré par l'intermédiaire du canal de TRPV4. Ici TRPV4 est isolé de ses protéines partenaires de mammifères habituelleset révèle sa propre mécanosensibilité. (2) l'ARNc du TRPV4 est injecté dans des ovocytes de Xenopus. Après une période d'incubation appropriée, le courant de TRPV4 macroscopique est examiné avec un voltage imposé à deux électrodes. La montée du courant lors de l'enlèvement de osmoticum inerte du bain d'ovocyte est indicative de mécanosensibilité. Les micro-ampère (10 ^-6 à 10 ^-4 A) courants de ovocytes sont beaucoup plus grandes que les subnano à nanoampère (10 ^-10 à 10 ^-9 A) courants de cellules en culture, ce qui donne quantifications plus claires et des évaluations plus confiants. Courants microscopiques reflétant les activités de protéines de canaux individuels peuvent aussi être directement enregistrés sous un patch-clamp, dans la cellule ou le mode excisée. Le même ovocyte fournit de multiples échantillons de brassage, permettant la réplication de meilleures données. Aspirateurs appliqués aux correctifs peuvent activer TRPV4 à évaluer directement mécanosensibilité. Ces méthodes devraient également être utiles dans l'étude d'autres types de canaux TRP.

Introduction

PST (potentiels de récepteurs transitoires) comprennent sept sous-familles de canaux cationiques qui remplissent des fonctions sensorielles ^1,2. Chez les mammifères, TRPV, la sous-famille vanilloid de PST, a six variétés. TRPV4 (type 4) ^3,4 réagit à la chaleur, certains produits chimiques, gonflement osmotique, ou contrainte de cisaillement. Le gène a été maintes fois TRPV4 isolé par candidat-gène et / ou de clonage d'expression ^8.5. Cette dernière méthode suivie de la réponse du gène produit hypo-osmolarité. TRPV4 est exprimée dans presque tous les organes et les fonctions dans le développement, la physiologie, la pathologie ou de nombreux types de cellules disparates ^3,4.

Frappant sont les> 50 autosomiques dominantes humaine mutations TRPV4, entraînant des neuropathies périphériques et / ou les dysplasies squelettiques (anomalies dans le développement du squelette) ^9-11. Vont les dysplasies squelettiques de légère type brachyomia 3 (type 3 nanisme), la dysplasie spondylométaphysaire Type Kozlowski, de Sèvere dysplasies, certains causant la mort néonatale ou embryonnaire. Bien que toutes les manières de mécanismes semblent possibles, aucun explique la diversité, la complexité, la variabilité, et parfois des chevauchements de ces maladies ^4.

Comme les autres canaux TRP ^1, TRPV4 est un tétramère. Chez le rat ou TRPV4 humaine, chaque sous-unité est composée de 871 résidus. Son élément central est le six hélices transmembranaires (S1 à S6), qui sont probablement disposés d'une manière similaire à des canaux K ⁺ voltage-dépendants. Là, S1 à S4 forment un domaine périphérique et S5 et S6 forment le domaine perméation de pores. Entre S5 et S6 de TRPV4 est une hélice de pores court suivi par la séquence de LDLFKLTIGMGDL, quatre d'entre elles convergent vraisemblablement pour former le filtre de cations. Le segment cytoplasmique N-terminal de 470 résidus contient 6 répétitions ankyrine, connus pour se lier des protéines ou des petits ligands. Le segment cytoplasmique de 152 résidus C-terminale comprend une séquence liant la calmoduline parmi d'autres sites possibles qui se lient otses éléments ^3.

TRPV4 est un canal cationique qui exclut essentiellement des anions ^1. Bien que sa fonction physiologique est de transduire des stimuli d'influx de ^{Ca2 +,} il est également perméable à d'autres cations avec une séquence de perméabilité Eisenman IV, favorisant divalent à un P _Ca: P _Na ~ 7 ^12. Monocanal conductance rectifie à ~ 90 pS vers l'extérieur et vers l'intérieur ~ 40 pS ^6,13,14. Hétérologue exprimé actuel (ci-dessous) peut être activé par une hypo-osmotique gonflement, contrainte de cisaillement, ou la chaleur ^15. Il est également activé par les acides gras poly-insaturés ^16,17 et l'ester synthétique phorbal 4αPDD ^18. À l'heure actuelle, l'agoniste le plus puissant est GSK1016790A ¹⁹ et antagoniste est GSK2193874, efficace dans 10 ^-9 à 10 ^-8 M ^20, à la fois découvert par haut débit écran, petit-moléculaire.

Deux domaines clés de la recherche TRPV4 restent confus: (1) Même si TRPV4 est largement étudié pour son mécanosensibilité, sa base moléculaire est controversée. Un modèle décrit hypo-osmolarité active en quelque sorte la phospholipase A2 (PLA2) pour produire l'acide gras polyinsaturé (AGPI) de l'acide arachidonique (AA), qui est converti en époxyeicosatriénoïques acide (EET) par une époxygénase, et la liaison des EET active TRPV4 ^{16, 17.} Pourtant, TRPV4 s'est montré à répondre directement à l'étirement de la membrane ¹⁴ (ci-dessous), en fournissant une explication plus simple. (2) Les pathologies mutantes TRPV4 sont déconcertantes. À la base, il faut savoir si les maladies sont dues à la perte, la réduction ou l'augmentation des activités de canal. Même ici, la littérature est loin d'être claire. Alors que plusieurs allèles squelettique dysplasie ont été signalés à avoir des activités plus élevés, (gain de fonction, GOF) ^4,21, plusieurs auraient réduit leurs activités (perte de fonction, LOF) ^10,22. Une étude systématique de 14 allèles les a trouvéstoutes les mutations être GOF (ci-dessous) ^23. L'affirmation selon laquelle certains sont LOF semble contredire le phénotype de TRPV4-/ - souris knock-out, qui sont viables ou fertiles, avec seulement des défauts mineurs, en dépit d'une perte complète de la fonction TRPV4.

Une partie de ces controverses est d'origine méthodologique. Les laboratoires utilisent des méthodes différentes, ou des variantes d'une méthode, et utilisent différentes normes de jugement. Le plus souvent, TRPV4 est exprimé transitoirement dans des cellules de mammifères en culture (HEK, CHO, HeLa) et la montée de l'intérieur [Ca ^{2 +]} sur agoniste ou stimulation hypotonique est enregistré auprès de la Ca ^{2 +} colorant fluorescent sensible, Fura-2. Le recours excessif à ce dosage fluorimétrique a été critiquée ^1. Le niveau d'expression dans les différentes populations, la distribution dans celui-ci, ainsi que la concentration de colorant efficace, doivent être contrôlés et documentés. Plus fiable est les examens électrophysiologiques directs. Même, comme commonly pratique, n'est pas non plus sans problèmes. Etant donné que les niveaux d'expression dans les cellules cultivées individuels sont difficiles à contrôler, les courants de cellules entières ont de grandes variations. En outre, parce que les courants sont faibles, des statistiques fiables devront s'appuyer sur de grands échantillons, souvent pas pratiques. Examens de patch-clamp ont rarement été effectuées. Certains de ces enregistrements montrent des grappes de salves d'activité qui font l'évaluation statistique difficile ^16,17.

Pour mieux comprendre la mécanosensibilité moléculaire, nous avons développé deux systèmes supplémentaires pour examiner TRPV4. (1) Pour isoler TRPV4 loin de ses partenaires habituels de mammifères, nous avons exprimé TRPV4 rat dans la levure bourgeonnante ^24. L'expression fonctionnelle de TRPV4 dans ce contexte évolutif lointain a montré qu'il pouvait encore répondre à la force osmotique sans ses partenaires habituels. Parce que la levure ne fait aucune AGPI tels que AA ou EET, et son génome a pas de gènes de PLA2 ou époxygénase, ce EXPREssion montre aussi qu'ils ne sont pas tenus pour TRPV4 pour détecter la force. Avoir TRPV4 chez les eucaryotes biologiquement mieux gérées moléculaire permet également manipulations efficace avant ou inversée génétiques ^25. (2) Pour les analyses biophysiques en profondeur de TRPV4, nous avons exprimé TRPV4 dans des ovocytes de Xenopus. Contrairement aux cellules en culture, qui donnent des sous-nA nA à (10 ^{-10 et} 10 ^-9 A) courants, un ovocyte exprime courants dans de pA (10 ^-6 à 10 ^-4 A). Beaucoup plus grand signal sur bruit permet une meilleure quantification et la comparaison plus confiant. TRPV4, ainsi exprimée, peut également être consultée en tant que molécules individuelles à l'aide d'un patch-clamp. Un seul ovocyte permet correctif échantillonnage répété, encore une fois faire une quantification plus fiable. Ces études ont montré que TRPV4 canal lui-même peut être directement activée par la force d'étirement de la membrane ^14. Les analyses ont aussi montré que 14 représentatifs allèles squelettique dysplasie sont toutes les mutations gain de fonction. En outre, le degree de ce Ca ^{2 +} fuite constitutive est parallèle à la gravité des maladies du squelette ^23.

En raison de leur nouveauté et de l'utilité, les procédures détaillées de ces deux méthodes sont réunis ici pour permettre à répétitions dans les recherches futures sur TRPV4 ou des canaux similaires.

Protocole

Une. Méthodes de levure luminométrie

Utilisez souche BYYT de Saccharomyces cerevisiae. Il est un dérivé de tok1 yvc1 de BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformer des cellules avec les pEVP1/Aeq plasmidiques Leu-sélectionnable aequorine exprimant et le rat-TRPV4 exprimant le plasmide d'ura-sélectionnable p416GPDV4, comme décrit dans Batiza et al. ²⁶ et Loukin et al. ²⁴ utilisation des procédés classiques de construction de plasmide et la transformation ²⁷ . La souche de levure et des plasmides sont disponibles sur demande.

1. Culture 2 ml de cellules de levure pendant la nuit à la phase post-logarithmique dans un shaker 30 ° C dans leu-ura-"DCD" moyen de décrochage ²⁸ (une variante de sulfate appauvri du milieu CMD-leu-ura ^29), complété par du sorbitol 1 M . Ensemencer 200 ul de ces cultures dans 1,8 ml de milieu frais supplémenté avec 2 uM de la luciferin coelentérazine. Croître à l'obscurité à la température ambiante pour un autre 24 heures sans agitation.
2. Mesurer l'osmolarité de la culture (typiquement à 1 400 mOsM) et à d'autres solutions (ci-dessous) à l'aide d'un osmomètre à pression de vapeur.
3. Aliquote de 20 ul de culture frais dans un tube de luminomètre 12 mm pour un même luminomètre du tube.
4. Pour le choc hypotonique, ajouter 200 ul d'une solution contenant 25 mM NaEGTA (pH 7,2) ou des noms (pH 7,2) et NaCl 500-100, (osmolarité totale de 1,200-400 mOsM) selon le degré de choc souhaitée. Surveiller en permanence la luminescence avant et au moins 120 secondes après le downshock osmotique, interrompu seulement par la brève opération de dilution. Enregistrer la sortie de luminomètre sur un ordinateur de bureau sous forme d'unités relatives de luminescence (RUL).

Bien que n'étant pas à l'étude des TRPV4 transgénique, on a utilisé une variante du protocole ci-dessus dans un système automatisé d'examiner les réponses d'un grand nombre de souches de levure. Étude of les réponses à ^l'hypo-30 ou ³¹ hyperosmotiques stimuli du deletome de levure (la collection de levures 4906 deletion de gène unique) en utilisant un luminomètre pour microplaques et analysées avec le logiciel correspondant a été couronnée de succès.

2. et 3. Ovocytes méthodes d'électrophysiologie

Électrophysiologie utilise des méthodes de base ^32. Amplifier par PCR le cadre ouvert de lecture de type sauvage ou mutant TRPV4 utilisant la haute-fidélité PfuUtra polymérase et intégré dans pGH19 ^33. Cela implique une insertion précise de l'ORF entre les 5 'et 3' UTR du gène de la β-globine de Xenopus et en aval d'une T7 ARN-polymérase promoteur. Linéariser le produit d'assemblage en aval de l'UTR en 3 'et utilisées comme matrices dans une réaction in vitro T7 ARN polymérase dans des. Utiliser des techniques de biologie moléculaire standards ^34.

Utilisez V-VI ovocytes stade de X. laevis. L'élevage, ovariecto partiellemon enveloppe enlèvement defolliculation, et vitelline suivre les procédures standard ^32,33,35. Injecter 2-40 ng de solution ARNc par ovocyte à l'aide d'un micro-injecteur automatique Drummond Nanoinject II. Injecter ~ 30 ovocytes pour chaque série d'expériences. Après l'injection de l'ARNc-TRPV4, incuber les ovocytes dans le milieu ND96 avec de la gentamicine (100 pg / ml) et 1 uM de rouge de ruthénium ^14.

2. Deux Voltage Clamp Electrode

1. Tirez borosilicate pipettes d'enregistrement de verre de précision jetables micropipettes 100 pi individuellement avec un extracteur de pipette.
2. Tirez la fois la tension de mesure et des électrodes de pipette d'injection de courant sont tiré d'avoir une ouverture d'environ 1 um de diamètre à la pointe.
3. électrodes de remblayage avec 2 M KCl entraîne 0,1-0,2 résistance mQ. Monter sur headstages HS2A, qui avec une pince de bain virtuel-terre VG-2Ax100, sont connectés à une interface amplificateur GeneClamp 500 par un numériseur Digidata 1440. Acquérir données à l'aide du logiciel pClamp10.
4. Placez l'ovocyte à tester dans un bain de 1 ml dans une chambre de plastique fabriqué monté sur la scène d'un microscope binoculaire avec un grossissement de 20x. La solution de bain est à la masse virtuelle par un pont d'agar 3 M de KCl et d'un fil d'argent chlorée placé à proximité de l'ovocyte et relié à un étage de masse virtuel VG-2A.
5. Construire la chambre pour la perfusion continue avec tuyaux en plastique comme entrée de solution et de sortie. Raccorder la tubulure d'entrée est relié à un système de perfusion fabriquée, qui est un multiple de six coquilles 50 ml de seringues, chacune remplie avec une solution différente. taux d'une solution particulière d'alimentation par gravité est contrôlée à ~ 2-3 ml / min à l'aide "Keck" pinces de rampe sur les tuyaux.
6. Montez les deux électrodes avec leurs headstages sur micromanipulateurs. Effectuez des pénétrations d'électrodes de l'ovocyte par micromanipulation.

3. Patch Clamp examen de Direct mécanosensibilité

»> Les méthodes de base de patch clamp y compris la préparation de la pipette, formation GQ-joint, et la formation de cellules ou sur les modes excisées sont ceux Hamill et al. ³⁶ et ³² Conn.

1. Remplir des pipettes en verre de borosilicate ayant un diamètre d'environ 1 um d'ouverture à l'extrémité (numéro de bulle 5-6) avec 98 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2 et 10 mM de K ^+-HEPES, pH 7,2.
2. Attacher la pipette de patch-clamp à travers un tube en plastique à une seringue de 5 ml et à travers un raccord en T, également à un manomètre. Utilisez un ordinateur pour gérer à la fois l'électrode et les sorties de manomètre. Acquérir des données à 10 kHz, et ensuite à la lecture à travers un filtre huit pôles Bessel à 1 kHz pour analyse.
3. Différents patchs peuvent être excisées du même ovocyte à plusieurs reprises. Cette pratique fait l'examen de l'activité moléculaire de TRPV4 plus efficace et fiable.

Résultats

Dans une expérience typique de la luminométrie, une gamme de 400-1,200 mOsm chocs hypotoniques vers le bas est réalisée en ajoutant 200 ul de solutions de choc de faible osmolarité différente de 20 ul de la culture à 1400 mOsM. L'activité de TRPV4 est évident lorsque la RLU du expérimental est comparée à celle de deux témoins négatifs: les cellules de levure transformées avec le vide p416GPDV4 plasmide ou un qui contient le gène de la TRPV4 avec une mutation au niveau du filtre ionique (fig...

Discussion

Comme indiqué dans l'introduction, les méthodes couramment utilisées pour étudier les fonctions de TRPV4 parfois donné lieu à des incohérences et des controverses. Les deux ensembles de méthodes décrites ici offrent des avantages et peuvent compléter les méthodes existantes. Bien que nous décrivons seulement les études sur TRPV4, les méthodes peuvent être étendues à étudier d'autres canaux ioniques ainsi.

Une. Méthodes de levure luminométrie

Levure bourgeon...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Osmomètre à pression de vapeur	Wescor	Wescor 5500	Logan, UT, USA
Sirius Luminomètre à tube unique  ;	Titertek-Berhold	Sirius	Huntsville, LA, USA
Luminomètre sur microplaques	Titertek-Berthold	Mithras LB940	Huntsville, LA, USA
Logiciel de luminométrie	Titertek-Berthold	MikroWin2000	Huntsville, LA, USA
Patch clamp et logiciel	Axon Instrument	HS2A headstage, VG-2Ax100 pince de bain virtuelle mise à la terre, amplificateur GeneClamp 500, numériseur digidata 1440, Logiciel pClamp10	Union City, CA, États-Unis
Manomètre	Bio-Tec		Winooski, VT, États-Unis
Extracteur de pipette	Sutter Instrument Co	Modèle P-97	Novata, CA, États-Unis
Microinjecteur	Drummond Scientific	Nanoinject II	Broomall, PA, États-Unis
Luciferine coelenterazine	Invitrogen		Carlsbad, CA, États-Unis
T7 ARN polymérase réaction	Ambion	mMessage mMachine	Austin, TX, États-Unis
Gentamicin	Sigma		;
Rouge de ruthénium  ;	Sigma		;
Micropipettes  ;	Drummond	100 microlitres micropipets	Broomall, PA, USA
Haute fidélité PfuUtra polymérase  ;	Stratagene		La Jolla, Californie, États-Unis