Procédé de préparation de lame pour préserver l’architecture de chromatine tridimensionnelle de cellules germinales testiculaires

Résumé

Le matériau décrit ici une méthode développée pour préserver la structure tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires. C’est ce qu’on a appelé la méthode de glissement tridimensionnelle (3D). Cette méthode améliore la sensibilité pour la détection des structures subnucléaires et est applicable à l’hybridation in situ par immunofluorescence, ADN et fluorescence de l’ARN (FISH).

Résumé

Au cours de la différenciation des cellules germinales testiculaires, la structure de la chromatine nucléaire change dynamiquement. Ce qui suit décrit une méthode conçue pour préserver la disposition tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires trouvées chez la souris; cette méthode a été appelée méthode de glissement tridimensionnelle (3D). Dans cette méthode, les tubules testiculaires sont directement traités par une étape de perméabilisation qui élimine le matériel cytoplasmique, suivie d’une étape de fixation qui fixe les matières nucléaires. Les tubules sont ensuite dissociés, la suspension cellulaire est cytospun et les cellules adhèrent aux lames. Cette méthode améliore la sensibilité à la détection des structures subnucléaires et est applicable à l’hybridation in situ par immunofluorescence, ADN et fluorescence arn (FISH) et à la combinaison de ces méthodes de détection. À titre d’exemple d’application possible de la méthode de lame 3D, un FISH à ARN Cot-1 est montré pour détecter les ARN naissants. La méthode de lame 3D facilitera l’examen détaillé des relations spatiales entre la structure de la chromatine, l’ADN et l’ARN lors de la différenciation des cellules germinales testiculaires.

Introduction

Dans les testicules, les cellules germinales se différencient des spermatogones diploïdes par méiose en spermatozoïdes matures et haploïdes. Au cours de ce processus, la structure de la chromatine nucléaire des cellules germinales est continuellement et dynamiquement remodelée. Les étalements de surface sont couramment utilisés pour l’examen cytologique des cellules spermatogéniques individuelles. Une méthode dominante d’étalements de surface emploie un traitement hypotonique par lequel les cellules spermatogéniques individuelles sont étalées et aplatir¹. Ces conditions sont optimales pour l’analyse détaillée des chromosomes méiotiques. Des dispositifs chro....

Protocole

1.3D Préparation des diapositives

1. Préparez les réactifs suivants :
   1. Tampon CSK: NaCl 100 mM, saccharose 300 mM, TUYAUX 10 mM, MgCl 3 mM_2. Ajuster le pH à 6,8 avec 1 M NaOH. Stockez la mémoire tampon CSK à 4 °C.
   2. Tampon CSK avec 0,5 % de Triton X-100 : Ajouter 200 μl de Triton X-100 à 40 ml de tampon CSK. Mélanger la solution à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu’à ce que le Triton X-100 soit complètement dissous. Conservez le tampon CSK avec 0,5 % de Triton X-100 à 4 °C.
   3. Paraformaldéhyde (PFA) – PBS à 4 %, pH 7,4 : Dissoudre 4 g de PFA dans environ 70 à 80 ml d’eau. Afin d’accélérer le processus de dissolution, ajout....

Résultats

Un résultat représentatif d’une diapositive 3D est illustré à la figure 2. Dans cette expérience, Cot-1 RNA FISH a été réalisée pour détecter la transcription naissante ainsi que l’immunomarquage à l’aide d’anticorps anti CBX1 et γH2AX. Pour combiner l’ARN FISH et l’immunomarquage, l’immunomarquage a été réalisé en premier, suivi de l’ARN FISH comme décrit en^3. CBX1 est une protéine d’hétérochromatine qui se localise à l’hétérochromatine péricentromérique et aux chromosomes sexuels silencieux .......

Discussion

Dans la préparation de la lame 3D, l’étape de perméabilisation précède l’étape de fixation. Ces étapes sont effectuées directement sur des tubules séminifères, préservant ainsi la structure tridimensionnelle de la chromatine. Une autre option pour préserver la structure de la chromatine pour l’ARN/ADN FISH est d’effectuer l’étape de perméabilisation et l’étape de fixation simultanément. Cette technique alternative a été réalisée dans des cellules germinales marsupiales et chez des embryons de préimplantation de souris

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ADN de Cot-1  ;	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Tagent		300380
Solution d’ADN de spermatozoïdes de hareng	Invitrogen	15634-017
Éthanol. 200 proof (absolu)	Pharmco-aaper	111000200
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S2889
Formamide désionisé	American Bioanalytical	AB00600-00500
Citrate de sodium tribasique dihydraté	Sigma-Aldrich	C8532
Albumine sérique bovine	Lifeblood Medical	77110-100
Sulfate de dextran sel de sodium de Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	76240
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	221465
Solution saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Milieu de montage avec DAPI	Vector Laboratories	H1200
Complexe ribonucléoside-vanadyle	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Colonnes	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5424
Pince	VWR	300-050
Microtubes à centrifuger	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Lames de microscope	Fisher	12-550-15
Plat 4 puits	Fisher	12-566-301
Verre de protection  ;	Fisher	12-544-G
Incubateur à air	Revolutionary Science	RS-IF-203