In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Les surfaces muqueuses servent de barrières physiques et immunologiques offrant une protection contre les menaces externes omniprésentes dans l’environnement^1,2. Cette barrière épithéliale protectrice peut être compromise lorsque des organismes pathogènes envahissent^2. Dans le cas d’un agent pathogène bactérien, cette rencontre provoque souvent un processus inflammatoire en activant le système immunitaire inné et en déclenchant une mobilisation rapide des granulocytes premiers répondants appelés neutrophiles^2-4. Les agents chimiotactiques facilitant le recrutement des neutrophiles sont produits en partie par les cellules épithéliales muqueuses cherchant à débarrasser l’hôte de l’agent pathogène incriminé^2-4. Infiltration excessive ou non résolue de neutrophiles de la surface épithéliale muqueuse peut provoquer une pathologie importante^1,5. Il s’agit d’une conséquence des lésions tissulaires non spécifiques causées par l’arsenal neutrophile antibactérien^5-7. Dans de tels cas, la capacité bactérienne de clairance des neutrophiles est éclipsée par la destruction du tissu de centre serveur pendant une insulte infectieuse.  La perturbation de la fonction protectrice de la barrière épithéliale peut entraîner une exposition accrue des tissus sous-jacents à des micro-organismes et/ou à des toxines, exacerbant davantage la pathologie de la maladie^8,9. Ces conséquences peuvent être observées dans plusieurs systèmes d’organes, y compris le poumon et le tube digestif^1,5. En outre, les conditions inflammatoires non infectieuses telles que les épisodes sévères d’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) sont marquées par la rupture pathologique de la barrière épithéliale muqueuse par une réponse neutrophile excessive^4,5,10-12.

Le processus complexe de recrutement des neutrophiles suivant une infection muqueuse implique plusieurs étapes compartimentées^1,5,13,14. Tout d’abord, les neutrophiles doivent s’écarter de la circulation via une série d’interactions de cellule à cellule qui facilitent la migration trans-endothéliale^1,13. Les neutrophiles naviguent ensuite dans l’espace interstitiel existant contenant la matrice extracellulaire^1,14. Pour atteindre la lumière de la muqueuse infectée, les neutrophiles doivent alors migrer à travers la barrière épithéliale^1,4,5. Ce phénomène complexe en plusieurs étapes est souvent étudié dans son ensemble à l’aide de modèles animaux in vivo d’infection¹⁵. De tels modèles sont utiles pour établir la nécessité de facteurs spécifiques, tels que les chimiokines, les molécules d’adhésion ou les voies de signalisation qui participent au processus global, mais sont largement inadéquats pour résoudre les contributions moléculaires critiques pour chaque étape compartimentée distincte^16. Les systèmes in vitro coculturels modélisant la migration trans-endothéliale, trans-matricielle ou trans-épithéliale des neutrophiles ont été particulièrement utiles à cet égard^1,14,16,17.

Un système robuste de dosage de coculture a été développé dans le but de déchiffrer les mécanismes responsables de la migration transépithéliale des neutrophiles en réponse à l’infection pathogène^18-22. Ce modèle consiste à infecter la surface apicale des couches de cellules épithéliales humaines polarisées avec un agent pathogène bactérien suivie de l’application de neutrophiles humains fraîchement isolés sur la surface basolatérale^18-22. Les neutrophiles migrent à travers la barrière épithéliale en réponse aux produits chimiotactiques épithéliaux-dérivés sécrétés après l’infection pathogène^18,21-23. Ce système modèle a été utilisé en utilisant des cultures épithéliales intestinales et pulmonaires exposées à des agents pathogènes bactériens spécifiques aux tissus appropriés et a dévoilé de nouveaux mécanismes moléculaires probablement importants pour le processus de recrutement des neutrophiles lors de l’infection muqueuse^3,8,19,24-28. La force de ce modèle de coculture in vitro est qu’une approche réductionniste permet au chercheur de manipuler expérimentalement l’agent pathogène, la barrière épithéliale et/ou le neutrophile dans un système bien contrôlé, hautement reproductible et assez peu coûteux. Les informations recueillies à partir de cette approche peuvent être efficacement exploitées pour effectuer une analyse ciblée des événements compartimentés lors du recrutement des neutrophiles à l’aide de modèles d’infection in vivo ^22,29,30.

Cet article démontre les étapes multiples nécessaires pour que l’établissement réussi de ce modèle reproductible explore la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène. Des barrières épithéliales de poumon infectées avec l’agent pathogène Pseudomonas aeruginosa sont présentées dans cet article ; cependant, d’autres épithéliums tissulaires et agents pathogènes peuvent être substitués avec des modifications mineures. L’ensemencement et la culture des couches polarisées de cellules épithéliales de poumon sur les filtres perméables enrobés de collagène inversés sont détaillés ci-dessous, de même que la croissance de l’aeruginosa pathogène de P. et l’isolement des neutrophiles du sang total. Comment ces composants sont combinés pour observer la migration trans-épithéliale induite par le microbe pathogène de neutrophile est présentée avec les contrôles positifs et négatifs appropriés pour établir une analyse reproductible. La polyvalence de cette approche pour examiner de divers aspects de la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène est discutée concernant des études spécifiques dans la littérature.

Les étapes (1-3) doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire.

1. Transwells de revêtement de collagène

1. Faire une solution de collagène à 30 μg/ml. Diluer 3 mg/ml de collagène stock 1:100 dans de l’éthanol à 60 % qui a été passé à travers une unité filtrante de 0,2 μm.
2. Vortex dilué 30 μg/ml solution. Remarque: Il n’est pas nécessaire de vortex la solution mère de collagène à 3 mg / ml, car cette solution est assez visqueuse et des bulles d’air peuvent être introduites, ce qui peut diminuer la précision lors du pipetage.
3. Retirer les transwells de^0,33 cm 2 de la zone de croissance d’une taille de pores de 3 μm de l’emballage extérieur et placer la plaque de 24 puits contenant 12 puits à l’envers à l’intérieur du capot.
4. Décoller la plaque inférieure et mettre de côté. Remarque : Les transwells seront maintenant à l’envers au-dessus du couvercle de la plaque de 24 puits
5. Allumez le brûleur Bunsen. Hémostatique de flamme pour la stérilité et laisser refroidir.
6. Avec l’hémostatique stérile, transférer les puits de Transwell dans une boîte de Petri de 150 mm x 25 mm, en les maintenant en position inversée. Remarque : Assurez-vous de maintenir la stérilité de la plaque vide de 24 puits plus le couvercle à utiliser pour loger les puits de transbordement une fois qu’ils ont été ensemencés avec des cellules épithéliales.
7. Pipetter 70 μl de la solution de collagène de 30 μg/ml sur la membrane filtrante de chaque puits de trans inversé. Remarque: La tension superficielle doit maintenir ce volume de solution en place car il n’y a pas de parois autour de la membrane filtrante lors de l’accès à la surface de la face inférieure. Veillez à ce que la solution de collagène ne s’égoutte pas sur le côté du puits de transbordement et évitez de déplacer les puits trans pendant la procédure de revêtement.
8. Laissez le couvercle de la boîte de Pétri éteint pendant au moins 4 heures pour permettre à la solution d’éthanol de s’évaporer. Pour maintenir la stérilité pendant ce processus, gardez le ventilateur de la hotte et la lumière ultraviolette allumés.
9. Une fois les puits de trans séchés, ils peuvent être utilisés immédiatement ou conservés à température ambiante jusqu’à une semaine, à condition que la couverture de la boîte de Pétri soit en place et que la stérilité soit maintenue.

2. Flacon de passage de cellules épithéliales pour l’ensemencement des puits trans

(Ce protocole décrit spécifiquement la manipulation de la variété de cellule épithéliale H292 de poumon pour la génération des barrières épithéliales cultivées sur des transwells. D’autres lignées cellulaires épithéliales peuvent être utilisées avec de légères modifications.)

1. Préparer le milieu de culture en ajoutant 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (HI-FBS) et 1x de pénicilline/streptomycine au RPMI 1640.
2. Milieux chauds, trypsine-EDTA (T-EDTA) et D-PBS au bain-marie à 37 ºC.
3. Retirer les cellules contenant du ballon T-75 de l’incubateur et évaluer visuellement la confluence avec un microscope inversé. Remarque : Lors de l’utilisation de cellules H292, les fioles doivent être proches ou entièrement confluentes.
4. Aspirer les milieux du ballon. Réduisez la durée pendant laquelle les cellules sont sèches en ayant la solution suivante dans la hotte avec le capuchon desserré.
5. Ajouter 5 ml de D-PBS à la fiole du T-75 et tourbillonner. Évitez de créer des bulles. Retirer pbs par aspiration.
6. Ajouter 3 ml de T-EDTA dans la fiole du T-75 et tourbillonner pour recouvrir le fond.
7. Enlever la majeure partie du T-EDTA en laissant environ 0,3 ml dans la fiole du T-75.
8. Répartir le petit volume restant de T-EDTA sur la surface des cellules et le placer dans un incubateur humidifié dans des conditions de culture standard (37 ºC, 5% DE_CO2).
9. Après un certain temps, retirez le ballon de l’incubateur. Note: Les cellules doivent se détacher facilement de la surface du ballon en tapotant doucement le ballon sur le côté. Les cellules doivent maintenant être arrondies et flottantes lorsqu’elles sont visualisées au microscope. Le temps moyen que cela prendra pour les cellules H292 est de 5-10 min.
10. Ajouter 10 ml de milieu de culture au ballon pour neutraliser le T-EDTA et les cellules remises en suspension. Prélever la solution cellulaire dans l’extrémité de la pipette et éjecter sur la surface des cellules contenant des fioles environ cinq fois pour remettre en suspension toutes les cellules.
11. Transférer les cellules remises en suspension dans un tube de 15 ml pour ensemencer les puits de transbordement. Remarque: La concentration des cellules H292 remises en suspension préparées de cette manière devrait varier entre approximativement 1 x^{10 6}-1.8 x 10⁶ cellules/ml.

3. Ensemencement de transwells enrobés de collagène avec des cellules épithéliales

1. Ajouter 70 μl de solution cellulaire remise en suspension du tube de 15 ml à chaque puits enrobé de collagène inversé. Remarque : Les solutions cellulaires H292 avec une plage de concentration comprise entre 1 x^{10 6}-1,8 x^{10 6} cellules/ml donneront environ 70 000 à 120 000 cellules/transwell.
2. Mélanger la suspension cellulaire en inversant doucement le tube périodiquement pour empêcher les cellules de se déposer au fond du tube de 15 ml pendant l’ensemencement des transwells. Remarque: Ne pas vortex cellules et soyez prudent que la pointe de pipette n’entre pas en contact direct avec le filtre à membrane enduit de collagène.
3. Une fois que tous les puits de trans inversés ont été ensemencés avec des cellules épithéliales, remplacez la couverture de la boîte de Petri et placez soigneusement dans l’incubateur de culture tissulaire, humidifié, 37 ºC, 5% de_CO2. Veillez à éviter de perturber la suspension cellulaire qui a été ajoutée à la membrane filtrante recouverte de collagène.
4. Maintenir les puits trans inversés dans l’incubateur de culture tissulaire, humidifié, 37 ºC, 5% CO₂ pendant la nuit. Remarque : La bulle de cellules contenant du liquide doit rester associée à la membrane filtrante perméable du puits de transbordement tout au long de l’incubation de nuit. Si la membrane filtrante devient sèche en raison de l’évaporation du liquide ou parce que le liquide s’égoutte sur le côté des puits de transbordement, les couches épithéliales peuvent ne pas se développer correctement.
5. Le lendemain, ajoutez 1 ml de milieu dans la plaque stérile originale de 24 puits et retournez chaque transwell inversé à l’aide d’un hémostatique stérilisé dans chaque puits contenant 1 ml de milieu.
6. Ajouter 0,2 ml de milieu dans la chambre supérieure de chaque transwell et retourner à l’incubateur de culture tissulaire humidifié,   37 ºC, 5% de_CO2.
7. Les puits de trans inversés H292 peuvent être utilisés de 8 jours à 1 mois après l’ensemencement. Remarque: Nous suggérons d’attendre un minimum de 8 jours après l’ensemencement des transwells pour s’assurer que les monocouches épithéliales se sont complètement formées et présentent une barrière fonctionnelle. On peut tester la barrière épithéliale H292 en déterminant si la monocouche est capable de restreindre le flux transépithélial de la protéine de radis de cheval peroxydase (HRP) suite à l’addition à la surface basolatérale^18.

4. Préparation des bactéries pour l’infection des couches épithéliales sur les puits trans

1. Un jour avant l’expérience, extraire une colonie de P. aeruginosa PAO1 d’une plaque de gélose d’isolement pseudomonas et une colonie de K12 E. coli MC1000 d’une plaque de gélose Luria-Bertani (LB) et placer dans des tubes séparés contenant 3 ml de bouillon LB. ATTENTION : P. aeruginosa est un agent pathogène humain, des mesures de sécurité BSL2 standard doivent être adoptées lors de la manipulation de cet organisme.
2. Agiter la nuit à 225 tr/min dans un environnement à 37 ºC.
3. Le lendemain, retirez 1 ml des cultures bactériennes denses et placez-les dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml.
4. Tourner dans un microfuge à 15 800 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant.
5. Préparez à l’avance la solution saline équilibrée de Hanks avec du calcium et du magnésium (HBSS+). Ajouter 23,8 g de HEPES et 97,5 g de poudre HBSS+ à 9,5 L d’eau distillée. Ajouter de petites quantités de NaOH 10 M à la solution, tout en surveillant le pH jusqu’à ce qu’un pH stable de 7,4 soit atteint. Porter le volume jusqu’à 10 L et stocker à 4 ºC.
6. Ressusciter chaque pastille bactérienne avec 1 ml d’HBSS+. Vortex pour être sûr qu’une suspension bactérienne uniforme est obtenue.
7. Tournez à nouveau à 15 800 x g pendant 5 min et retirez le surnageant.
8. Ressusciter la pastille PAO1 avec 0,6 ml hbss+ et la pastille MC1000 avec 0,5 ml HBSS+. Vortex les suspensions bactériennes.
9. Diluer davantage les pastilles remises en suspension PAO1 et MC1000 1:100 dans HBSS+. Par exemple, ajouter 50 μl de la pastille de PAO1 remise en suspension de 0,6 ml à 5 ml de HBSS+. Remarque : En utilisant des mesures de densité optique (DO) pour déterminer la densité de culture ainsi que la méthode de dilution de l’unité formant colonies (UFC) standard, les solutions PAO1 et MC1000 préparées de cette manière donnent constamment entre 3 x^{10 7}-6 x 10⁷ UFC/ml. La densité d’une culture bactérienne est positivement corrélée avec la mesure de DO de la culture à 600 nm et cette corrélation peut être utilisée pour estimer la concentration cellulaire bactérienne. Pour confirmer la concentration de cellules bactériennes, la culture peut être diluée à une très faible concentration estimée et plaquée sur une plaque de gélose de telle sorte que l’on s’attendrait à ce qu’entre 30 et 200 cellules bactériennes soient présentes sur la plaque. Les cellules sont réparties sur la plaque et incubées pendant la nuit à 37 ºC de sorte que chaque cellule forme une colonie individuelle de cellules qui est assez grande pour être visible et les colonies peuvent ensuite être comptées.

5. Isolement des neutrophiles du sang total

1. La solution de dextrose de citrate acide (ACD) est utilisée comme anticoagulant et préparée en ajoutant 6,9 g d’acide citrique, 12,5 g de citrate de sodium et 10 g de dextrose à 500 ml d’eau distillée. Une fois que tous les composants sont dissous, la solution ACD est stérilisée en passant à travers une unité filtrant de 0,2 μm. Conserver la solution ACD à 4 ºC.
2. Avant de prélever du sang, ajoutez 5 ml d’ACD à la seringue de 50 ml et fixez 21 x 3/4 G d’aiguille papillon avec 12 dans un tube.
3. Appliquez le garrot, essuyez la veine avec de l’alcool et insérez l’aiguille. Remarque : Tout protocole de recherche impliquant des sujets humains doit être approuvé par un comité d’examen de l’établissement et le consentement éclairé écrit de chaque donneur de sang doit être fourni. Par exemple, les expériences menées à l’aide de ce protocole ont été approuvées par le Massachusetts General Hospital Institutional Review Board et le protocole attribué #1999-P-007782.
4. Prélevez lentement 45 ml de sang en veillant à ce que le sang se mélange à l’ACD une fois dans la seringue.
5. Lorsque 45 ml ont été tirés (volume total de 50 ml), délier le garrot avant de retirer l’aiguille. Appliquez immédiatement une pression sur la plaie avec de la gaze stérile lorsque l’aiguille est retirée.
6. Transférer le sang lentement sur le côté d’un tube de 50 ml sur environ 5-10 sec.
7. Tourner en centrifugeuse à 1 000 x g avec le frein désactivé pendant 20 min à température ambiante. Remarque: Une étape supplémentaire impliquant la dilution du sang total dans le PBS- et la superposition soigneuse de sang dilué sur Ficoll-Paque avant la centrifugation peut être utilisée pour atteindre un niveau légèrement plus élevé de pureté des neutrophiles en séparant plus efficacement le pelage chamois des granulocytes^8. Omettre cette étape sert à gagner du temps sans impacter considérablement le rendement ou la pureté aux fins de ce test, et nous préférons donc ne pas inclure la superposition de sang sur l’étape Ficoll-Paque.
8. Pendant que le sang tourne, ajoutez très lentement 1 g de gélatine dans la solution saline équilibrée de Hanks chauffée de 50 ml sans calcium ni magnésium (HBSS(-)) pour préparer une solution de gélatine à 2%. Conserver la solution à 37 ºC.
9. Aspirer et jeter le plasma du tube de sang de 50 ml à l’aide d’une pointe de pipette en verre qui a été traitée avec Sigmacote.
10. Continuez à aspirer très soigneusement pour enlever le pelage chamois, qui contient des globules blancs, y compris des lymphocytes.
11. Au fur et à mesure que le pelage chamois est lentement enlevé, le matériau nuageux jaune blanchâtre au-dessus de la couche de globules rouges (RBC) disparaîtra. Cessez l’aspiration une fois que le manteau chamois est retiré et que la couche RBC peut être clairement visualisée lors de la visualisation au-dessus du tube.
12. Essayez de ne pas perturber la couche RBC car les granulocytes, principalement des neutrophiles, sont près de la surface de la couche RBC, mais ne sont pas visibles.
13. À un volume de 15 ml de couche RBC, ajouter 30 ml de solution chaude de gélatine à 2% (2x volume de la couche RBC).
14. Inverser doucement le tube pour mélanger, en prenant soin de minimiser la formation de bulles.
15. Incuber à 37   ºC pendant 25 min. Remarque : Les globules rouges doivent s’agréger et se déposer au fond. Comme alternative à la gélatine, le dextrans de poids moléculaire important peut être utilisé pour les globules rouges des sédiments^8.
16. Après l’incubation, transférer la couche supérieure une solution rougeâtre légère contenant des granulocytes dans un nouveau tube de 50 ml avec pipette, en prenant soin de ne pas perturber la couche de globules rouge foncés pendant le transfert. Une fois séparés, jetez la couche de globules rouge foncés.
17. Spin transféré solution rougeâtre légère contenant des granulocytes et certains globules rouges en centrifugeuse à 1 000 x g avec frein activé pendant 10 min à température ambiante afin de granuler les cellules.
18. Versez ou aspirez soigneusement le surnageant, car la pastille de cellules rougeâtres qui se formera après la centrifugation est généralement lâche.
19. Préparer le tampon de lyse RBC à l’avance et conserver à 4 ºC en ajoutant 8,29 g de chlorure d’ammonium (NH₄Cl), 1 g de bicarbonate de sodium (NaHCO₃₎et 0,038 g d’EDTA à 1 L d’eau distillée dans un bécher. Conserver le tampon de lyse RBC à 4 ºC.
20. Ressusciter et briser le culot de cellules rougeâtres avec un petit volume de tampon de lyse RBC froid. Une fois que le culot cellulaire est en solution, remplissez le tube à 50 ml avec un tampon de lyse RBC. Remarque : À ce stade et à l’avenir, gardez les cellules sur la glace ou à 4 ºC.
21. Tournez en centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à   4 ºC, puis versez ou aspirez le surnageant. Remarque: Le surnageant sera quelque peu rougeâtre contenant des globules rouges lysés. Le culot doit être blanc jaunâtre à ce stade. Si des globules rouges importants restent dans la pastille comme indiqué par une pastille rougeâtre, l’étape 5.20-5.21 peut être répétée. Des globules rouges importants restent dans la pastille cellulaire si la pastille rougeâtre de l’étape 5.20 n’est pas suffisamment brisée.
22. Ressusciter et briser le granulé blanchâtre avec un petit volume de HBSS(-) puis remplir le tube à 50 ml avec HBSS(-). Remarque : Hbss(-) et non HBSS+ doivent être utilisés pour ressusciter le culot blanchâtre de cellules. HBSS(-) manque de calcium et de magnésium.
23. Tourner à nouveau en centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4   ºC.
24. Verser le surnageant et ressusciter le culot jusqu’à un volume final de 1 ml de HBSS(-).
25. Ajouter 5 μl de la suspension cellulaire de 1 ml à 250 μl de HBSS(-) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et mélanger doucement de haut en bas par pipette.
26. Ajouter 25 μl de suspension de cellules diluées à 25 μl 0,4 % de bleu trypan.
27. Ajouter 12 μl de mélange de chaque côté d’un hémocytomètre étalon.
28. Comptez le nombre de cellules vivantes qui ont exclu le colorant bleu Trypan et qui sont présentes dans le carré central des deux côtés de l’hémocytomètre.
29. Pour calculer la concentration cellulaire, multipliez la moyenne des 2 carrés par 100 (facteur de dilution), puis multipliez par 10⁴ pour donner le nombre de cellules/ml.
30. Ajuster la concentration finale à 5 x 10⁷ cellules/ml. Si supérieur à 5 x 10⁷ cellules/ml, ajuster en ajoutant HBSS(-). Si moins, granuler les cellules et les ressusciter au volume approprié.
31. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’essai de migration. Remarque: Ces cellules représentent la population de granulocytes des globules blancs. La majorité des granulocytes isolés dans le sang humain total sont des neutrophiles. Les cellules sont maintenues sur la glace en suspension dans le SSHB(-) jusqu’à ce qu’elles soient additionnés à l’essai de migration afin de maintenir les cellules dans un état de repos.

6. Préparation des couches de cellules épithéliales pour l’essai de migration

(Cesétapes n’ont pas besoin d’être effectuées dans une hotte stérile.)

1. Retirer de l’incubateur la plaque de 24 puits supportant les couches épithéliales qui ont été cultivées sur la face inférieure des membranes filtrants de puits pendant au moins huit jours.
2. Saisissez le bord de chaque puits de trans avec un hémostatique, soulevez-le de la plaque de 24 puits et inversez le puits au-dessus d’un seau à déchets pour jeter les milieux de culture de la chambre intérieure du puits. Plongez chaque transwell dans un bécher de lavage contenant HBSS+ pour remplir la chambre intérieure du transwell avec HBSS+. Jetez le liquide de la chambre intérieure dans un seau à déchets.
3. Répétez l’étape 6.2 pour un deuxième lavage dans HBSS+. Après deux lavages, placez les transwells dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant 1 ml de HBSS+ dans chaque puits. Remarque : Tous les lavages doivent être effectués avec hbss+ qui est chauffé à 37 ºC.
4. Observez la chambre supérieure de chaque puits de transwell pour évaluer l’intégrité de la couche de cellules épithéliales. Remarque : Hbss+ ne doit pas fuir dans la chambre supérieure du puits de transbordement et la remplir lorsqu’il est placé dans le puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 ml de HBSS+.
5. Après avoir observé attentivement chaque puits, ajouter 0,2 ml de HBSS+ dans la chambre supérieure.
6. Placer dans l’incubateur à 37   ºC, 5% de_CO2 dans une chambre humidifiée pendant 30-60 min pour équilibrer les couches de cellules épithéliales.

7. Test de migration transépithéliale des neutrophiles

1. Retirer de l’incubateur la plaque de 24 puits de transwells lavés s’équilibrant dans HBSS+.
2. Saisissez chaque puits avec un hémostatique et jetez le liquide dans le dessus bien dans un seau à déchets.
3. Placez chaque puits à l’envers dans une boîte de Pétri de 150 mm x 25 mm.
4. À six des transwells inversés, ajoutez 25 μl de HBSS+. Pour trois des transwells inversés, infecter avec 25 μl de P. aeruginosa (PAO1) dilué dans HBSS+ préparé comme décrit à l’étape 4. Aux trois derniers puits de trans inversés, infecter avec 25 μl de E. coli K12 (MC1000) dilué dans hbss+ préparé comme décrit à l’étape 4. C’est environ 0,8 x 10⁶-1,5 x 10⁶ UFC/couche épithéliale pour chaque espèce bactérienne puisque la concentration des solutions bactériennes préparées à l’étape 4 est d’environ 3 x^{10 7-6}x 10⁷ UFC/ml.
5. Incuber à 37   ºC, 5 % de_CO2 dans une chambre humidifiée pendant 60 min.
6. Préparer le fMLP comme témoin positif pour la migration des neutrophiles en ajoutant 5 μl de stock de fMLP de 10 mM à 5 ml de HBSS+ donnant une solution de 10 μM.
7. Laver les transwells en les saisissant avec un hémostatique et en retournant dans une plaque de lavage de 24 puits qui contient 1 ml de HBSS+ dans les chambres inférieures. Ajouter 0,2 ml de HBSS+ dans les chambres supérieures.
8. Saisissez le puits de trans avec un hémostatique et retirez de la première plaque de lavage. Avant de placer des puits transwells dans une deuxième plaque de lavage de 24 puits contenant 1 ml de HBSS+, jetez le liquide de la chambre supérieure dans un seau à déchets. Ajouter 0,2 ml de HBSS+ dans la chambre supérieure.
9. Répétez les étapes 7.8 une fois de plus pour un total de 3 lavages. Remarque : Tous les puits de transbordement devraient être soumis au même régime de manipulation et de lavage, qu’ils aient été infectés ou non par des bactéries, afin de s’assurer que tous les puits de transbordement analysés ont été manipulés de la même manière. Une infection de 60 minutes par PAO1 ou MC1000 ne réduit pas la viabilité ou ne modifie pas les propriétés de barrière de la monocouche H292 telles qu’évaluées par un test toxicologique basé sur la lactate déshydrogénase et le test de flux HRP, respectivement^18,22.
10. Préparez la plaque de migration de 24 puits en ajoutant 1 ml de HBSS+ dans 12 puits de la plaque de 24 puits. Remarque: Cette plaque peut être préparée à l’avance.
11. Après le troisième lavage, jetez le liquide des chambres supérieures des transwells dans un seau à déchets à l’aide d’un hémostatique et placez trois des transwells non infectés dans trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant 1 ml hbss+, ce qui représente le témoin négatif.
12. Pipetter 10 μl d’une solution de fMLP à 10 μM dans chacun des trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant 1 ml de HBSS+ (100 nM).
13. Placez trois des transwells non infectés dans trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant 100 nM fMLP, qui représente un contrôle positif pour la capacité des neutrophiles d’isolement de migrer.
14. Placez trois puits de trans infectés par PAO1 et trois transwells infectés par MC1000 dans trois puits chacun respectivement de la plaque de migration de 24 puits contenant 1 ml HBSS+. Ajouter 0,1 ml de HBSS+ dans la chambre supérieure de chaque puits.
15. En plus des 0,1 ml de HBSS+ dans chaque transwell, ajouter soigneusement 20 μl de la suspension de neutrophiles (5 x 10⁷ cellules/ml) préparée comme décrit à l’étape 5. Remarque: Ceci représente approximativement 1 x 10⁶ neutrophiles/transwell.
16. Incuber à 37 ºC, 5% de_CO2 dans une chambre humidifiée pendant 2 heures pour permettre la migration trans-épithéliale des neutrophiles.
17. Préparer une courbe standard pour déterminer le nombre de neutrophiles qui ont migré après 2 heures. Ajouter 40 μl de la suspension de neutrophiles (5 x 10⁷ cellules/ml) dans 2 ml de HBSS(+) et transférer 1 ml dans 1 ml de HBSS(+) et effectuer des dilutions sériel 2 fois supplémentaires pour un total de 10 étalons allant d’environ 2 000 cellules/ml à 1 x 10⁶ cellules/ml. Inclure 1 ml hbss(+) pour vide.
18. Après 2 heures de migration, soulevez les transwells en les saisissant avec un hémostatique et appuyez doucement contre les parois intérieures de la plaque de migration de 24 puits. Jetez les puits de transbordement.
19. Évaluer la migration des neutrophiles de manière grossière dans les puits en observant les puits de la plaque de migration de 24 puits sous un microscope inversé à l’aide de l’objectif 10X (voir la figure 1 pour des images de neutrophiles migrés dans chaque condition).
20. Ajouter 50 μl de triton X-100 à 10 % à chaque puits utilisé dans la plaque de migration de 24 puits, à chaque étalon et à l’ébauche.
21. Faites pivoter la plaque de migration de 24 puits, les étalons et l’ébauche à basse vitesse pendant 20 min à 4   ºC.
22. Préparez 1 M tampon citrate à l’avance. Ajouter 52,5 g d’acide citrique et 73,5 g de citrate de sodium à 400 ml d’eau distillée dans un bécher. Porter le pH à 4,2. Ajouter de l’eau distillée pour une solution finale de 500 ml. Conserver la solution à 4 ºC.
23. Préparez la solution de substrat ABTS fraîche ce jour-là. Ajouter 3 comprimés d’ABTS (10 mg chacun) et 5 ml de tampon citrate 1 M à 45 ml d’eau distillée. Laissez les comprimés se dissoudre complètement en solution. Retenir l’ajout de 50 μl de peroxyde d’hydrogène à 30 % jusqu’à ce que la solution de substrat ABTS soit nécessaire (voir l’étape 7.27).
24. Ajouter 50 μl de tampon citrate à chaque puits utilisé dans la plaque de migration de 24 puits, à chaque étalon et à l’ébauche.
25. Transférer 100 μl de chaque puits d’échantillon en double sur une plaque de 96 puits. Remarque: Il est très important de bien mélanger le contenu de chaque puits d’échantillon avant de passer à la plaque de 96 puits. Pipetter la solution de haut en bas au moins cinq fois avant le transfert.
26. Transférer 100 μl de chaque étalon et l’ébauche sur la plaque de 96 puits après mélange (ébauche en double).
27. Ajouter 50 μl de peroxyde d’hydrogène à 30 % à la solution d’ABTS et au vortex.
28. Ajouter 100 μl de solution de substrat ABTS à chaque échantillon sur la plaque de 96 puits.
29. Laisser la plaque se développer pendant 5-10 min dans l’obscurité. Remarque: Une couleur verte devrait se développer dans certains puits, en corrélation avec le nombre de neutrophiles présents dans chaque puits.
30. Lire à une longueur d’onde de 405 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
31. Calculer le nombre de neutrophiles qui ont migré à travers la couche épithéliale à l’aide des étalons selon lesquels il existe une corrélation positive linéaire entre le nombre connu de neutrophiles préparés comme étalons et la quantité d’activité de la peroxydase mesurée par la densité optique à 405 nm (voir les figures 2 et 3 pour des données représentatives). Remarque: Cette méthode de quantification de neutrophile tire parti de la grande quantité d’activité de peroxydase exposée par des neutrophiles dues à l’expression de myeloperoxidase. D’autres approches pour quantifier les neutrophiles peuvent être envisagées, telles que des méthodes impliquant le prémarquage des neutrophiles avec des composés de radioactivité ou de fluorescence.

Plusieurs études ont démontré que les couches épithéliales infectées par des agents pathogènes facilitent la migration transépithéliale des neutrophiles3,8,19,24-28,31,32. Ceci se produit par l’intermédiaire d’une induction pathogène-spécifique d’un gradient chimiotactique cellule-dérivé de cellules épithéliales de neutrophile3,23. Par exemple, P. aeruginosa pathogène interagissant avec la surface apicale des cellules épithéliales pulmonaires provoque la migration d’un nombre important de neutrophiles à travers la couche épithéliale18,22,25,26,33,34. Ce système d’analyse cliniquement pertinent peut être manipulé de nombreuses façons pour dévoiler les principaux contributeurs moléculaires de l’agent pathogène et de l’hôte lorsqu’il est associé à des contrôles appropriés.

Les neutrophiles ajoutés aux couches polarisées de cellules épithéliales qui n’ont pas été préinfectées ne migrent pas à travers en nombre appréciable. Cependant, l’application d’un gradient de chimio-attractif sur une couche épithéliale non infectée entraînera un nombre important de neutrophiles. Il est important d’inclure ces contrôles négatifs et positifs respectivement dans chaque analyse en étudiant la migration de neutrophile à travers les couches épithéliales infectées par l’agent pathogène. Le témoin négatif établit le nombre de fond de neutrophiles qui traversent la couche épithéliale en l’absence de signal. Ce nombre devrait être très bas quand les cellules épithéliales cultivées ont établi une barrière fonctionnelle. Une migration de fond élevée complique l’interprétation des résultats obtenus avec l’épithélium infecté par l’agent pathogène. Le contrôle positif implique l’application d’un gradient d’un chimio-attractif neutrophile tel que fMLP à travers la couche épithéliale et sert à confirmer que les neutrophiles isolés sont fonctionnels. De plus, dans le cas où les couches épithéliales sont prétraitées avec certains réactifs pour évaluer leurs impacts sur la migration transépithéliale induite par l’agent pathogène, le gradient fMLP sert à contrôler tous les effets que le réactif peut avoir sur la capacité des neutrophiles à naviguer dans la couche épithéliale indépendamment des effets médiés par l’agent pathogène. Un contrôle supplémentaire souvent utilisé dans ce système d’essai implique l’infection des couches épithéliales avec des bactéries non pathogènes en parallèle avec l’agent pathogène. Ce contrôle peut être exploité pour distinguer les réponses épithéliales pertinentes après interaction avec les bactéries ainsi que pour aider à l’identification des facteurs pathogènes nécessaires pour stimuler la migration transépithéliale des neutrophiles.

La migration trans-épithéliale de neutrophile peut être évaluée qualitativement et quantitativement. À la fin de l’incubation de 2 heures suivant l’ajout des neutrophiles à la surface basolatérale, les transwells sont enlevés et les neutrophiles qui ont migré entièrement à travers la couche épithéliale à la chambre apicale peuvent être vues dans le puits inférieur de la plaque de migration de 24 puits. Une image représentative de chaque condition est affichée sur la figure 1,visualisée à l’aide d’un microscope à lumière inversée. On a observé que très peu de neutrophiles migrent à travers une couche épithéliale non infectée sans gradient chimiotactique imposé (HBSS+) et représentent les niveaux de fond dans l’essai(figure 1A). En revanche, une abondance de neutrophiles transmigrés était apparente lorsqu’un gradient fMLP est fourni(figure 1B). L’infection de l’épithélium par E. coli MC1000 non pathogène a entraîné peu de neutrophiles transmigrés visibles, tandis que de nombreuses neutrophiles transmigrées étaient observables lorsque des couches épithéliales ont été infectées par P. aeruginosa (PAO1) pathogène pour les poumons (figures 1C et 1D).

Les neutrophiles qui ont migré dans l’expérience sont quantifiés en mesurant leur activité de myeloperoxidase. Une courbe standard est utilisée pour permettre une estimation du nombre de neutrophiles transmigrés. Le nombre de neutrophiles est positivement corrélé avec la quantité d’activité de la peroxydase mesurée après la lyse des neutrophiles avec des valeurs présentant une relation linéaire dans la gamme des nombres de neutrophiles sélectionnés pour la courbe standard (2 x10 3-1 x 106 cellules/ml) (Figure 2). Un nombre important de neutrophiles migrent à travers les couches épithéliales en réponse à un gradient fMLP fourni ou en réponse à une couche épithéliale infectée par PAO1 (Figure 3). Le nombre de neutrophiles qui migrent en l’absence de stimuli (HBSS+) ou à la suite d’une infection épithéliale apicale par E. coli MC1000 non pathogène est inférieur à la limite de détection pour le test (Figure 3). Les données présentées à la figure 3 représentent le nombre moyen de neutrophiles transmigrées avec des barres d’erreur représentant l’écart-type de trois puits indépendants / condition. Les données quantitatives présentées à la figure 3 concordent avec les images représentatives des puits illustrées à la figure 1.

Figure 1. Image des neutrophiles suivant la migration trans-épithéliale. Des images ont été vues avec un microscope optique inversé au grossissement 10X du puits inférieur (chambre apicale) du plat de migration de 24 puits suivant la période d’incubation de 2 heures avec des neutrophiles ajoutés au puits supérieur (chambre basolateral). (A) Contrôle négatif HBSS+. (B) Le contrôle positif a imposé le gradient chimiotactique fMLP. (C) Couches de cellules épithéliales infectées par E. coli K12 non pathogène (MC1000). (D) Couches de cellules épithéliales infectées par P. aeruginosa pathogène (PAO1). Cliquez ici pour agrandir l’image.

Figure 2. Des neutrophiles à une concentration de départ de 1 x10 6 ont été soumises à neuf dilutions 2 fois. Après lyse, la quantité d’activité de peroxydase a été déterminée et le nombre de neutrophiles a été représenté graphiquement sur l’axe des x avec l’activité de peroxydase sur l’axe des Y. L’équation représentée peut être utilisée pour déterminer le nombre de neutrophiles présents dans chaque puits après la transmigration en fonction de la quantité d’activité de la peroxydase mesurée dans chaque puits. Cliquez ici pour agrandir l’image.

Figure 3. Quantification des neutrophiles transmigrés. Le nombre de neutrophiles transmigrés est quantifié par l’activité relative de myeloperoxidase à une courbe standard linéaire des nombres connus de neutrophiles. On a observé des nombres substantiels de neutrophiles transmigrated après infection de cellules épithéliales avec l’aeruginosa pathogène de P. (PAO1) ou l’établissement d’un apical au gradient basolateral de fMLP chemo-attractif de neutrophile. On a observé des nombres indétectables de neutrophiles transmigrés suivant l’infection de cellules épithéliales avec le traitement non pathogène de E. coli K12 (MC1000) ou le tampon de contrôle négatif seulement (HBSS+). Cliquez ici pour agrandir l’image.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.