La méthode la Culture Slice pour la suite du développement des germes de dents dans explantation Culture

Résumé

Ici, nous détaillons une méthode de culture des germes de dents dans la mandibule tranches en utilisant un broyeur de tissus. Cette méthode permet un accès unique à la dent au cours du développement, offrant une excellente occasion pour la manipulation et de la lignée de traçage, pas disponible en utilisant des méthodes de culture traditionnelles.

Résumé

culture de l'explantation permet la manipulation de développer des organes à des moments spécifiques et est donc un moyen important pour la biologie du développement. Pour de nombreux organes, il est difficile d'accéder à un tissu en développement pour permettre la surveillance au cours de la culture ex vivo. Procédé de culture de tranche permet l'accès à un tissu de sorte que les mouvements morphogénétiques peuvent être suivies et des populations de cellules spécifiques peuvent être ciblés pour la manipulation ou la lignée de traçage.

Dans cet article, nous décrivons une méthode de culture de la tranche qui a été très fructueuse pour la culture des germes de dents dans une gamme d'espèces. La méthode offre un excellent accès aux germes dentaires, qui se développent à un rythme similaire à celui observé in vivo, entouré par les autres tissus de la mâchoire. Ceci permet des interactions entre tissus situés entre la dent et du tissu environnant à contrôler. Bien que ce document se concentre sur les germes dentaires, le même protocole peut être appliqué à suivre le développement d'un certain nombred'autres organes, comme les glandes salivaires, le cartilage de Meckel, les glandes nasales, de la langue, et l'oreille.

Introduction

Pour un certain nombre d'expériences, il est important d'être en mesure de tissu de culture ex vivo pour suivre le développement. Culture de développer le tissu permet d'accéder à des périodes déterminées de développement et permet la manipulation de gènes par l'addition de facteurs de milieu de culture, ou sur des billes chargées, et par l'utilisation de la transfection et électroporation ^1. Pour de nombreuses expériences, il est important d'être capable de visualiser le tissu pendant sa croissance, par exemple, de suivre le sort des cellules de la lignée marqué que le tissu est soumis à la morphogenèse. Cela peut être particulièrement problématique pour les tissus qui se développent plus profond de l'embryon, qui ne sont pas évidentes lorsque un bloc de tissu à partir de l'embryon est mis en culture. Les dents sont de bons exemples de ce qui se développent au sein du processus nasal mandibule, maxillaire et frontal. Lorsque l'ensemble de la mandibule est cultivé les structures superficielles de la dent peut être consulté mais des changements dans la morphologie ne peuvent être analysés après la coupe de tissu fixe 2. Nous avons adapté une technique de culture de tranche en direct nous permettant de suivre le développement du germe dentaire et l'accès aux différentes parties de la dent au cours du développement. Les cultures de la technique des tranches dent germinales à l'interface gaz-liquide, en utilisant une méthode Trowell modifiée ^3. Ces cultures tranche ont été très utiles en suivant directement la morphogenèse de la dent, et en permettant le traçage lignée de composants distincts, tels que le noeud de l'émail et de la papille dentaire et follicule ^1,4-7. La technique ne se limite pas à des embryons de souris et a été utilisé avec succès pour la culture tranches en direct de porc et serpent dentaire ^8,9 tissulaire. En plus de l'avantage d'être en mesure de visualiser le développement des dents, la méthode de la tranche a aussi l'avantage que les fines tranches de tissu ont un accès accru à des éléments nutritifs du milieu et de l'air de l'incubateur. Il en résulte une amélioration de la croissance des germes dentaires, qui correspondent le développement in vivo, et montrent invasion des cellules endothéliales dans la papille ^7. En revanche, les germes dentaires dans des cultures entières mandibule se développent plus lentement que ceux in vivo et le centre de la culture est souvent nécrotique dans des cultures à long terme. Dans la culture de la tranche, la dent se développe à l'intérieur d'une tranche de la mâchoire, et son interaction avec le développement de l'os environnant et d'autres tissus peut être surveillée. Dans notre procédé, le tissu est coupé immédiatement après dissection sans qu'il soit nécessaire d'incorporer dans un milieu de support ^10,11 et aucun besoin pour un système pour fixer le tissu sur le billot. La méthode est donc non invasive et rapide, permettant à de nombreux mandibules à sectionnés en une seule session.

Protocole

Une. Set Up

1. Aiguisez les instruments de dissection (en utilisant une pierre à aiguiser lubrifié avec de l'huile minérale) et stériliser avant utilisation pour la culture d'organes à l'aide d'un spray d'éthanol à 70% et la stérilisation à chaleur sèche. Affûter les aiguilles de dissection par électrolyse dans de l'hydroxyde de sodium 2 M en utilisant une alimentation de 12 V.
2. Préparer le milieu de culture utilisé pour la dissection et la culture d'organes embryonnaires, consistant en la modification F12 Eagle Medium avancée Dulbecco (DMEM F12) complété avec 1% GlutaMAX et 1% de pénicilline-streptomycine.

2. Embryon Dissection

1. Abattre une femme enceinte accouplés chronométré en utilisant une méthode horaire un tel qu'approuvé par le Home Office ou autre organe. Disséquer la peau autour de l'abdomen inférieur, et couper ouvrir l'abdomen avec des ciseaux. Repérez les deux cornes utérines, qui relient ensemble à la ligne médiane inférieure.
2. Disséquer l'utérus et le placer dans un tube rempli de milieu sur la glace. EPMn sur de la glace, le tissu peut être laissée pendant plusieurs heures.
3. Enlever l'utérus et les placer dans une boîte de Pétri en milieu sous le microscope. Où dissections d'embryons possibles doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination.
4. Disséquer les embryons de l'utérus et les libérer de leurs tissus extra-embryonnaires.
5. Décapiter les embryons en utilisant une aiguille de tungstène et de transférer les têtes dans une nouvelle boîte de milieu.
6. Isoler les mandibules de la tête en plaçant une aiguille dans la cavité buccale et couper vers l'arrière de la tête (figures 1A et 1B). Mandibules isolées peuvent être stockés temporairement dans un milieu sur la glace en attendant pour hacher.
7. Pour les tranches mandibule ensemble des étapes E11.5 E15.5-sont idéales pour la culture des germes dent. Après E15.5 l'os en développement dans la mandibule est trop dur pour hacher. tranches de dents peuvent encore être apportées, mais l'os (l'os alvéolaire dentaire et la formation) doivent d'abord être éliminés pardissection avant de les hacher ^9. Retirez soigneusement os en utilisant des aiguilles de tungstène et une pince.

3. Embryon tranchage

1. Préparer les tranches de tissu mandibule en utilisant un broyeur de tissu de table standard (figure 1C). Utilisez une lame neuve après environ 200 mandibules, et assurez-vous qu'il affleure avec le disque de montage quand il tombe.
2. Nettoyez le disque de montage et la lame avec 70% d'éthanol avant utilisation. Il faut prendre soin lors de l'utilisation de la machine, comme la lame est très pointue.
3. Régler le hacheur à une distance de coupe de 200 à 400 um entre fonction de l'âge de l'échantillon, et selon que l'ensemble du germe dentaire est nécessaire. Réglez la pression de la lame au maximum.
4. Transférer une mandibule vers le disque de support en plastique à l'aide d'une pipette ou d'une pince. Organiser la mandibule sur le disque en veillant à l'orientation est toujours clair. La languette de développement peut être utilisé comme un point de repère utile pour déterminer l'orientation. Pour molaires utilisation afRontal / orientation transversale (voir plan de découper la figure 1B), tandis que pour les incisives utiliser un coupe sagittale par la mandibule afin de refléter l'orientation différente de ces dents à mesure qu'ils grandissent (voir plan de découper la figure 2A).
5. Éliminer le milieu en excès à travers le tissu en utilisant un papier-filtre afin de sécher légèrement la mandibule sur le disque de montage.
6. Immédiatement après le séchage, placez le disque sur le tableau de l'hélicoptère circulaire en acier inoxydable. Allumez la machine et appuyez sur start. Le tableau qui traverse automatiquement à partir de la gauche vers la droite alors que dans le même temps le bras portant la lame de hachage est élevée, et a chuté jusqu'à 200 coups / min.
7. Eteignez la machine une fois que le tissu a été complètement tranché. Assurez-vous que le bras de la lame est en position relevée et retirez le disque. Ne pas placer les doigts sous le bras de la lame ou laisser la machine sans surveillance pour hacher.
8. Prenez le disque de montage et ajouter immédiatement milieu to les tranches sur le disque afin de prévenir l'assèchement excessif. Dégagez délicatement le tissu en tranches de la partie inférieure du disque à l'aide d'une aiguille de tungstène et la pipette dans une petite boîte de Pétri de milieu (figure 2A).
9. Séparer les tranches à l'aide d'une aiguille, puis sélectionnez les tranches de tissu contenant le tissu d'intérêt sous un stéréomicroscope (figures 1D, 1E, et 2B). Placer les tranches sélectionnées dans des boîtes de culture frais avec le milieu.

4. Tranche Culture

1. Préparer des boîtes de culture organe central-bien prêts pour la culture en ajoutant environ 2 ml d'eau à l'autoclave pour le bien externe pour éviter la déshydratation, et par le positionnement d'une grille métallique à travers le centre de l'assiette (figures 3A et 3B).
2. Préparer des grilles métalliques par des bandes d'environ 4 cm x 1,5 cm à partir de feuilles de treillis en acier inoxydable de coupe. Utilisez une perforatrice pour faire un trou au centre et plierles côtés pour créer une fin en quinconce. La grille doit être bien à plat à travers le puits central, couché parallèlement au fond de la cuvette (figures 3A et 3B). Autoclave pour stériliser les grilles avant de l'utiliser.
3. Couper un morceau de téréphtalate de polyéthylène transparent (PET) membrane (taille des pores 0,4 um) suffisamment grand pour recouvrir le trou de la grille. Placer la membrane de coupe dans le plat avec la tranche sélectionnée.
4. Placez la tranche au-dessus de la membrane, puis soulevez délicatement la membrane de la moyenne, avec une tranche aplatie dans le centre.
5. Placer le filtre dans la grille sur le trou circulaire au centre, et à environ 1 ml de milieu de culture à la source, au niveau de la membrane.
6. Pour les manipulations ajouter des protéines ou des inhibiteurs de petites molécules dans le milieu (par exemple ^8).
7. Photographier la tranche pour un enregistrement de la morphologie au jour 0 de la culture.
8. Placez les plats dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _{2 à 37 ° C dans un incubateur.}
9. Photographier les cultures à intervalles réguliers pour en moyenne 7 jours. Changer le milieu de culture tous les 48-72 heures. Pour la photographie afficher les tranches avec une source de lumière de dessous (figures 2C-E).

5. Lineage traçage

Si lignée traçage est nécessaire, des colorants lipophiles tels que Dil ou DiO peuvent être injectés dans le germe de la dent avant l'étape 4, la culture de la tranche.

1. Tirez aiguilles capillaires en verre à l'aide d'un extracteur d'aiguilles.
2. Casser l'embout de l'aiguille en utilisant une pince et placer la pointe vers le bas dans la solution de colorant. Laissez agir quelques minutes tandis que le colorant remplit la pointe par capillarité.
3. Placez l'aiguille rempli dans un support et fixer par un tuyau à un injecteur ou la bouche aspirateur.
4. Positionner la pointe de l'aiguille dans le milieu de culture de toucher la zone de la tranche due à étiqueter. Appliquer une pression d'air pour déplacer une petite quantité de colorant sur la une de l'aiguilleD sur le tissu.
5. Retirer l'aiguille et vérifier si l'étiquetage en fluorescence.
6. Tranches marquées avec succès peuvent être transférées sur des filtres et cultivées comme décrit dans l'étape 4.

Résultats

Afin de suivre le mouvement du premier follicule dentaire molaire, 250 um tranches frontales ont été prises au moyen d'un maxillaire inférieur en utilisant la méthode décrite ci-dessus. Le follicule dentaire est la couche de mésenchyme qui entoure l'émail épithélium externe (OEE) de la dent de développement, et a été montré précédemment pour participer à la formation de tissus du parodonte ^6. Mandibules ont été disséqués à E14.5, l'étape de bouchon de développement des dents. Dans la tranche le contour de l'é...

Discussion

Cette méthode de culture de la dent présente l'avantage que l'accès au germe de la dent est excellente, ce qui permet lignée de traçage précis et le placement des billes à l'intérieur de l'épithélium ou du mésenchyme. Régions définies du germe dentaire en développement peuvent donc être spécifiquement ciblées. Au cours de la culture de la morphologie évolution du germe de la dent peut être suivie, et l'effet de manipulations a rapidement évalué.

Le procédé, cependant, ne ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol	VWR	101077Y	100 % éthanol a été dilué dans du H2O distillé à 70
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Pénicilline-streptomycine	Sigma	P0781
DiI (Sondes moléculaires)	Vybrant	V-22885	Solution de
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( Sondes moléculaires)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Stérilisation à la chaleur sèche
McIlwain hachoir à tissus Ted	Pella, Inc.	10180	Table standard
Plat de culture d’organes (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (inserts de culture cellulaire, 0.4 &mu ; m taille des pores)	BD Falcon	353090	Membrane gravée sur chenilles en PET, format 6 puits
Grilles métalliques (acier inoxydable - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubateur	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Picospritzer monocanal III
Capillaire en verre avec filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Fil de tungstène 0,1 mm	Goodfellow	W005138
Fil de tungstène 0,38 mm	Goodfellow	W005155
Tubes d’aspirateur	Sigma	A5177	Utilisé pour les traceurs de lignée d’aspiration buccale