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Article de méthode

Implantation de fenêtres de moelle épinière en verre chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

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DOI :

10.3791/50826

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21 décembre 2013

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1Developmental Biology Institute of Marseille-Luminy (IBDML), Aix Marseille University, 2Campus de la Timone, European Research Center for Medical Imaging (CERIMED)

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode d’implantation et de maintien de fenêtres en verre sur les moelles épinières exposées de souris adultes pour l’étude expérimentale de l’encéphalomyélite auto-immune. Ces fenêtres fournissent un accès optique chronique à la moelle épinière pour surveiller la dynamique cellulaire au niveau subcellulaire chez les animaux vivants à l’aide de la microscopie à deux photons.

Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) chez les rongeurs adultes est le modèle expérimental standard pour l’étude des maladies démyélinisantes autonomes telles que la sclérose en plaques. Nous présentons ici un protocole d’implantation de fenêtres en verre peu coûteux et reproductible qui convient à la microscopie intravitale et à l’étude de la dynamique de la cytoarchitecture de la moelle épinière avec résolution subcellulaire chez des souris adultes vivantes atteintes d’EAE. Brièvement, nous exposons chirurgicalement les vertèbres T12-L2 et construisons une chambre autour des vertèbres exposées à l’aide d’une combinaison de cyanoacrylate et de ciment dentaire. Une laminectomie est réalisée de T13 à L1, et une fine couche d’élastomère de silicone transparent est appliquée sur la surface dorsale de la moelle épinière exposée. Une lamelle en verre modifiée est implantée sur la moelle épinière exposée, en veillant à ce que le verre n’entre pas en contact direct avec la moelle épinière. Pour réduire l’infiltration de cellules inflammatoires entre la fenêtre et la moelle épinière, un traitement anti-inflammatoire est administré tous les 2 jours (tel que recommandé par le comité d’éthique) pendant les 10 premiers jours après l’implantation. L’EAE n’est induite que 2 à 3 semaines après l’arrêt du traitement anti-inflammatoire.

En utilisant cette approche, nous avons réussi à induire l’EAE chez 87 % des animaux avec des fenêtres implantées et, en utilisant des souris Thy1-CFP-23 (axones bleus dans la moelle épinière dorsale), nous avons quantifié la perte axonale tout au long de la progression de l’EAE. Dans l’ensemble, ce protocole peut être utile pour étudier le recrutement de diverses populations cellulaires ainsi que leur dynamique d’interaction, avec une résolution subcellulaire et pendant de longues périodes. Cette modalité d’imagerie intravitale représente un outil précieux pour développer des stratégies thérapeutiques pour traiter les maladies démyélinisantes auto-immunes telles que l’EAE.

Introduction

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune du SNC qui provoque des lésions progressives de la myéline et des axones. Le modèle de recherche standard pour les maladies démyélinisantes auto-immunes du SNC est l’EAE chez les rongeurs adultes. Cependant, les événements cellulaires dynamiques sous-jacents à la progression de l’EAE restent largement inexplorés. Une approche consiste à utiliser la microscopie intravitale à deux photons pour visualiser les populations cellulaires avec des marqueurs fluorescents pendant de longues périodes dans la moelle épinière de souris adultes atteintes d’EAE.

La microscopie intravitale à deux photons est un moyen puissant d’étudier la physiologie cellulaire, les interactions cellulaires et la progression dynamique de la maladie chez les animaux vivants avec une résolution subcellulairede 1. Cependant, un obstacle majeur à l’approche est qu’elle nécessite un accès optique à la région d’intérêt. Par exemple, les fenêtres en verre crânien sont une méthodologie bien établie pour imager de manière répétée les mêmes microstructures dans le cerveau pendant plusieurs semaines2,3. L’adaptation de cette méthodologie à l’imagerie de la moelle épinière n’est cependant pas simple et nécessite plusieurs modifications techniques pour immobiliser le tissu rachidien dorsal au sein des vertèbres articulées.

Auparavant, l’accès optique à la moelle épinière nécessitait une réexposition chirurgicale de la moelle épinière au début de chaque séance d’imagerie et de suture de la peau fermée à la fin de chaque séance4-12. Ces chirurgies répétées sont traumatisantes pour l’animal, limitent le nombre et la durée des séances d’imagerie et augmentent la probabilité d’artefacts liés à la chirurgie tels que l’inflammation et les dommages à la moelle épinière par perturbation mécanique. Pour pallier ces lacunes, nous avons récemment mis au point un protocole permettant d’implanter des fenêtres en verre sur la moelle épinière exposée de souris transgéniques fluorescentes adultes atteintes de lésions traumatiques de la moelle épinière pour des expériences de microscopie à deux photons in vivo à long terme sans chirurgies répétées13. Nous présentons ici une adaptation détaillée du protocole d’implantation dans le contexte de son application pour étudier les événements cellulaires dynamiques sous-jacents à la progression de l’EAE chez la souris adulte.

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Protocole

1. Préparation de la fenêtre et de la structure de support

  1. Préparation de la fenêtre - préparez plusieurs fenêtres de différentes tailles (largeur = 1,8-2,2 mm ; longueur = 4,5-5,2 mm) pour l’implantation.
    1. Fabrication de la fraise de forage modifiée pour couper le verre de couverture - à l’aide d’une quantité généreuse de ciment dentaire, fixez une fraise de forage à un arbre (dans notre cas, de vieilles pinces Bulldog). Assurez-vous que la meule est à ~45° par rapport à l’arbre pour une manipulation plus facile.
      Remarque : les scribes en diamant fonctionnent également bien pour couper le verre de couverture.
    2. Fabrication de la diapositive A - à l’aide d’une lame de microscope standard, collez une courte feuille de papier règle (~2 cm) au bas de la lame afin que vous puissiez voir la règle à travers le verre. Ensuite, placez un morceau de ruban adhésif le long du bord de la marque de 0 mm de la règle pour servir de fixation pour le verre de protection à l’étape suivante.
    3. À l’aide de la fraise de foret modifiée, de la lame A et d’une lame de microscope non modifiée (diapositive B), positionnez un morceau de verre de protection (n° 1,5 d’épaisseur) jusqu’à la marque de 0 mm sur la diapositive A. Utilisez la glissière B pour maintenir le verre de protection en place et comme gabarit pour la ligne de coupe prévue. Découpez le verre de protection en un long rectangle d’environ 5 x 22 mm. Faites pivoter le verre coupé de 90° et coupez le rectangle en un rectangle plus petit de ~2 x 5 mm.
  2. Modifications d’agrafes - deux agrafes modifiées seront implantées pour soutenir et fixer la chambre de la fenêtre aux vertèbres (voir section 2.7-8).
    1. À l’aide d’une petite agrafe standard (couronne = 8 mm ; jambe = 4 mm), pliez le milieu de la couronne à ~90° de manière à ce que les extrémités des pattes se touchent presque.
    2. Pliez les extrémités des pattes vers l’extérieur à ~45° à mi-chemin, de sorte que la moitié distale des jambes soit parallèle.
    3. Pliez la moitié distale des pattes de ~30° vers le haut par rapport au plan de l’agrafe. Placez les agrafes modifiées dans de l’éthanol avant l’intervention chirurgicale pour la stérilisation.
      Remarque : Les agrafes peuvent également être stérilisées à l’oxyde d’éthylène ou à l’autoclave.
  3. Modifications du trombone - préparer un trombone modifié à implanter dans la chambre (voir sections 2.9 et 10) et à servir de clip de maintien pour la chirurgie et l’imagerie.
    1. À l’aide d’un trombone standard de 25 mm, retirez le petit pli en laissant une forme en U allongée.
    2. À l’aide d’une pince ou d’un tourne-aiguille, réduisez le diamètre du coude à ~2 mm tout en gardant les pointes parallèles.
    3. Pliez les pointes vers l’extérieur à ~90° à environ 8-10 mm de la courbure. Faites tous les ajustements nécessaires pour qu’il repose à plat.

2. Implantation de fenêtres

Remarque : Toutes les interventions chirurgicales et de soins aux animaux ont été effectuées conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes et ont été approuvées par le Comité national d’études animales de France (autorisation n° 13 300).

  1. Anesthésier la souris (Ket/Xyl ; dose d’induction : 120 mg/kg, 12 mg/kg ; dose supplémentaire, 40 mg/kg, 4 mg/kg), appliquer une pommade oculaire sur les yeux.
  2. Rasez son dos d’environ ~2 cm de large sur ~5 cm de long, centré sur la bosse thoracique, et nettoyez la peau exposée avec du savon iodé suivi d’une solution iodée. Nettoyez les gants en les vaporisant avec de l’éthanol à 90 %.
  3. À l’aide de ciseaux à tissus, coupez la peau dorsale longitudinalement au-dessus des vertèbres T11 à L1 (~2 cm). À l’aide d’un scalpel, faites des incisions longitudinales bilatérales entre les apophyses épineuses et transversales de T11 à L1. Remarque : Si des gants ou des instruments entrent en contact avec la fourrure ou la peau de l’animal, nettoyez à nouveau les gants ou l’instrument à l’aide d’un stérilisateur à froid tel que de l’éthanol à 90 % ou du Germ-X.
  4. Suspendez la souris dans la fourche vertébrale stéréotaxique - Commencez par serrer la fourche vertébrale en haut à droite en position. Saisissez T11 à l’aide d’une pince Adson et positionnez l’apophyse transversale T11 sur la fourche vertébrale fixe. Tout en maintenant la vertèbre en place, fixez la fourche vertébrale controlatérale sous le processus transverse controlatéral.
  5. En utilisant la même procédure que l’étape 2.4, positionnez L1 dans la fourche vertébrale.
  6. À l’aide d’un scalpel (n° 23), grattez doucement les muscles entre les apophyses épineuses et transversales de T11 à L1 afin que les lames soient clairement visibles. Pour une meilleure vue des pédicules de T11, coupez le tendon faisant saillie rostralement à partir de l’extrémité de l’apophyse transverse.
  7. Rincez les agrafes modifiées avec du PBS et insérez les pointes des agrafes latéralement aux pédicules vertébraux de T11 et L1 en ajustant la distance entre les pointes de manière à ce qu’elles touchent légèrement les pédicules.
    Remarque : Utilisez uniquement du PBS contenant de la dexaméthasone (0,1 %), de la pénicilline (1 000 U/ml) et de la streptomycine (1 mg/ml), pour réduire l’inflammation postopératoire et améliorer la clarté de la fenêtre.
  8. Collez les agrafes en place avec une petite goutte de cyanoacrylate à chaque point d’insertion et retirez la souris des fourches vertébrales.
  9. Appliquez une fine couche de cyanoacrylate sur les bords coupés de la peau et les muscles exposés autour des vertèbres dégagées, en prenant soin de ne pas coller les vertèbres. Pliez les pointes du trombone modifié de manière à ce qu’elles pénètrent sous les sections saillantes des agrafes implantées et reposent parallèlement à l’axe long de la colonne vertébrale isolée et partent dans cette position.
  10. En commençant par l’interface peau-muscle, appliquez plusieurs couches de ciment dentaire pour couvrir toute l’ouverture à l’exception des vertèbres exposées, en vous assurant d’implanter le trombone en toute sécurité dans le ciment dentaire.
  11. Une fois le ciment dentaire durci (5 à 15 min), fixez la souris au « support de clip » par la partie exposée du trombone implanté. À l’aide d’une pince, retirez le muscle et les autres tissus mous entre les apophyses épineuses et les lames des vertèbres exposées.
    Remarque : Tout appareil capable de saisir en toute sécurité la partie exposée du trombone sans causer de stress au clip/à la chambre, et qui peut être manœuvré pour réorienter la souris tout au long de la chirurgie peut être utilisé comme « support de clip ».
  12. À l’aide de la perceuse d’élimination osseuse, amincissez les lames de T12 et T13 bilatéralement. Pour retirer l’os dorsal, saisissez l’apophyse épineuse à l’aide d’une pince émoussée et soulevez-la en prenant soin de ne pas appliquer de force vers le bas vers la moelle épinière. Si l’os ne se détache pas facilement, continuez à amincir les lames jusqu’à ce que l’apophyse épineuse puisse être facilement retirée.
  13. À l’aide de la perceuse d’ablation osseuse, continuez à façonner les bords latéraux des vertèbres pour former une structure de support pour la fenêtre. Retirez délicatement tous les petits fragments d’os touchant la dure-mère à l’aide d’une pince émoussée. Assurez-vous de maintenir l’humidité de la dure-mère à l’aide de PBS.
  14. Choisissez l’une des fenêtres préparées qui est légèrement plus large que l’ouverture de la laminectomie et testez sa capacité à reposer sur l’os exposé. Idéalement, la fenêtre reposera bilatéralement sur les deux vertèbres de sorte que le milieu de la fenêtre touche la dure-mère (Figure 1a). La fenêtre ne doit cependant pas comprimer la moelle épinière, même en poussant la fenêtre vers la moelle épinière. Si la fenêtre est déséquilibrée ou repose au-dessus de la dure-mère, répétez l’étape 2.13.
  15. Une fois satisfait de la laminectomie, placez un petit morceau de papier de soie autoclavé imbibé de PBS sur la moelle épinière pour éviter le dessèchement de la dure-mère et mettez la souris de côté.
  16. Nettoyage de la fenêtre - placez la fenêtre dans une solution de nettoyant pour vitres pendant plusieurs secondes. À l’aide d’un morceau de tissu pour lentille de microscope, essuyez la fenêtre. Avec le microscope chirurgical, vérifiez que la fenêtre est propre et répétez le processus de nettoyage si ce n’est pas le cas. Placez la fenêtre dans un endroit propre et facile d’accès pour une récupération et un placement rapides de la fenêtre à l’étape 2.19.
  17. Récupérez la souris et retirez le papier de soie. Retirez délicatement tous les débris de la dure-mère à l’aide d’une pince émoussée et laissez la dure-mère sécher jusqu’à ce qu’elle soit légèrement collante.
  18. Remplissez rapidement le tube mélangeur en silicone (Kwik-sil) et extrudez le silicone sur une lame propre jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles sortant de la pointe. Administrez immédiatement un petit cordon de silicone le long de la ligne médiane de la moelle épinière exposée.
  19. Récupérez les vitres nettoyées à l’aide d’une pince émoussée et placez-la immédiatement sur le silicone. À l’aide de la pince émoussée, appliquez une petite pression sur la fenêtre pour étaler le silicone sur les bords de la fenêtre et maintenez-le en place pendant ~1 min.
    Remarque : Avant le mélange, le silicone doit être stocké à une température inférieure à 27 °C, sinon le temps de durcissement peut augmenter considérablement et il n’adhérera pas à la fenêtre ou à la dure-mère, ce qui entraînera une réduction de la clarté optique.
  20. Relâchez lentement la pression de la fenêtre. Si la fenêtre ne bouge pas, passez immédiatement à l’étape 2.21. Si, toutefois, la fenêtre se lève lorsque la pression est relâchée (c’est-à-dire que les vertèbres bougent), passez à l’étape 2.21 tout en maintenant la pression sur la fenêtre pour la maintenir en place.
  21. Appliquer le cyanoacrylate rostral et caudal de la fenêtre. Si le cyanoacrylate ne couvre pas les bords rostral et caudal de la fenêtre, utilisez un cure-dent pour guider une partie du cyanoacrylate liquide sur ces bords. Ensuite, guidez la colle le long des bords latéraux de la fenêtre (Figure 1a) pour couvrir tous les muscles environnants. Remarque : Le cyanoacrylate doit couvrir la surface des bords extérieurs de la fenêtre. Trop de cyanoacrylate peut compromettre la clarté optique, pas assez de cyanoacrylate entraînera des bulles d’air entre le silicone et la fenêtre.
  22. Pour protéger le cyanoacrylate et augmenter l’intégrité structurelle de la chambre, appliquez du ciment dentaire sur toutes les régions recouvertes de cyanoacrylate (Figure 1a). Comme pour le cyanoacrylate, commencez par les bords rostral et caudal et utilisez un petit bâton de bois pour guider le ciment dentaire le long des bords de la fenêtre.

3. Soins postopératoires, induction EAE et entretien des fenêtres

  1. Injecter de la dexaméthasone (0,2 mg/kg) et du Rimadyl (5 mg/kg) s.q. sur les régions pelviennes. Transférez la souris dans une cage chaude (~26 °C) avec du matériel d’emboîtement. Les souris doivent être complètement mobiles, explorer leur cage et se toiletter une fois que les effets de l’anesthésique ont complètement disparu (généralement 2-3 heures). Hébergez les animaux individuellement et assurez-vous qu’ils ont un accès facile à la nourriture et à l’eau pendant les 1 à 2 premiers jours. Une fois que la souris commence à se remettre de l’anesthésique, injectez de la buprénorphine (0,05 mg / kg) s.q. Après s’être complètement rétablie de l’anesthésie, la souris ne devrait montrer aucun signe de douleur. Remarque : Une fois complètement rétabli de l’anesthésie, tout signe de douleur ou d’activité motrice anormale indique que la fenêtre n’a pas été implantée correctement.
  2. Injecter de la dexaméthasone (0,2 mg/kg) et du Rimadyl (5 mg/kg) tous les 2 jours pendant les 10 premiers jours suivant la chirurgie (Figure 1a). Pour injecter des souris avec des fenêtres, endormir légèrement l’animal avec de l’isoflurane dans une chambre d’induction (~1,75 % d’isoflurane dans l’air pendant 1-2 min). Retirez la souris de la chambre et injectez immédiatement les médicaments. La souris doit être complètement réveillée dans <1 min.
    Remarque : Ne frottez pas les souris avec des fenêtres implantées car cela peut provoquer la séparation de la peau de l’implant. Il est possible d’injecter des souris i.p. sans sédation en leur permettant de saisir un couvercle de cage avec leurs pattes avant et en soulevant doucement leurs membres postérieurs. Cependant, dans cette position, la souris s’éloigne parfois, ce qui stresse la fenêtre implantée. Cela peut entraîner des saignements entre la fenêtre et la moelle épinière, compromettant ainsi la clarté optique.
  3. L’EAE peut être induite 2-3 semaines après l’arrêt du traitement anti-inflammatoire (~3-4 semaines après la chirurgie). Mettez la souris sous sédatif léger comme décrit à l’étape 3.2. Retirez la souris de la chambre d’induction et maintenez la sédation avec un masque à l’isoflurane placé sur le nez.
  4. Injecter le peptide MOG35-55 (75 μg dans l'adjuvant de Freund contenant 800 μg de mycobacterium tuberculosis) dans 3 emplacements s.q. différents (bilatéralement sur le fémur et à la base de la queue), et la toxine coquelucheuse (400 ng) i.p.14,15
    Remarque : Les souris atteintes d’EAE nécessitent des soins supplémentaires par rapport aux souris avec des fenêtres uniquement. Pesez les souris EAE tous les jours et assurez-vous qu’elles ont un accès facile à la nourriture et à l’eau à tout moment. Complétez avec une gelée d’agarose à 3 % contenant pour maintenir l’hydratation et le poids de l’animal. Le glucose (1-3 %) peut également être ajouté à la gelée pour des calories supplémentaires.
  5. Deux jours après l’induction de l’EAE, répétez le protocole de sédation décrit à l’étape 3.2 et injectez une deuxième dose de toxine coqueluche (400 ng) i.p.
  6. Pour imager la moelle épinière, il faut d’abord endormir l’animal comme décrit à l’étape 3.2 et l’anesthésier légèrement avec de la kétamine/xylazine (100 mg/kg ; 10 mg/kg) i.p. Cela fournira ~ 1 heure d’imagerie.
  7. Pour les séances d’imagerie d’une durée de <2 heures, une anesthésie légère peut être maintenue avec des injections supplémentaires de kétamine/xylazine (50 mg/kg ; 5 mg/kg) toutes les 45 à 60 minutes. Alternativement, pour des séances d’imagerie plus longues, les souris peuvent être mises sous sédation continue avec de l’isoflurane (0,75-1,25 % d’isoflurane dans l’air humidifié).
    Remarque : les fenêtres peuvent être nettoyées au microscope chirurgical en essuyant doucement les débris avec le coin d’un mouchoir ou un coton-tige. N’utilisez pas d’alcool pour nettoyer la fenêtre car cela peut dégrader certains types de ciment dentaire et refroidir la moelle épinière.
  8. Une fois légèrement anesthésiée, la souris est solidement fixée à un porte-clip par la partie exposée du trombone implanté (Figure 1b).
  9. La moelle épinière est alignée perpendiculairement à la lentille de l’objectif en ajustant le positionnement du clip dans le support, en ajustant la position du support et en ajustant la position de la platine. La surface dorsale de la moelle épinière est rapidement imagée, et le système vasculaire dorsal est utilisé pour déterminer l’orientation de la moelle épinière.

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Résultats

L'utilisation de fenêtres en verre implantées de façon chronique combinée à la microscopie intravitale à deux photons et aux modèles de EAE pourrait constituer un outil utile pour comprendre les mécanismes cellulaires à l'origine de la pathologie des maladies auto-immunes démyélinisantes. Grâce à notre méthode d'implantation, nous avons constaté que la majorité des fenêtres étaient transparentes au moment de l'induction de la EAE, et sont restées claires tout au long de la progression de la maladie (Figure 1c

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Discussion

Nous avons décrit une méthode d’implantation et de maintien de fenêtres en verre sur la moelle épinière exposée de souris adultes afin d’étudier la progression dynamique de l’EAE au fil du temps. Une approche similaire d’implantation de fenêtres en verre a été utilisée pour étudier des modèles de lésions de la moelle épinière13 et peut également être utile pour étudier d’autres pathologies de la moelle épinière telles que les glioblastomes, la méningite ou la physiologie cellulaire de la moelle épinière normal...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen et S. Meijia-Gervacio pour des discussions utiles ; M. Hocine et C. Meunier, ainsi que le personnel des installations d’imagerie animale et PicSIL de l’IBDML pour l’appui technique. Ces travaux ont été soutenus par une subvention institutionnelle du Centre National de la Recherche Scientifique, et par des subventions de l’Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (à G.R. et K.K.F), de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), de la Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) de l’Institut de Recherche sur la Moelle Épinière (IRME) (à FD). K.K.F. a été soutenu par une bourse de l’ARSEP. L’imagerie a été réalisée sur l’installation d’imagerie PIcSIL de l’IBDML.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Foret d’ablation osseuseWorld Precision InstrumentsIDEAL MICRO-DRILLÉgalement vendu par Harvard Apparatus.
N’importe quelle perceuse chirurgicale osseuse de haute qualité suffira.
Fraise de perceuse (#1/4 ou 1/2 Carbide Round Burr)World Precision Instruments501860 (#1/4)
501860 (#1/2)		Aussi vendu par Harvard Apparatus
StaplesLyreco5.002.567Couronne = 8 mm
Jambe = 4 mm
TromboneN’importe quel trombone
Tourne-aiguillesOutils scientifiques fins12003-15
Ciseauxà tissusFine Science Tools14028-10
Pince Adson FineScience Tools11027-121 x 2 dents
Pince émousséeFine Science Tools11293-00
Fourches vertébralesHarvard Apparatus Harvard724813
Ciment dentaireGACD12-565 & 12-568
Élastomère de siliconeWorld Precision InstrumentsKWIK-SILÉgalement disponible auprès de Coherent Scientific et Fisher Scientific
CyanoacrylateEleco-EFDCyanolit 201
MicroscopeZeiss7MPNotre microscope est en configuration verticale et est équipé de 5 détecteurs NDD.
ObjectifZeissW Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mmDistance de travail = 1.8 mm
standard de 25 mm

Références

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