Article de méthode

Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei

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DOI :

10.3791/50829

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17 février 2014

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1Department of Infectious Diseases, Parasitology Unit, University Hospital Heidelberg, 2Priority Area Infections, Research Center Borstel

Dans cet article

Résumé

La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l'épreuve avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie naturelle de l'infection.

Résumé

Les co-infections se produisent naturellement en raison du chevauchement géographique des différents types de micro-organismes pathogènes. Infections concomitantes plus susceptibles de moduler la réponse immunitaire respective de chaque agent pathogène unique et peuvent de ce fait influer sur la pathogenèse et le résultat de la maladie. Patients co-infectés peuvent également répondre différemment aux interventions anti-infectieux. La co-infection entre la tuberculose causée par des mycobactéries et le parasite du paludisme Plasmodium, qui sont tous deux coendemic dans de nombreuses parties de l'Afrique subsaharienne, n'a pas été étudiée en détail. Afin d'aborder le difficile, mais scientifiquement et cliniquement question très pertinente comment le paludisme-tuberculose co-infection moduler l'immunité de l'hôte et au cours de chaque maladie, nous avons établi un modèle expérimental chez la souris qui nous permet de disséquer les réponses immunitaires induites à la fois des agents pathogènes chez l'hôte co-infectés . Il convient de noter, pour la plupart des infections humaines précisément imiter naturellement acquis, nous effectuons expérimentalinfections de la souris avec les deux agents pathogènes par leurs voies naturelles de l'infection, à savoir aérosol et piqûre de moustique, respectivement.

Introduction

Les populations humaines sont rarement exposés à un agent pathogène seulement. En particulier dans les régions à forte incidence d'infections telles que l'Afrique sub-saharienne, les co-infections représentent un problème de santé publique prime mais très sous-estimé. La tuberculose et le paludisme sont des infections bactériennes et parasitaires les plus répandues chez l'homme, respectivement, et continuent d'être les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Malgré le large chevauchement géographique entre la tuberculose et le paludisme et le grand nombre de personnes à risque de co-infection, on sait très peu sur les interactions entre les différents et souvent contrecarrant les régulateurs et effecteurs immunitaires induites simultanément contre les parasites du paludisme et les bacilles tuberculeux co-infectés individus.

modèles de rongeurs d'infections mixtes permettent de caractériser les réactions immunitaires différentiels contre les agents pathogènes distincts dans un hôte, perdant ainsi en lumière la mutuelle influencerences moduler la pathologie et les résultats cliniques de la maladie individuelle, ce qui contribuera également à identifier de nouvelles recommandations pour le traitement et la prévention. Nous avons établi un modèle expérimental chez la souris qui nous permet d'étudier les conséquences causées par une infection concomitante par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et les espèces de Plasmodium de rongeurs dans le même hôte 1. Il est important, pour émuler des infections humaines naturellement acquis aussi étroitement que possible, notre modèle met en œuvre les voies naturelles d'infection utilisés par les deux agents pathogènes. La tuberculose est une infection par voie aérienne, qui se manifeste donc principalement dans les poumons. L'agent causal, Vtt est transmis par des personnes ayant une maladie active par voie d'aérosol quand ils expulsent des gouttelettes infectieuses d'aérosols lors de la toux ou les éternuements. Ainsi, l'infection de l'aérosol est la méthode de choix pour imiter une infection naturelle. Génération de particules en suspension qui contiennent Mtb peut être obtenue par l'utilisationd'un système d'exposition par inhalation. Toute cette chambre d'exposition du corps permet d'exposer les animaux de laboratoire à Vtt contenant infectieuses gouttelettes d'aérosol (figure 1) qui sont inhalées dans les alvéoles des poumons où l'infection est initiée 2.

Paludisme d'autre part est une maladie à transmission vectorielle causée par le protozoaire, apicomplexe parasite Plasmodium qui est transmis naturellement par la piqûre d'un moustique anophèle femelle. Pendant le repas de sang, les sporozoïtes infectieux sont déposés sous la peau de l'hôte et atteindre ensuite le foie via la circulation sanguine. Dans les hépatocytes ils développent et se multiplient rapidement dans schizontes stade hépatique. Finalement, schizontes matures se rompent et libèrent des milliers de pathogènes mérozoïtes de première génération dans le sang où ils initient un cycle progressif de l'invasion des globules rouges, la réplication, la rupture des globules rouges, et une nouvelle invasion 3. Le Contin du cycle de vie de Plasmodiumues que certains mérozoïtes se développent dans les stades parasitaires sexuels, les hommes et les femmes gamétocytes, qui peuvent être prises par les moustiques pendant les repas de sang. Dans le moustique, Plasmodium sporozoïtes se développent dans les oocystes résidant dans l'intestin moyen de moustiques et finalement migrent vers les glandes salivaires pour transmission ultérieure dans un autre 3,4 hôte.

Alors que dans les modèles animaux expérimentaux la livraison de VTT par l'aérosol et itinéraire ainsi plus pertinent est très commun, de nombreuses études d'infection rongeur de Plasmodium expérimentales y compris des études sur le paludisme-tuberculose co-infection 5-7 ont été effectués en infectant des souris avec des hématies parasitées, donnant lieu à l'infection du paludisme au stade sanguin tout en excluant la phase cliniquement silencieuse stade hépatique. Cependant, l'étape de foie est une étape obligatoire lors de l'infection et pertinentes pour l'immunité anti-Plasmodium 8-11. Nous considérons qu'il est donc important d'inclure le ph hépatiquease de la transmission du paludisme et de la maintenance dans les études de paludisme et de la tuberculose paludisme co-infection, respectivement. En outre, il a été montré que les sporozoïtes sont transmises naturellement plus contagieux que celles qui sont transmises par l'intermédiaire d'infections de l'aiguille 12, ce qui nous a incité à établir l'infection de la malaria par piqûre de moustique au lieu d'injecter isolé des glandes salivaires dérivés des sporozoïtes. La seule façon d'obtenir les moustiques infectieux pour la transmission naturelle de parasites du paludisme est de maintenir l'ensemble du cycle de vie du parasite dans l'hôte vertébré (ici de la souris) et le moustique vecteur. Ainsi, l'accès à un insectarium pour la maintenance du parasite est inévitable afin d'effectuer la transmission naturelle par morsure.

Notre protocole décrit ici a été développé pour étudier comment la co-infection par Plasmodium sporozoïtes impacts sur la tuberculose chronique 1. Pour ce faire, les souris sont infectées par aérosol M. la tuberculose et 40 jours plus tard, lorsque M. infection de la tuberculose a atteint la phase chronique, les souris sont exposées à des moustiques vecteurs du paludisme infectieuse. Le résultat de la malaria et la tuberculose à la fois chez les animaux co-infectés peut être suivie en surveillant la parasitémie sanguine et de la charge bactérienne dans les tissus, respectivement. Dans notre protocole, nous allons décrire en détail comment infecter des souris avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie d'infection naturelle et la façon de confirmer la transmission d'agents pathogènes succès. Dans nos mains, le taux d'infection atteint couramment pour les infections expérimentales est de 100%. Ces protocoles peuvent être appliqués à l'étude des infections ou séparément, comme nous le faisons, pour modéliser et étudier la co-infection entre deux des maladies infectieuses humaines les plus difficiles. Ce modèle est applicable à d'autres espèces de Mycobacterium et rongeurs Plasmodium au-delà de celles qui sont décrites dans ce protocole.

Protocole

Mesures de sécurité et déclaration de l'éthique

Les études présentées ici portent sur ​​les travaux de l'agent pathogène humain Vtt et le parasite rongeur paludisme à Plasmodium berghei (P. berghei). Des expériences avec des Vtt (souche H37Rv) et P. berghei doit être effectuée dans les conditions de biosécurité appropriées. niveau de biosécurité (BSL) 2 laboratoires sont nécessaires pour les parasites du paludisme des rongeurs tels que P. berghei et BSL 3 pour Vtt et donc, pour toutes les études de co-infection sont décrits. REMARQUE: Les souris infectées par Mtb ne se propagent pas l'infection à d'autres souris dans les environs immédiats (notre observation). Propagation à l'expérimentateur peut donc être exclu; vêtements de protection toutefois approprié doit être porté à l'intérieur du laboratoire BSL 3 en tout temps. Selon nos règles, les expérimentateurs portent gommages chirurgicales, filets à cheveux, masques jetables, et deux paires de gants, dont celui de l'extérieur sont mises au rebut chaque fois qu'unrms sont retirés de l'armoire. Nouveaux sont mis en avant d'entrer de nouveau le cabinet. Deux conteneurs, une avec 2% Buraton (NOTE: d'autres désinfectants agréés pour inactiver Vtt peuvent être utilisés à la concentration agréée) de liquide et des déchets infectieux et un pour la décontamination de surface, sont préparés avant l'expérience et placés à l'intérieur de l'armoire. En outre, des sacs en plastique seront utilisés pour les déchets non infectieux solide. Selon la réglementation allemande, tous les travaux impliquant la manipulation et le traitement des cultures vtt ou de tissus provenant de souris infectées Vtt doivent être effectuées dans un enceinte de sécurité biologique de classe 2 dans un laboratoire BSL3. Alors que les mycobactéries manutention, des mesures doivent être prises pour éviter la production d'aérosols à tout moment.

Femme souris C57BL / 6 (Charles River) âgés de 6-8 semaines ont été utilisés pour toutes les expériences de co-infection et maintenu dans des conditions de barrière spécifiques BSL 3 Installations. Les soins et l'expérimentation étaient performed conformément aux protocoles approuvés par le comité d'éthique pour l'expérimentation animale du ministère de l'Agriculture, de l'Environnement, et les zones rurales de l'État de Schleswig-Holstein

Pour obtenir les étapes de moustiques paludéens, souris NMRI ont été achetés chez Charles River Laboratory, Sulzfeld, Allemagne et conservés dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques au sein de l'animalerie de l'Université de Heidelberg (IBF). Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux réglementations européennes et approuvés par les autorités de l'Etat du Bade-Wurtemberg (Regierungspräsidium de Karlsruhe).

Une. Aérosol infection de souris avec l'aide d'un aérosol Vtt Chambre Glas-Col

La meilleure façon de normaliser infection aérosol d'animaux de laboratoire avec Vtt est d'utiliser des mycobactéries de stocks congelés avec des titres connus UFC. Pour préparer les cultures d', culture Vtt dans le bouillon Middlebrook 7H9 complétée par OADC (oléiquel'acide, de l'albumine, dextrose, catalase) et 0,05% de milieu d'enrichissement du Tween 80, une source de carbone pour mesurer les mycobactéries et pour éviter l'agglutination bactérienne en même temps. Les cultures doivent avoir une OD ≤ 1 au moment de la récolte. A DO supérieures, l'augmentation de l'agglutination de bactéries et la viabilité diminue. Magasin aliquotes de 1 ml à -80 ° C. Déterminer le nombre de colonie viable unités (CFU) dans les stocks surgelés par placage d'une série de dilutions de 10 fois de trois flacons indépendants sur des plaques de gélose 7H11 supplémenté avec 0,5% de glycérol, 1 g / L asparagine former, et OADC et énumérer les colonies après 4 semaines d'incubation à 37 ° C. Effectuer infection aérosol comme décrit ci-dessous.

  1. Les stocks dégel vtt de connue titre UFC et mélanger délicatement la suspension à cinq reprises pour disperser des amas de bactéries en utilisant une seringue de 1 ml munie d'une aiguille 27 G. Éviter la production d'aérosols.
  2. Selon la dose d'infection désiré, transférer le volume requis du stock mycobactérienne dansun tube de 50 ml contenant du PBS stérile. Le volume final est de 6 ml. NOTE: En faisant varier le nombre de micro-organisme dans cette suspension, la proportion de bactéries portant des gouttelettes d'aérosol est variée. Nous visons habituellement à une absorption de 100 bacilles viables par poumon (infection à faible dose). Dans notre expérience, ce qui nécessite environ 1-2 x 10 6 vtt / ml dans un volume total de 6 ml, dont 5,5 ml sont NEBULIZEE (voir ci-dessous). Il est recommandé de faire une série de défis d'aérosols expérimentaux avec différentes concentrations de bactéries de trouver les conditions idéales pour votre infection. Tandis que les infections à haute dose avec un maximum de 5000 mycobactéries peut être fait pour accélérer le processus infectieux, aussi peu que 5 bactéries peuvent être utilisés pour infecter des souris avec succès par aérosol. Le taux d'infection est généralement de 100%.
  3. Retirer un volume suffisant (préparé dans l'excès de volume final requis) pour plaquer pour déterminer le titre de l'inoculum, nous enlevons généralement 500 pi à la plaque triple techniques.
  4. Placez animauxun panier compartimenté de maille (une souris par panier) dans la chambre d'aérosol circulaire et fermer le couvercle de la chambre d'aérosol. NOTE: D'autres modèles sont équipés d'un panier en forme de tarte composée de cinq compartiments individuels, dont chacun peut accueillir 20 souris.
  5. Fixez l'unité Venturi nébuliseur à trois des manchons en acier inoxydable.
  6. Retirer la suspension de mycobactéries du tube de 50 ml avec une seringue de 10 ml munie d'une aiguille émoussée 18 G et transporter la seringue à la chambre d'aérosol dans une boîte de transport fermé.
  7. Retirez le bouchon à vis de l'unité de nébuliseur et soigneusement injecter la suspension de mycobactéries dans le nébuliseur. Eviter la formation d'aérosols. Jetez la seringue dans un récipient pour objets tranchants contenant 2% Buraton. Sceller le nébuliseur avec le bouchon à vis.
  8. Allumez l'interrupteur d'alimentation principale et la lampe UV. L'affichage sur le clavier de commande affiche "Glas-Col Appareil Co".
  9. Tournez le commutateur de programme sur. La volonté d'affichageShow "est le nébuliseur prêt?" "Est-ce que le panier chargé?" enter lorsque vous êtes prêt ". Appuyez sur Entrée.
  10. L'écran affiche "Entrer Temps de préchauffage 900", ce qui signifie que le temps de préchauffage de l'incinérateur (qui décontamine l'air d'échappement) est de 900 secondes. Appuyez sur Entrée.
  11. L'écran affichera "Entrez le temps de nébulisation 1800", ce qui signifie que le temps de nébulisation est réglée à 1800 sec par défaut. Afin de prolonger la durée de nébulisation, entrez "2400" et appuyez sur Entrée. Remarque: Au cours du cycle de nébulisation, de l'air sous pression atomise la suspension, générant de ce fait des petites gouttelettes d'aérosol contenant des mycobactéries. Avec le flux d'air principal, ces gouttelettes (environ 2-5 um) sont réalisées dans la chambre d'aérosol.
  12. L'écran affiche "Entrer heure de CD 1800", ce qui signifie que le cycle de décroissance prend 1,800 sec. Réglé sur "2400" et appuyez sur Entrée. REMARQUE: Au cours de ce cycle, le nuage qui a été construit up dans la chambre d'aérosol pendant le cycle de nébulisation peut se désintégrer. Les petites gouttelettes sont inhalées par les animaux de laboratoire.
  13. L'écran affichera "Entrez dec Temps 900", ce qui signifie que le cycle de lumière UV de décontamination aura 900 secondes. Appuyez sur Entrée. La machine va commencer à vélo à travers le préchauffage, nébulisation, nuage décadence et de décontamination UV.
    ATTENTION: Le compteur de débit d'aspiration doit indiquer 60 pieds cubes / h (consultez la fin du cycle de préchauffage commence; ajuster la soupape de contrôle de vide si nécessaire) et le débitmètre d'air comprimé de 10 pieds cubes / h (vérifier quand nébulisation cycle commence, régler la vanne de commande d'air en conséquence ).
  14. Lorsque le cycle est terminé, le clavier affiche "processus complet - Retirer des échantillons". Désactiver le programme, UV et l'interrupteur principal.
  15. Vérifiez si la suspension mycobactérienne a été nébulisée complètement et si pas, enregistrer le volume restant en enlevant soigneusement la suspension avec une seringue appropriée équipée d'une aiguille émoussée 18 G. Le volume restant ne doit pas être supérieur à 1 ml.
  16. Retirez le nébuliseur des joints et placez-le dans une casserole contenant 2% Buraton pour un minimum de 2 heures, généralement la désinfection se fait O / N. Ensuite, transférer le nébuliseur à une nouvelle casserole et bien rincer avec de l'eau. Laissez nébuliseur sécher à l'air.
  17. Ouvrez la chambre d'aérosol et retourner les animaux dans leurs cages. Sac les paniers dans des sacs autoclave et. Nettoyer les surfaces de l'intérieur de la chambre d'aérosol avec 2% Buraton REMARQUE:. Pour des raisons de sécurité, un motorisé adduction d'air filtré devraient être portés durant cette procédure.
  18. En utilisant les 500 ul restants de la suspension mycobactérienne (voir étape 1.3), plaque dilutions de 10 fois d'une triple technique (3 x 100 pi) sur des plaques de gélose 7H11.

2. Vérifiez absorption d'UFC désiré dans les poumons

Un jour après l'infection d'aérosol d'animaux de laboratoire déterminer la lo bactériennel'annonce dans les poumons des animaux témoins désignées afin de vérifier la fixation de la CFU souhaitée. NOTE: Nous désignons habituellement un groupe supplémentaire de 3-5 souris pour le jour 1 détermination UFC.

Pour suivre l'évolution de l'infection Vtt au fil du temps, le fardeau de tissu mycobactérienne peut être examinée en étalant des dilutions en série de broyats d'organes entiers pour la détermination UFC. Le poumon est le principal site de manifestation de la maladie de la tuberculose cependant nœuds rate, le foie et les ganglions lymphatiques sont généralement analysées en conséquence. Les dilutions d'être plaqués dépendent de la charge mycobactérienne prévu dans les organes, qui dépendent de l'inoculum initial (à faible dose par rapport à la dose élevée), ce qui donne lieu à différentes charges bactériennes dans les tissus, ainsi que sur l'organe et le point de temps de analyser. Lors de l'infection à faible dose, la charge bactérienne de Vtt H37Rv dans le poumon atteint généralement un plateau entre le jour 25-30.

  1. Placez animaux euthanasiés (de l'euthanasie: CO 2 asphyxie ouanesthésie terminal) sur du papier absorbant sur une planche de dissection dans une enceinte de sécurité biologique de classe II et désinfecter souris avec 70% d'éthanol. NOTE: 70% d'alcool est pour la décontamination de surface et ne sera pas tuer Vtt.
  2. Faire une petite incision dans le milieu de l'abdomen et de rétracter la peau de la souris au-dessus de la tête.
  3. Ouvrez l'abdomen et la cage thoracique avec des ciseaux chirurgicaux et retirer la paroi thoracique afin que les poumons sont accessibles.
  4. Retirer les poumons et le transférer dans un tube de 15 ml avec du tampon d'homogénéisation (eau stérile / 1% v / v de Tween 80/1% p / v d'albumine).
  5. En utilisant le piston d'une 5 poumons ml de déformation de la seringue à travers un tamis de 100 um dans une petite boîte de Pétri.
  6. Tamis Rincer plusieurs fois à l'aide d'une pipette 1 ml équipé d'une pointe de barrière et de distribuer le broyat de poumon chez les 8 plaques de gélose (ca 250 pl / plaque;. S'assurer qu'ils ont une surface bien sèche).
  7. Plaque avec précaution les échantillons à l'aide épandeurs jetables qui sont éliminés dans 2%Buraton.
  8. Laissez plaques d'agar pour sécher l'intérieur de l'armoire. Sceller chaque plaque unique avec du parafilm, envelopper dans du papier d'aluminium et laisser incuber verticale à 37 ° C pendant au moins 4 semaines.

3. Construction de cages de moustiques s'en échapper

Souches de Plasmodium de rongeurs ne sont pas nocifs pour les humains. Cependant, puisque les souris Vtt infectés sont les bénéficiaires du parasite et le travail se fait sous BSL 3 conditions, des précautions sont nécessaires pour éviter les moustiques de s'échapper de leurs cages. Selon le schéma de l'infection prévu, autoclavable et réutilisable cages à monture métallique ou des cages jetables self-made peut être utilisé. Les dernières sont recommandées si l'infection par morsure des animaux d'expérimentation est nécessaire pour être effectuée par un nombre défini de moustiques par souris. Si des cages de self-made sont nécessaires, préparer des cages aux spécifications exactes que la santé des moustiques et la sécurité du laboratoire dépend de leur soue construction (figure 2).

  1. Prenez un carton comme une demi-pinte carton de crème glacée ou de café de tasse de papier (Figure 2).
  2. Couper une petite ouverture dans le côté de la boîte et couvrir avec une double couche de latex avec une fente découpée dans chaque pièce pour créer une entrée sécurisée pour les moustiques. NOTE: L'ouverture a une taille globale de 2 cm x 2 cm, le tube (dispositif d'aspiration) que nous utilisons pour entrer et / ou à emporter moustiques est un tube de 15 ml Falcon modifié attaché à une pompe à vide et sert donc un aspirateur avec un diamètre de 1,5 cm.
  3. Collez un morceau de papier filtre sur le fond à l'intérieur du carton pour absorber les gouttes.
  4. Fermer tasses de crème glacée avec un filet (double couche de maille de nylon, taille 1 mm x 1 mm) et fixer à la boîte par bande et la bande élastique.
  5. Pour les expériences d'infection là où le nombre de moustiques définis par la souris sont nécessaires, préparer des cages 10-15 moustiques infectés, dont chacun contient idéalement une avverture de 10 000 de type sauvage de la glande salivaire P. sporozoïtes berghei.
  6. Idéalement, affamer les moustiques pendant 24 heures avant de procéder à la farine de sang.

4. Paludisme infection des souris par piqûre de moustique

Le parasite du paludisme rongeur utilisé ici est P. berghei cependant toute autre souche de Plasmodium de rongeur d'intérêt peut être utilisée. Pour obtenir les moustiques infectieux pour la transmission de sporozoïte tout le cycle de vie du parasite est mis à jour à la fois dans l'hôte vertébré (de souris) et le moustique vecteur. maintien des parasites est réalisée dans un insectarium. Pour les expériences de transmission physiques, le nombre minimal de sporozoïtes par la glande salivaire doit pas être inférieur à 10 000. Pour les protocoles détaillés sur l'entretien de parasite nous nous référons aux méthodes de recherche sur le paludisme par Moll et al., 2013.

  1. Anesthésier les souris ou les animaux preinfected pendant 40 jours avec Vtt avec kétamine naïfs (100 mg / kg)et xylazine (7 mg / kg) par injection intrapéritonéale solution (200 ul / souris). NOTE: Le temps entre Vtt et Plasmodium infection peut être ajustée en fonction de la question de recherche sous-jacente. De même, l'ordre des défis d'agents pathogènes peut être inversé, c'est à dire des souris peuvent être exposés à une piqûre de moustique infectieux avant l'infection Vtt.
  2. Placez la souris anesthésiés sur le filet des cages de moustiques (une souris par moustique cage pour moustique définie rapport de la souris) et permettent aux moustiques de se nourrir à travers la membrane pendant 10-15 min. NOTE: La présence de sang dans les entrailles de moustiques implique l'alimentation et donc, la transmission de sporozoïte.
  3. Transfert souris de nouveau dans leurs cages et superviser constamment jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie. NOTE: La place souris sur une serviette en papier et non sur litière (risque d'étouffement) et garder (lieu étroitement ensemble et couvrir corps avec une serviette de papier) chaud.
  4. Tuez les moustiques par pulvérisation avec 70% d'éthanol ou d'autres désinfectants à travers le netment de la cage. Cages autoclave et jetez si jetables ont été utilisés.

5. Parasitémie surveillance

  1. Ponction queue veines à la fin avec une aiguille et de recueillir une goutte de sang à chaque extrémité d'une lame.
  2. Utilisez une autre diapositive de tirer une goutte de sang plus de la moitié de la longueur de la lame. Retournez l'épandeur d'utiliser l'autre bord pour la deuxième frottis. Laisser les lames sécher à l'air.
  3. Giemsa
    1. Placer les lames dans des supports de lames et de fixer les frottis sanguins par une brève immersion dans du méthanol absolu. REMARQUE: Parce que l'utilisation de la vaisselle en verre doit être maintenue à minimum dans le BSL 3, nous utilisons des cuves en polypropylène pour toutes les solutions.
    2. Plonger les frottis dans Giemsa (1h10 dans l'eau déminéralisée). Après 10 min, plongez les lames dans et hors des cuvettes de coloration remplis avec de l'eau déminéralisée à quelques reprises pour rincer l'excès de tache.
    3. Enfin, de l'air sec dans des glissières en position verticale.
  4. TACHE ALTERNATIVE: Wright & #180; tache s
    1. Dissoudre le colorant de Wright à une concentration de 1 mg / ml dans du methanol.
    2. Filtrer à travers un filtre plié avant l'utilisation.
    3. Immerger les frottis de sang dans une solution de coloration et incuber pendant 4 min (note: methanol fixation des frottis n'est pas nécessaire que la solution de coloration à base de methanol est).
    4. Laver les lames de rinçage à l'eau déminéralisée comme décrit ci-dessus et de laisser les lames sécher à l'air.
    5. Une fois Giemsa / s Wright est terminée, transférer délicatement tous les réactifs utilisés dans une disposition pot contenant de Buraton.
  5. analyse de frottis de sang
    1. Analyser étalement de sang au microscope optique à un grossissement de 100 fois avec immersion dans l'huile.
    2. Comptez érythrocytes infectés ou non dans une zone du frottis de sang où les érythrocytes sont disposés dans une monocouche.
    3. Afin d'atteindre une parasitémie bien définie, compter au moins 10 champs de vue différents présentant une monocouche érythrocytaire.
    4. Calculmangé la parasitémie par rapport (en%) en divisant le nombre d'hématies parasitées par le nombre d'érythrocytes et en multipliant par 100.

Résultats

L'infection des souris avec Vtt et P. berghei par la voie naturelle, à savoir aérosol et piqûre de moustique, respectivement, les résultats de l'infection constante et reproductible de tous les animaux (tableau 1) 1. Nous pouvons surveiller infection réussie et au cours des deux paludisme et la tuberculose en déterminant l'apparition initiale (prépatence) et le nombre de parasites dans le sang (P. berghei parasitémie) et la charge de VTT dans les différents organes, respectivement. Un exemple de transmission réussie du parasite du paludisme par piqûre de moustique infectieux est montré dans le tableau 1 et la figure 3. Alimentation de 10 moustiques infectés de sporozoïtes sur chaque souris a entraîné un taux d'infection de 100% comme l'a confirmé la présence de parasites au stade sanguin 4-5 jours plus tard (tableau 1 et la figure 3A). Surtout, nous trouvons nombre de parasites similaires dans le sang des souris individuelles de la même gr expérimentaloup, indiquant que sporozoïte transmission par les résultats de morsures de moustiques dans une infection constante et reproductible. En comparant la prépatence chez les souris témoins naïfs avec celui des animaux de Vtt co-infectés, nous pouvons voir que prépatence est légèrement retardée chez les souris qui avaient été preinfected avec Vtt (tableau 1, figure 3B) 1. Comme nous l'avons indiqué précédemment 1, nous pouvons déterminer l'impact de la co-infection Vtt sur ​​le cours du paludisme par la parasitémie de suivi quotidien dans les frottis sanguins colorés au Giemsa comme le montre la figure 3B.

L'infection des souris avec Mtb par l'utilisation d'un résultat de système d'exposition par inhalation de dépôt réussie des bactéries dans les poumons est relativement faible variabilité entre les souris individuelles (Figure 4A). Nous pouvons suivre charges de mycobactéries dans les poumons et d'autres organes d'intérêt au fil du temps par la détermination UFC. Un exemple de la charge mycobactérienne dans les poumons d'Vtt infecté souris C57BL / 6 en l'absence ou en présence de P. berghei est représenté sur la figure 4B.

Tableau 1. Prépatence après la transmission de sporozoïte par piqûre de moustique. Toutes les souris ont développé des infections au stade sanguin après la transmission naturelle de P. berghei sporozoïtes par piqûre de moustique. Adapté de 1 PLoS ONE, 7 (10), avec la permission e48110.

Groupe expérimental chez la souris (C57BL / 6) Contester par 10 piqûres infectantes de moustiques Nombre de stade sanguin positif animaux / Nombre d'animaux par groupe Prépatence moyenne [d]
naïf P. berghei 7.7 4,4
Vtt infecté P. berghei 7.7 5,5 d>

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Figure 1. Économie générale de la procédure expérimentale. Souris C57BL / 6 sont exposés à Vtt contenant des gouttelettes d'aérosol dans une chambre d'aérosol Glas-Col. Un jour après l'infection par aérosol, l'absorption de Vtt est vérifiée par analyse CFU du poumon. 40 jours après l'épreuve de VTT (quand la tuberculose est devenue chronique chez des souris infectées), les animaux sont exposés à P. berghei moustiques infectés. Pour confirmer la transmission de sporozoïte succès et de suivre l'évolution de l'infection à Plasmodium, la parasitémie est surveillé quotidiennement dans les frottis sanguins colorés au Giemsa à partir 3 jours après une piqûre de moustique.

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Figure 2. Croquis d'une cage de moustique. Moustiques infectieuses sont contenus dans un carton comme une crème glacée carton demi-pinte. Une petite ouverture est découpée dans le côté de la boîte en carton et recouverte d'une double couche de latex avec une fente découpée dans chaque pièce afin de créer une entrée sécurisée pour les moustiques. Un morceau de papier filtre est collé sur le fond intérieur de la boîte en carton pour absorber les gouttes. tasses de crème glacée sont fermés par des filets (filet de nylon) qui est fixé sur le carton par bande et la bande élastique.

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Figure 3. parasitémie dans le sang. A) Exemple de `s Wright teinté frottis sanguin montre hématies parasitées (de la barre d'échelle, 20 & #181;. M) B) parasitémie dans le sang de la souris a été suivie par l'analyse quotidienne des frottis sanguins colorés au Giemsa. Une co-infection des souris ont une parasitémie réduite par rapport à des souris infectées par Plasmodium individuelles (n = 10); résultats sont présentés en tant que moyenne ± écart-type; *** p <0.001. Reproduit de 1 PLoS ONE, 7 (10), avec la permission e48110.

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Figure 4. Détection de VTT dans le poumon. C57BL / 6 ont été aérosol contesté avec 100 UFC de VTT et 40 jours plus tard, une co-infection avec P. B) Les bactéries berghei par piqûre de moustique. A) Un jour après l'infection par aérosol la captation du nombre souhaité de Mtb a été vérifiée par placage homogénats de poumon entier pour la détermination de CFU.l Les charges au moment de la co-infection ont été déterminées dans des lysats de poumon de 3 souris par analyse de CFU (Mtb de d40/d0). 12 jours après la co-infection, lysats pulmonaires ont été étalées pour l'analyse UFC afin de déterminer l'impact de la co-infection à Plasmodium sur le contrôle Vtt. Notez que le nombre vtt dans les poumons a augmenté pendant la co-infection avec P. berghei NK65. L'étiquetage de l'axe X: temps après Vtt -infection/time après la co-infection. Adapté de 1 PLoS ONE, 7 (10), avec la permission e48110.

Discussion

Nous avons décrit comment les souris peuvent être productive infectées par le Vtt et P. berghei par leurs voies naturelles de l'infection. Nous appliquons des protocoles établis d'infection à étudier la tuberculose ou le paludisme expérimental 13 12 et les a récemment adopté pour étudier la co-infection entre Vtt et Plasmodium dans le modèle de la souris 1.

Les étapes les plus critiques pour les infections de succès sont la transmission de ces deux agents pathogènes dans les chiffres désirés. Les stocks de mycobactéries ne devraient pas être plus de 2 ans, car ils perdront la viabilité dans le temps, et le titre initialement déterminé des stocks seront très probablement ne plus être exactes. En conséquence, des doses d'infection, il est beaucoup plus faible que prévu. Par conséquent, les titres UFC de cultures mères devraient être déterminés tous les quelques mois. Tout aussi important est la culture standardisée et la production des stocks vtt en premier lieu. Les conditions de culture telles quemoyenne, les suppléments, l'heure et le volume doivent être normalisées afin de pouvoir comparer les données des expériences en utilisant différents stocks de Vtt. Les mycobactéries ont tendance à s'agglomérer au cours de la culture, il est donc important de maintenir des conditions de culture standardisées, des bactéries de la récolte à la même phase de croissance et de remettre en suspension au cours de l'aliquotage fréquemment. Sinon, il peut y avoir une grande variation dans les titres UFC et issue de l'infection.

La génération de lots de moustiques infectés de façon homogène est une autre étape critique. Depuis différentes moustiques se nourrissent de chaque souris individuelle, il est important que tous les moustiques utilisés pour une expérience d'infection proviennent du même lot et que seuls les lots où plus de 90% des moustiques sont infectés sont utilisés.

Le modèle actuel peut être utilisé pour disséquer les réponses immunitaires et des modulations immunitaires chez un hôte co-infecté par le comparant à des réponses immunitaires chez des hôtes infectés simples. Nous pouvons appliquer vaRious méthodologies bien établies telles que l'histologie, immunohistochimie, l'analyse par cytométrie de populations de cellules immunitaires, ou PCR et ELISA pour la détection des cytokines et des chimiokines aux fluides corporels ou de tissus d'intérêt. Il est à noter, que de tels modèles de souris ont certaines limites. Alors que la majorité des personnes infectées par Mtb développer une infection latente sans aucun signe de symptômes cliniques, les souris développent une maladie chronique avec une pathologie pulmonaire progressive. Pourtant, C57BL / 6 sont relativement résistantes à l'infection Vtt et ne développent pas de granulomes classiques comme observé chez les patients tuberculeux humains. En conséquence, les réactions immunopathologiques chez la souris ne reflètent pas une maladie latente, ni la tuberculose humaine actif de manière appropriée. Malgré l'écart entre la maladie latente et chronique chez l'homme et la souris, les souris ont été largement utilisés pour identifier et étudier les facteurs de l'hôte qui contrôlent l'infection Vtt et sont des outils précieux et indispensables pour enquêterles réponses immunitaires dans les maladies infectieuses. Surtout, la susceptibilité aux infections Vtt varie considérablement entre les souches de souris consanguines couramment utilisés et les souches les plus sensibles tels que DBA ou C3H peuvent être inclus dans les études co-et mono-infection. Par ailleurs, outre les espèces de pathogènes décrits ici, toutes les autres espèces de Mycobacterium présentant un intérêt (par exemple des isolats cliniques) pourraient être utilisés. De même, si aucun modèle de paludisme simple réplique tous les aspects des modèles différents de souris de la maladie humaine ne ressemblent étroitement les différents aspects de l'infection du paludisme humain naturellement acquise. Par exemple, P. berghei ANKA et P. yoelii YM/17XL sont largement étudié les modèles de l'homme (P. falciparum induit) de paludisme grave, avec P. berghei ANKA étant considéré comme un excellent modèle pour l'homme Malari cérébrale de 14,15. P. berghei NK65 est un excellent modèle pour hyperparasitémie et anémie palustre aiguë, et a récemment étédécrit comme un modèle expérimental du syndrome associé au paludisme aigu de détresse respiratoire (SDRA MA-16). En utilisant le modèle de la co-infection décrite, nous pourrions montrer que récemment concurrente P. infection berghei NK65 aggrave la tuberculose chronique 1.

Outre l'utilisation de différents parasites du paludisme des rongeurs, l'ordre et le calendrier des événements d'infection peuvent être adaptés en fonction de la question de recherche sous-jacente. Sur le terrain, les infections de Plasmodium concomitants peuvent être présents au moment de l'infection Vtt ou acquis par la suite. Dans les deux scénarios, les réponses immunitaires à Vtt et Plasmodium peuvent être affectés différemment. Par conséquent, les souris peuvent être infectées avec des sporozoïtes de Plasmodium soit avant ou après l'infection par Mtb. En outre, les souris peuvent être contestées à différents moments après l'infection Vtt pour évaluer l'impact de la réponse immunitaire induite par Plasmodium-aiguë ou chronique surtuberculose. Il est important, lors du choix d'un parasite du paludisme pour étudier le paludisme-tuberculose co-infection, il faut être conscient que certaines souches de Plasmodium de rongeurs causent la maladie aiguë dans certaines souches de souris et succombent à l'infection au sein de quelques jours ou semaines tout en Vtt provoque les infections chroniques et de longue durée dans immunocompétent les souris. Par conséquent, le calendrier de la co-infection est essentielle pour éviter la mort prématurée d'animaux de laboratoire.

La modulation de l'immunité de l'hôte par une infection simultanée avec des espèces de pathogènes multiples reste mal comprise. Notre modèle de co-infection expérimentale fournit un outil puissant pour étudier Mycobacterium - Plasmodium interaction avec le système immunitaire d'un hôte co-infectés et contribuera à notre compréhension comment les co-infections peuvent affecter la pathogenèse, évolution de la maladie, la vaccination, immunodiagnostics, et la thérapie.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Miriam Ester pour la reproduction des moustiques. Ce travail a été soutenu par un financement interne du Centre de recherche Borstel et rejoint le financement par l'infection Leibniz Center.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BuratonSchü ; lkeIngrédients actifs : Aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde, oxalaldéhyde, éthylhexanal)
Middlebrook 7H9  ;SigmaM0178Pour les cultures de bouillon Mtb
Middlebrook 7H11  ;BD Biosciences283810Milieu gélaire pour la culture de Mtb
Middlebrook Milieu d’enrichissement OADCBD Biosciences212240Ajouter à 7H9 et 7H11 pour la culture de
Mtb Plat de colorationServices scientifiquesE62542-12
Support de 24 lames avec poignéeServices scientifiquesE62543-06
Giemsas Solution de bleu d’azur-éosine-méthylèneMerck Millipore
Wright&aigu ; s stainSigmaW0625
Système d’exposition par inhalationGlas-Col
Nébuliseur-VenturiGlas-Col
Gobelets à glaceHä ; agen-DazsUtilisé comme cages à moustiques
Cages à moustiques à armature métalliqueBioQuip Products1450A
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Références

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Mots-clés

Infection par a rosoltransmission par piq re de moustiqueanalyse des UFC du poumonfrottis sanguins color s au Giemsaanalyse par cytom trie en fluxtechniques PCR et Elisatechniques histologiquesniveau de bios curit 3syst me d exposition par inhalation

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