Article de méthode

Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

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DOI :

10.3791/50833

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3 décembre 2013

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1INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, 2UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

Dans cet article

Résumé

Ces 15 dernières années, les vecteurs dérivés de l’adénovirus canin de type 2 (CAV2) ont prouvé leur efficacité à transduire des cellules in vitro et in vivo et sont largement utilisés pour la vaccination et la thérapie génique. Nous décrivons ici une procédure de construction, de production et de purification des vecteurs CAV2, donnant lieu à des suspensions virales à titre élevé.

Résumé

Les vecteurs dérivés d’adénovirus (Ad) ont été largement utilisés pour le transfert de gènes à court ou à long terme, à la fois pour la thérapie génique et les applications vaccinales. En raison de l’immunité préexistante fréquente contre l’adénovirus humain de type 5 classiquement utilisé, l’adénovirus canin de type 2 (CAV2) a été proposé comme vecteur alternatif pour le transfert de gènes humains. La biologie bien caractérisée du CAV2, ainsi que sa facilité de manipulation génétique, offrent des avantages majeurs, notamment pour le transfert de gènes dans le système nerveux central, ou pour induire un large éventail de réponses immunitaires protectrices, de l’immunité humorale à l’immunité cellulaire. De nos jours, le CAV2 représente l’un des adénovirus non humains les plus attrayants pour une utilisation comme vecteur vaccinal. Ce protocole décrit une méthode simple pour construire, produire et titrer des vecteurs CAV2 recombinants. Après clonage de la cassette d’expression du gène d’intérêt dans un plasmide navette, le plasmide génomique recombinant est obtenu par recombinaison homologue dans la souche bactérienne E. coli BJ5183. Le plasmide génomique résultant est ensuite transfecté dans des cellules rénales canines exprimant les gènes CAV2-E1 complémentaires (DK-E1). Une amplification virale permet la production d’un stock viral important, qui est purifié par ultracentrifugation à travers des gradients de chlorure de césium et dessalé par dialyse. La suspension virale résultante a régulièrement un titre de plus de 10à 10 particules infectieuses par ml et peut être administrée directement in vivo.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les vecteurs dérivés d’adénovirus (Ads) ont prouvé leur efficacité pour la thérapie génique et la vaccination, ainsi que pour la virothérapie oncolytique 1. Les publicités sont des virus icosaédriques non enveloppés de la famille des Adenoviridae, qui ont été isolés chez des mammifères, des oiseaux, des reptiles, des amphibiens et des poissons. Depuis leur découverte en 1953, les AD ont été étudiés intensivement en tant que modèles pour étudier les interactions virus/cellules et, plus récemment, en tant que systèmes de distribution de gènes basés sur des vecteurs 2. En effet, les vecteurs basés sur les publicités offrent de nombreux avantages, tels que leur large gamme d’hôtes et leur biologie bien caractérisée, ainsi que la facilité avec laquelle ils peuvent être manipulés génétiquement et amplifiés pour une production à grande échelle.

Afin de surmonter les difficultés cliniques liées à l’immunité préexistante dans les populations humaines envers les vecteurs dérivés de l’Ads 3 humain, nous et d’autres avons commencé à dériver des vecteurs de l’Ads 4 non humain. De plus, les vecteurs adénoviraux non humains semblent être plus adaptés à la vaccination de masse en médecine vétérinaire que l’adénovirus de type 5 (Ad5) classiquement utilisé, car ils devraient être plus conformes aux exigences de sûreté et de sécurité lors de l’évaluation des risques par les autorités réglementaires nationales. À la fin des années 1990, nous avons décrit le premier CAV2 recombinant comme une alternative non humaine aux vecteurs dérivés de Ad5 5. Depuis lors, de nombreuses études ont confirmé le potentiel des vecteurs CAV2 pour le transfert de gènes thérapeutiques ou antigéniques (pour les revues 6,7). Comme les autres publicités, les vecteurs dérivés du CAV2 sont stables et peuvent être produits à des titres élevés, ce qui facilite leur utilisation in vivo. Ils sont également sûrs, car ils ne sont pas intégratifs, bien qu’ils permettent une expression transgénique in vivo (>1 an) de longue durée8. Remarquablement, et mieux que les sérotypes Ads humains, les vecteurs CAV2 se sont révélés être hautement neurotropes, avec un transport rétrograde très efficace dans les axones 9,10. Cette propriété intrinsèque a donné l’idée d’utiliser des vecteurs CAV2 recombinants pour transduire les neurones de zones cérébrales spécifiques qui sont difficilement accessibles aux vecteurs lentiviraux, jusqu’à présent couramment utilisés pour le transfert de gènes dans le système nerveux central 11.

Ici, nous décrivons un protocole simple et classique pour construire, produire et purifier des vecteurs CAV2 non répliquatifs dérivés de la souche Manhattan. Les génomes recombinants du CAV2 sont construits en clonant le gène d’intérêt (GOI) souhaité dans une cassette en aval du promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV), qui fournit une expression ubiquitaire. Les vecteurs CAV2 ont une capacité de clonage de ~4,2 kbp, ce qui permet d’exprimer de grands ADNc. Dans un second temps, cette cassette d’expression est insérée par recombinaison homologue à la place de la région E1 du génome du CAV2, conduisant à un virus non réplicatif (dlE1), tel que décrit initialement par Chartier et al. 12 Enfin, des particules virales sont produites lors de la transfection du plasmide génomique dans une lignée de cellules rénales canines exprimant CAV2-E1 (DK-E1) et sont amplifiées en série avant la concentration et la purification des stocks viraux. La méthode décrite ici utilise une ultracentrifugation en deux étapes dans des gradients de chlorure de césium (CsCl), qui permet l’enrichissement des particules infectieuses avec un titre final élevé (généralement supérieur à 1010 particules infectieuses par ml). La suspension virale est ensuite dessalée par chromatographie à travers des colonnes jetables Sephadex G-25 afin qu’elle soit finalement suffisamment pure pour être directement utilisée in vivo.

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Protocole

1. Construction d’un plasmide du génome CAV2 non réplicatif

Remarque : tous les plasmides décrits dans ce protocole ont été décrits précédemment7 et sont disponibles sur demande.

  1. Clonez le GOI dans le plasmide pShuttle, à l’aide d’enzymes de restriction appropriées, pour générer le pShuttle-GOI (Figure 1A).
  2. Digestion de 2 μg de pShuttle-GOI par AscI/PacI. La digestion libère le fragment Shuttle-GOI (~2,9 kbp + séquence GOI ORF) du squelette plasmidique (2,8 kbp).
  3. Purifier le fragment Shuttle-GOI après électrophorèse sur gel d’agarose, à l’aide du gel NucleoSpin et du kit de nettoyage PCR.
  4. En parallèle, digérer 1 μg de plasmide génomique pCAV2 par SwaI. Le plasmide pCAV2 contient un site SwaI unique situé dans la région E1 (Figure 1B). Inactiver thermiquement cette enzyme de restriction à 65 °C pendant 20 min.
  5. Transformer des bactéries E. coli BJ5183 compétentes avec 500 ng de fragment Shuttle-GOI purifié et 100 ng de plasmide pCAV2 linéarisé pour une recombinaison homologue (Figure 1B). Étaler sur des plaques LB-Amp. Incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 20 heures.
  6. Effectuer une analyse PCR directement sur des colonies bactériennes à l'aide du mélange maître EmeraldAmp avec des amorces avant (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') et inverses (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), dans les conditions de cycle suivantes : 10 min à 95 °C (pour un cycle), 95 °C pendant 1 min ; 58 °C pendant 1 min ; 72 °C pendant 1 min/kbp (pour 39 cycles), et enfin 5 min à 72 °C. Un produit de 1 kbp + séquence ORF GOI est amplifié à partir de clones positifs pCAV-GOI, alors qu’aucun produit PCR ne peut être détecté avec des clones négatifs.
  7. Inoculer au moins deux colonies positives pendant la nuit, chacune dans un milieu de 5 ml LB-amp à 37 °C dans un agitateur (220 tr/min).
  8. Extrayez les ADN plasmidiques à l’aide du kit plasmidique Nucleospin. Transformez les bactéries E. coli DH5α compétentes avec une aliquote de chaque préparation d’ADN. Étaler la suspension bactérienne sur des plaques LB-Amp et incuber toute la nuit à 37 °C.
  9. Inoculer deux colonies de chaque clone positif pendant la nuit dans un milieu de 3 ml LB-amp à 37 °C dans un agitateur (220 tr/min). Extrayez l’ADN plasmidique à l’aide du kit plasmidique Nucleospin.
  10. Digérer l’ADN résultant et le plasmide parental pCAV2 (en tant que contrôle) avec NdeI. Le modèle de restriction du pCAV2 parental est de 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp et 1,6 kbp. La cassette d’expression du GOI est insérée dans le fragment de 7,9 kbp et contient au moins un site NdeI, c’est-à-dire un dans la cassette et les sites potentiels présents dans le GOI.
  11. Sélectionnez les constructions positives et passez à l’étape 2 avec au moins 2 clones indépendants.

2. Transfection du plasmide du génome recombinant CAV2 en cellules DK-E1

Remarque : Les vecteurs non réplicatifs dérivés de CAV2 sont des organismes génétiquement modifiés classés comme Biosafety Level 2 (BSL-2), tandis que leur utilisation sur des modèles animaux est classée comme BSL-1. Veuillez utiliser des mesures de confinement et de manipulation des déchets appropriées, y compris un équipement de protection individuelle, et travailler sous des hottes à flux laminaire BSL-2.

  1. Un jour avant la transfection, ensemencez les cellules DK-E1 sur une plaque à 6 puits. Cultivez des cellules à 37 °C et à 5 % de CO2, dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose, contenant 7 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 1 mM de pyruvate de sodium et 100 U/ml de pénicilline/100 μg/ml de streptomycine. Les cellules doivent être confluentes à 70-80 % pour la transfection.
  2. Digérer 2 μg de plasmide pCAV-GOI avec AscI, pour libérer la séquence non virale du plasmide. Vérifiez le schéma de restriction résultant par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 %. La digestion doit produire un fragment de ~31 kbp contenant le génome recombinant et un fragment de 2 kbp correspondant au squelette plasmidique.
  3. Mélangez l’ADN digéré avec 200 μl de tampon Jet Prime en faisant un vortex pendant 10 sec. Ajoutez 4 μl de Jet Prime et mélangez en vortex pendant 10 sec. Faites tourner brièvement pour éliminer les gouttelettes et incubez pendant 10 min à température ambiante.
  4. Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules. Secouez doucement les assiettes pour répartir uniformément le mélange et incubez à 37 °C.

3. Propagation du CAV2 recombinant

  1. Une semaine après la transfection, prélever les cellules et le milieu de culture dans un tube en polypropylène de 15 ml. Perturber les cellules par trois cycles de congélation-décongélation (-80 °C/37 °C) et éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 min à 1 800 x g.
  2. Prélever le surnageant et le conserver à -20 °C pour la propagation ultérieure du virus.
  3. Infecter une monocouche confluente de 80 à 90 % de cellules DK-E1 cultivées dans un puits de plaque à 6 puits avec 0,5 ml du surnageant contenant le virus. Incuber à 37 °C pendant 1 h, sous une légère agitation. Retirer l’inoculum et le remplacer par 1,5 ml de DMEM complet contenant 5 % de SCA inactivé par la chaleur.
  4. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3-4 jours. Les cellules doivent être surveillées quotidiennement pour détecter l’apparition d’un effet cytopathique (CPE, figures 2A-B). Si aucune EPC claire n’est visible, prélever les cellules après 4 jours de culture et répéter les étapes 3.1 à 3.4.
  5. Lorsqu’une EPC claire affecte la majorité des cellules, généralement après 2 à 4 cycles d’amplification virale, prélevez les cellules avec un milieu de culture et congelez-décongelez 3 fois comme décrit ci-dessus. Infecter 80 à 90 % de cellules DK-E1 confluentes cultivées dans trois boîtes de culture tissulaire de 10 cm de diamètre, en utilisant à chaque fois 0,5 ml de surnageant contenant le virus.
  6. Après 3 à 4 jours (lorsque l’EPC est terminée), prélever les cellules de ces boîtes de 10 cm, les perturber à nouveau par trois cycles de congélation-décongélation, éliminer le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 1 800 x g, recueillir le surnageant et les stocker à -20 °C pour une amplification CAV2 à grande échelle.

4. Purification CAV2 à grande échelle

  1. Infectez 80 à 90 % de monocouches confluentes de cellules DK-E1 cultivées dans quarante boîtes de culture tissulaire de 10 cm de diamètre. Pour chaque plat, utilisez 0,1 ml de surnageant contenant un virus dilué dans 1 ml de DMEM complet sans SCA. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 à 4 heures sous une légère agitation. Ajouter 5 ml de DMEM complet complété par 5 % de FCS.
  2. Incuber pendant 3 jours. Récoltez les cellules infectées dans les quarante boîtes de 10 cm dans des tubes en polypropylène de 50 ml. Cellules de granulés à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C et remises en suspension dans 15 ml de milieu DMEM.
  3. Perturbez les cellules par trois cycles de congélation-décongélation (-80 °C/37 °C). Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 1 800 x g pendant 10 min et stocker le surnageant à -20 °C avant de purifier les particules virales.
  4. Préparez un gradient discontinu de CsCl dans un tube Ultra-Clear de 14 ml. Versez d’abord 2 ml de solution de CsCl (1,40 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate) au fond du tube. Ensuite, ajoutez lentement 2 ml de solution de CsCl (1,25 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate) sur la première solution.
  5. Chargez soigneusement le surnageant viral au-dessus du gradient CsCl. Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à 2-3 mm du haut. Centrifugeuse pendant 1,5 heure à 130 000 x g et 18 °C dans un rotor SW40 oscillant.
  6. Après centrifugation, deux bandes blanches sont clairement visibles à l’interface entre les couches de solution de 2 CsCl (Figure 2C). À l’aide d’une aiguille de 21 G et d’une seringue, prélever par perforation latérale la bande inférieure contenant les particules matures de CAV2. Essayez autant que possible d’éviter de collecter la bande supérieure, qui correspond à des particules virales vides.
  7. Préparez un gradient continu de CsCl dans un tube transparent de 14 ml en mélangeant les particules virales collectées avec une solution de CsCl (1,34 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate). Remplissez le tube d’huile minérale jusqu’à 2-3 mm du haut. Centrifugeuse pendant 18 heures à 130 000 x g et 18 °C dans un rotor SW40 oscillant.
  8. Après la centrifugation, prélever la bande blanche contenant le CAV2 par ponction latérale avec une seringue comme décrit ci-dessus. Encore une fois, essayez d’éviter de collecter la bande supérieure restante. Cela devrait être plus facile dans cette pente continue, qui sépare mieux les deux bandes. Le volume total de la suspension recueillie ne doit pas dépasser 2 ml.
  9. Équilibrez une colonne Sephadex G-25-10 avec 30 ml de PBS.
  10. Chargez la suspension virale et jetez l’eau courante.
  11. Eluté avec des fractions de 500 μl de PBS. Collectez les fractions 5 à 7, qui contiennent généralement les particules CAV2 dessalées. Les fractions contenant le virus peuvent être facilement identifiées car elles sont opalescentes. Ajouter 150 μl de glycérol dans les 1,5 ml de suspension de CAV2 et stocker dans des aliquotes à -80 °C.

5. Titrage du CAV2 par dilution finale

  1. Décongelez une aliquote de virus purifié sur de la glace et effectuez des dilutions en série de 10 fois (allant de 10-2-10-12) dans du DMEM sans sérum.
  2. Ajouter 50 μl de chaque dilution virale dans 5 puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 1,5 x 104 cellules DK-E1 dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 jours.
  3. Au jour 5 post-infection, surveiller l’apparition des CPE par observation microscopique (figures 2A-B). Les titres infectieux sont déterminés en doses infectieuses médianes de culture tissulaire (DTID50), à l’aide de la méthode statistique de Reed et Muench13.

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Résultats

La production de vecteurs viraux recombinants de CAV2 repose sur des techniques fondamentales mais essentielles de biologie moléculaire. Avant la production des vecteurs viraux, il est en effet nécessaire de construire un génome recombinant de CAV2 portant une cassette d'expression pour le transgène. Cette construction comporte deux étapes : premièrement, le gène d'intérêt (GOI) est cloné dans un plasmide intermédiaire sous forme de cassette d'expression (i.e. avec promoteur et signal de polyadénylation). Cet él...

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Discussion

La méthode simple décrite ici, adaptée de la technologie Ad5 bien documentée, permet la production efficace de vecteurs CAV2 non réplicatifs avec une capacité de clonage typique de ~4,2 kbp. En ce qui concerne les considérations de temps, un génome recombinant du CAV2 est généralement généré en deux semaines, alors qu’il faudra 5 semaines supplémentaires pour amplifier, purifier et titrer les suspensions virales.

Bien que la production du premier lot de vecteurs dérivés du CAV2 puisse sembler ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par des subventions de l’INSERM, du CNRS, de la Fondation pour la Recherche Médicale et de l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR-10-Blanc-1322) à D.G-D ; le septième programme-cadre de la Commission européenne à B.K. ; M.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de la FRM (programme « Equipe FRM 2009 ») ; C.B. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’UE, dans le cadre de la convention de subvention numéro 245266 (Orbivac).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Enzymes de restrictionNew England BiolabsDivers
Jet Prime kit de transfectionPolyplus114-01
DMEMGibco (Life Technologies)10567014
E. coli BJ5183bactéries Agilent200154
-10 colonne de dessalageGE Healthcare17-0851-01
EmeraldAmp polyméraseTakaraRR320A
Kit plasmide NucleospinMacherey-Nagel740558.250
NucleoSpin Gel et PCR NettoyageMacherey-Nagel740609.50
Tubes de 14 ml, Ultra ClearBeckman344060

Références

  1. Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
  2. Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
  3. Zak, D. E., et al. Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).
  4. Paillard, F. Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).
  5. Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector. J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).
  6. Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses. 2, 2134-2153 (2010).
  7. Bouet-Cararo, C., et al. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep. Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).
  8. Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors. FASEB J. 18, 391-393 (2004).
  9. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52, 293-305 (2006).
  10. Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo. FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).
  11. Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).
  12. Chartier, C., et al. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).
  13. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  14. Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. Chromatography purification of canine adenoviral vectors. Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).
  15. Segura, M. M., et al. A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors. Journal of virological. 163, 129-136 (2010).
  16. Fernandes, P., et al. Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors. Gene Ther. , (2012).
  17. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).
  18. Huang, B., Kochanek, S. Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA. Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).
  19. Tordo, N., et al. Canine adenovirus based rabies vaccines. Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).

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Mots-clés

Production de vecteurs virauxPurification au chlorure de c siumDosage du titre viralRecombinaison homologueCycles de cong lation d cong lationMicroscopie confocale immunofluorescenceAmplification viralePr paration de stocks virauxApplications en th rapie g nique

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