Microinjection unique cellule pour l'analyse cellulaire de communication

Summary

Nous décrivons ici comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes, et de fournir quelques conseils utiles. Nous nous attendons à ce que ce document aidera tout le monde à évaluer le degré de couplage cellulaire en raison de jonctions lacunaires fonctionnels. Tout ce qui est décrit ici pourrait être, en principe, adapté à d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à 1000 Daltons.

Abstract

Les jonctions lacunaires sont des canaux intercellulaires qui permettent la communication des cellules voisines. Cette communication dépend de la contribution d’un hémicanal par chaque cellule voisine pour former la jonction lacunaire. Dans les cellules de mammifères, l’hémicanal est formé de six connexines, des monomères avec quatre domaines transmembranaires et une terminaison C et N dans le cytoplasme. Les jonctions lacunaires permettent l’échange d’ions, de seconds messagers et de petits métabolites. De plus, ils jouent un rôle important dans de nombreuses formes de communication cellulaire au sein de processus physiologiques tels que la transmission synaptique, la contraction cardiaque, la croissance cellulaire et la différenciation. Nous détaillons comment réaliser une micro-injection unicellulaire de Lucifer Yellow pour visualiser la communication cellulaire via les jonctions lacunaires dans les cellules vivantes. On s’attend à ce que dans les jonctions à lacune fonctionnelle, le colorant se diffuse de la cellule chargée vers les cellules connectées. C’est une technique très utile pour étudier les jonctions lacunaires car vous pouvez évaluer la diffusion de la fluorescence en temps réel. Nous discutons de la préparation des cellules et de la micropipette, de l’utilisation d’un micromanipulateur et de l’injection d’un colorant fluorescent de faible poids moléculaire dans une lignée cellulaire épithéliale.

Introduction

Les jonctions lacunaires sont des canaux intercellulaires qui permettent l'intercommunication entre les cellules voisines ^1. Cette communication relie deux ou plusieurs cellules voisines, où chacun contribue avec un connexon ou hemichannel pour former le canal intercellulaire. Dans les cellules de mammifères, l'connexon est formé par six connexines, des monomères avec quatre domaines transmembranaires et un C et N terminaux dans le cytoplasme ^2. Les jonctions lacunaires permettent non seulement le flux d'ions, les seconds messagers et de petits metabolites, mais contribuent également à de nombreuses formes de communication cellulaire dans de nombreux processus physiologiques, tels que la transmission synaptique, la contraction du coeur, la croissance et la différenciation cellulaire ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} En outre jonctions lacunaires ont été associées àde nombreuses maladies telles que le cancer ^{9, 10, 11} l' atrophie musculaire, certaines maladies génétiques et des maladies démyélinisantes ^12.

Ce type de diaphonie intercellulaire peut être évaluée par plusieurs méthodes ^{13, 14, 15, 16.} Dans cet article, nous montrons comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes. Nous discutons de la façon de préparer les cellules et la micropipette, l'utilisation du micromanipulateur et l'injection de Lucifer colorant jaune dans une lignée de cellules épithéliales du thymus. En général, cette procédure expérimentale pourrait être analysé par la moyenne des cellules connectées à la cellule chargée avec un colorant. En outre, ce procédé pourrait être utilisé avec d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à l'écartjonctions de coupure qui est d'environ 1000 daltons.

Protocol

1. Préparation des cellules

1. Maintenir une culture d'une lignée de cellules épithéliales du thymus (IT76M1) ou d'une cellule à tester dans un incubateur (37 ° C / 5% de CO _2).
2. Laver les cellules avec du PBS 1x (répéter cet article 3x).
3. Ajouter à la trypsine les cellules pendant 5 min.
4. Ajouter du milieu (deux fois le volume de la trypsine ajoutée à l'article 1.3) avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal) aux cellules avec de la trypsine et de centrifugation (800 g pendant 5 min).
5. Compter les cellules dans un hémocytomètre.
6. Ajuster la densité des cellules en fonction du type de cellule que les cellules doivent être en contact étroit les uns avec les autres pour permettre le couplage. Remarque: Dans notre cas, nous avons utilisé 3 x 10 ⁵ cellules par 35 mm boîte de Pétri.

2. Micropipette Préparation

1. Retirer la micropipette tel que spécifié à partir d'une micropipette capillaire en verre (diamètre 1,5 mm) jusqu'à une valeur finale de 0,2 pm de diamètre de façon à obtenir une résistance finale d'environ 30 MQf "> ^{17, 18.}
   NOTE: Alternativement, pipettes d'injection peuvent être achetés. La résistance dépend de la taille des cellules, par exemple , une micro - électrode de la résistance plus élevée serait nécessaire pour les cellules acineuses pancréatiques, par exemple (100-150 MQ) ^19. Un problème commun qui pourrait se produire est la précipitation de Lucifer solution jaune qui peut alors obstruer la micropipette et peut nécessiter une filtration ou centrifugation avant. Avant l' injection, la micropipette doit être analysée au microscope pour détecter s'il y a une obstruction ou tout autre type de perturbation ^13. La micropipette peut être testé en injectant LY avec la pointe de micropipette dans une solution saline.

3. Test de la Micropipette

1. Préparer la solution jaune Lucifer (5%) dans 150 mmol / l de LiCl et charger le micro-pipette à l'aide d'une seringue ou par remblaiement (mis en elle LY solution).
2. Placer le microtuyauterieTTE sur 35 mm boîte de Pétri avec les cellules IT76M1 sur le poste de travail de microinjection et plonger la pointe de la micropipette de verre dans le milieu cellulaire. Focus sur la micropipette et effectuer un test de teinture circulant en appliquant une impulsion.

4. unicellulaire jaune Lucifer microinjection

1. Concentrez microscope juste au-dessus de la couche de cellules en utilisant un fi cation magni élevée (40X), puis abaissez lentement la pipette pour les cellules en utilisant le micromanipulateur.
2. Piquer la cellule cible lorsque la pointe est assez proche de toucher la membrane cellulaire, et d'appliquer une petite impulsion hyperpolarisant pour introduire le LY dans la cellule. La tension appliquée dépendra de la charge nette de colorant pour être injecté. En variante, d'autres colorants peuvent être utilisés avec cette technique, comme indiqué dans le tableau 1.
   Remarque: En principe, tout colorant hydrophile ayant un PM inférieur à 1KDa pourrait être utilisé. Toutefois, le taux de transfert peut varier en fonction du poids et de l'hydrophilie. En outre, utransfert nspecific du colorant utilisé doit être évaluée.
3. Capture d'images de cellules 3 min après l'injection de colorant ou faire un petit film avec la microscopie de laps de temps (30 fps).
   NOTE: Une approche similaire pourrait être vu dans Hitomi et al (2015) ^20. Afin d' éviter la communication par des ponts intercellulaires (mitose incomplète), un co-injection de rhodamine dextran (de 2 à 10 kDa), qui ne passe pas à travers les jonctions lacunaires , mais passe par des ponts intercellulaires et certains types de nanotubules est recommandé comme représenté sur la figure 2 .

Results

Lignée de cellules épithéliales thymiques IT-76MI ont été utilisés pour évaluer le couplage de colorant par des jonctions lacunaires que ces cellules ont été décrites pour exprimer des jonctions lacunaires fonctionnels formés par les connexines 43 ^21. La figure 1 montre l'injection de jaune Lucifer lorsqu'elle est appliquée dans une cellule au-dessous de la pointe de la pipette. Au bout de quelques minutes, les cellules connectées deviennent fluorescentes (astéris...

Discussion

Afin de vérifier la présence de intercellulaire fonctionnelle jonction lacunaire, l'utilisation de traceurs, qui sont membrane imperméable, bien perméable par des canaux intercellulaires sont nécessaires ^16. Fluorescéine, le premier colorant fluorescent pour l' observation de cellule à cellule de couplage ²² est perméable entre les membranes non jonctionnels ³ et a par conséquent été remplacé par Lucifer Yellow ¹⁵ col...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifer jaune	Sigma	L0259
Chlorure de lithium	Sigma	L4408
PBS comprimés	Sigma  ;	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Sérum fœtal bovin	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
table à isolation vibratoire  ;	Newport	VH3036W-OPT	Une table isolée des vibrations est nécessaire pour protéger les expériences des vibrations et éviter d’endommager les cellules
Micromanipulateur	Narishige	MMO-203	Cet équipement permet des réglages précis de la micropipette, qui est nécessaire pour la micro-injection de cellules.
Générateur de courant  ;	Digitimer	DS2	Pour produire le flux de colorant à travers la micropipette, un courant inférieur à un nanoampère a été donné à l’aide d’un générateur de courant avec une électrode à l’intérieur de la micropipette ou d’un amplificateur doté d’un circuit de compensation de capacité (ancien électromètre) ou de fonctions d’injection de courant des nouveaux amplificateurs patch clamp, et le fil de terre immergé dans la parabole à plaques. Alternativement, le colorant peut être injecté par un micro-injecteur pneumatique, en suivant les recommandations de l’usine.   ;   ;