Article de méthode

Utilisation de Caenorhabditis elegans comme système modèle pour étudier l’homéostasie des protéines dans un organisme multicellulaire

DOI :

10.3791/50840

⸱

18 décembre 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour étudier la relation entre l’homéostasie des protéines, le stress et le vieillissement, nous avons surveillé les changements dans le repliement des protéines en suivant le dysfonctionnement des protéines, la localisation des protéines dans la cellule et la stabilité des protéines aux niveaux de l’organisme, des cellules et des protéines, en utilisant le métazoaire génétiquement traitable Caenorhabditis elegans comme système modèle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le repliement et l’assemblage des protéines sont essentiels à la fonction des protéines, à la santé à long terme de la cellule et à la longévité de l’organisme. Historiquement, la fonction et la régulation du repliement des protéines ont été étudiées in vitro, dans des cellules de culture tissulaire isolées et dans des organismes unicellulaires. Des études récentes ont révélé des liens entre l’homéostasie des protéines (protéostasie), le métabolisme, le développement, le vieillissement et la détection de la température. Ces résultats ont conduit au développement de nouveaux outils pour surveiller le repliement des protéines dans l’organisme métazoaire modèle Caenorhabditis elegans. Dans notre laboratoire, nous combinons des tests comportementaux, l’imagerie et des approches biochimiques en utilisant des protéines métastables sensibles à la température ou naturellement présentes comme capteurs de l’environnement de repliement pour surveiller le mauvais repliement des protéines. Les tests comportementaux associés au mauvais repliement d’une protéine spécifique fournissent une lecture simple et puissante du repliement des protéines, permettant le criblage rapide des gènes et des conditions qui modulent le repliement. De même, un tel mauvais repliement peut être associé à une mauvaise localisation des protéines dans la cellule. Le suivi de la localisation des protéines peut donc mettre en évidence des changements dans la capacité de repliement cellulaire se produisant dans différents tissus, à différents stades de développement et face à des conditions changeantes. Enfin, à l’aide d’outils biochimiques ex vivo, nous pouvons surveiller directement la stabilité et la conformation des protéines. Ainsi, en combinant des tests comportementaux, de l’imagerie et des techniques biochimiques, nous sommes en mesure de surveiller le mauvais repliement des protéines à la résolution de l’organisme, de la cellule et de la protéine, respectivement.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’interaction des différentes étapes de la biosynthèse des protéines, telles que la transcription, le traitement et la traduction de l’ARNm, ainsi que le repliement, la translocation et l’assemblage/désassemblage des protéines, détermine la charge de protéines métastables qui dépendent des machines de contrôle de la qualité des protéines cellulaires pour leur fonction1. L’absence ou le dysfonctionnement des machines de contrôle de la qualité des protéines peut donc entraîner le déclin fonctionnel de divers types de machineries cellulaires et l’apparition de maladies de mauvais repliement des protéines2-7. Lorsque la capacité des machines de repliement et d’élimination des protéines est équilibrée avec la charge de protéines métastables, l’homéostasie des protéines (protéostasie) est atteinte, un état qui empêche finalement l’accumulation de protéines mal repliées et l’agrégation au sein des cellules6. On pense que l’accumulation de protéines mal repliées est le signal qui active les facteurs de transcription induits par le stress, tels que le facteur de choc thermique (HSF-1), et entraîne l’activation des réponses de stress cytoprotectrices6,8.

Notre compréhension des fonctions des réseaux de protéostasie chez les métazoaires provient principalement d’études de reconstitution in vitro et d’observations faites avec des cellules de culture tissulaire et des organismes unicellulaires9. Par exemple, la recherche sur les chaperons moléculaires qui préviennent et résolvent les dommages aux protéines s’est concentrée sur les études biochimiques et biologiques cellulaires des mécanismes de repliement, de désagrégation et de translocation des protéines médiés par les chaperons10-13. En comparaison, on ne dispose que d’informations limitées sur la fonction intégrée des différents composants de la protéostasie dans les différentes cellules et tissus des métazoaires dans des conditions de croissance « normales » et en réponse au stress11. La découverte que chez C. elegans, le contrôle de la qualité des protéines cellulaires peut également être régulé de manière non autonome, comme en témoignent les expériences montrant que les mutations dans les deux neurones qui perçoivent la température peuvent bloquer l’activation de la réponse au choc thermique et réduire la thermotolérance, a démontré la nécessité d’étudier la régulation de la protéostasie dans les organismes multicellulaires14-17. Ce qui manque, cependant, c’est une image cohérente de la façon dont les réseaux de protéostasie, tels que les différentes familles de chaperons moléculaires, fonctionnent dans les tissus d’un métazoaire intact et de la dynamique de ces réseaux au cours du développement et du vieillissement. Pour atteindre cet objectif, des capteurs fiables pour surveiller le maintien du protéome chez les animaux vivants sont nécessaires pour déterminer la capacité protéostatique des différentes cellules d’un organisme multicellulaire au cours du développement et du vieillissement.

Pour qu’une protéine donnée fonctionne comme un capteur de protéostasie cellulaire, elle doit répondre aux changements de l’environnement de repliement cellulaire tout en interférant de manière minimale avec le repliement de protéines non apparentées dans la cellule. Pour explorer le maintien et la récupération de la protéostasie cellulaire dans un organisme vivant, deux approches complémentaires qui dépendent de capteurs repliables peuvent être adoptées. La première repose sur des capteurs de repliement conçus, basés sur des protéines métastables identifiées expérimentalement qui sont connues pour dépendre de la machinerie de la protéostasie, telles que la luciféraseluciférase 18-20 ou la GFP marquée d’un degron21-24. Dans la deuxième approche, les protéines métastables endogènes, telles que les protéines sensibles à la température ou les protéines d’agrégation dépendantes de l’âge qui répondent aux changements incrémentiels de l’environnement cellulaire, sont tracées25-27. Les capteurs à repliement conçus n’ont aucune fonction biologique essentielle, mais offrent l’avantage d’être détectables par des tests de rapport puissants, tels que les protéines marquées à la GFP, et peuvent être utilisés avec de nombreux modèles cellulaires et animauxdifférents18. Cependant, comme l’introduction d’une seule protéine étrangère peut affecter l’environnement de repliement27, ces polypeptides peuvent surcharger la machinerie de la protéostasie cellulaire. Alternativement, les capteurs de pliage conçus qui ne sont pas natifs de la cellule sur laquelle ils rapportent peuvent ne pas être affectés par les changements dans la capacité de protéostasie de la cellule. Par exemple, un substrat rapporteur de protéasome marqué à la GFP nécessitait que ~90 % du protéasome soit inhibé avant qu’un phénotype puisse être détecté23. En revanche, les protéines métastables endogènes qui s’appuient sur les machineries de protéostasie de la cellule offrent l’avantage d’être dans la plage de sensibilité cellulaire. Cependant, la perte de fonction associée au mauvais repliement de ces protéines peut également avoir un impact sur la fonction cellulaire et la viabilité de l’organisme. Ici, nous nous concentrerons sur l’utilisation de capteurs de repliement endogènes de C. elegans.

C. elegans est un modèle de métazoaires bien établi pour l’étude du développement et du vieillissement qui utilise de nombreuses voies biologiques conservées et peut être utilisé pour suivre le repliement des protéines dans la cellule, en utilisant une combinaison d’approches de biologie cellulaire, biochimiques et génétiques. Nous avons utilisé des protéines métastables comme sondes de la capacité protéostatique en surveillant les changements de phénotype, de localisation et de stabilité. De plus, une variété de fonctions protéiques peut être étudiée par une simple analyse comportementale. De même, une mauvaise localisation substantielle des protéines se produit lorsque les réseaux de contrôle de la qualité des protéines cellulaires ne parviennent pas à s’adapter aux demandes cellulaires. Les protéines peuvent être facilement visualisées dans les cellules d’animaux vivants à l’aide de protéines marquées par fluorescence ou via l’immunomarquage. Enfin, en utilisant des méthodes ex vivo, il est possible de suivre l’expression et la stabilité des protéines. Cela permet un dépistage rapide et simple des changements comportementaux et physiologiques, associé à une analyse approfondie de la localisation et de la stabilité des protéines, permettant le suivi des modificateurs de la protéostasie. En combinant ces différentes méthodes, il est possible d’obtenir une vue d’ensemble de l’environnement de repliement des protéines d’une cellule. En effet, cette stratégie a été utilisée avec succès pour surveiller la perturbation de la protéostasie chez C. elegans, la levure, la culture tissulaire et les bactéries15,25-35.

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Protocole

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Utilisation de tests comportementaux pour surveiller le repliement des protéines dans un organisme vivant

1. Synchronisation des animaux pour les tests comportementaux

  1. Suivre les méthodes standard d’entretien de C. elegans36, y compris la préparation des milieux et des plaques, la préparation des aliments et les conditions de croissance des animaux. Contrôlez soigneusement les conditions de culture, y compris la température (15-25 °C), la taille de la population et la disponibilité de la nourriture. Jetez toute assiette présentant une contamination bactérienne ou fongique.
  2. Choisissez 15 à 30 embryons, transférez-les dans de nouvelles plaques et cultivez-les à la température souhaitée (15-25 °C) pendant toute la durée de l’expérience. Vous pouvez également placer 10 à 20 adultes gravides sur une assiette, les laisser pondre des œufs pendant 30 à 60 minutes, puis les retirer de l’assiette. Le prélèvement direct des embryons et la mise en place d’adultes gravides donneront une certaine variabilité d’âge (±6 heures). Pour réduire cette variabilité, il faut soit choisir les embryons à un stade spécifique, par exemple au stade de la virgule, soit placer 10 à 20 adultes qui commencent tout juste à pondre des œufs (jour 2 de l’âge adulte). Évitez autant que possible la synchronisation par blanchiment, étant donné que ce traitement est stressant et peut affecter la protéostasie.
  3. Choisissez les animaux synchronisés, transférez-les sur une plaque d’essai pour les marquer, puis jetez-les.

2. Dosage du mouvement

Choisissez les animaux synchronisés et transférez-les dans une assiette propre à la température souhaitée pour l’évaluation des mouvements (15-25 °C). Pour chaque répétition biologique, notez > 20 animaux et répétez l’essai au moins 3 fois par condition expérimentale. Utilisez le test de somme des rangs de Wilcoxon Mann-Whitney pour comparer deux conditions expérimentales indépendantes.

  1. Pour détecter une légère altération des mouvements, placez 5 à 7 animaux ensemble au centre d’une pelouse bactérienne propre et laissez les animaux se déplacer sur la plaque pendant 2 min. Cet intervalle de temps a été déterminé en fonction du temps qu’il a fallu à 90 % des animaux de type sauvage pour dégager un cercle de 1 cm.
  2. Compter le nombre d’animaux qui n’ont pas franchi un cercle de 1 cm (p. ex. qui sont restés dans un rayon de 1 cm du point où ils ont été placés) dans un délai de 2 minutes comme non coordonné.
  3. Pour détecter de graves troubles du mouvement, placez les animaux sur une pelouse bactérienne propre.
  4. Photographiez plusieurs animaux au temps zéro (t=0) et à nouveau 5 min plus tard (t=5). Évaluez les animaux qui n’ont pas bougé d’une longueur de corps après 5 minutes comme étant paralysés.

3. Thermo-résistance

  1. Prélever > 20 animaux synchronisés et les transférer dans une plaque à 24 puits contenant 450 μl de tampon de choc thermique (HS) (tableau 1). Pour chaque répétition biologique, notez > 20 animaux et répétez l’essai au moins 4 fois par condition expérimentale.
  2. Transférez la plaque à 24 puits dans un bain chauffé. La température et la durée HS dépendent fortement des conditions de croissance, en particulier de la température de culture.
  3. Complétez le tampon HS avec 9 μl de SYTOX orange.
  4. Évaluez la survie des animaux en surveillant l’absorption de colorant à l’aide d’un stéréoscope fluorescent doté d’un filtre TXR. Les animaux qui ont pris la teinture sont morts. Utilisez le test de somme des rangs de Wilcoxon Mann-Whitney pour comparer deux conditions expérimentales indépendantes.

Utilisation de l’immunomarquage et des protéines marquées pour surveiller le repliement des protéines dans des cellules spécifiques

4. Surveiller la localisation des protéines par immunomarquage

  1. Au stade requis, transférez au moins 30 animaux dans un tube Eppendorf contenant le tampon M936.
  2. Lavez les animaux plusieurs fois avec un tampon M9 en effectuant une étape de centrifugation courte et à basse vitesse (3 000 tr/min/900 x g, 2 min) et en remettant en suspension.
  3. Placez les tubes sur de la glace pendant quelques minutes pour qu’ils refroidissent.
  4. Éliminer l’excès de liquide et incuber avec une solution de paraformaldéhyde glacée à 4 % de 500 μl (tableau 2). Le temps d’incubation doit être calibré pour chaque protéine examinée et doit être d’environ 5 à 30 minutes à température ambiante. Une incubation prolongée à 4 °C peut également être effectuée, mais cela peut nuire à la perméabilisation de l’échantillon.
  5. Laver les animaux fixés 3 fois avec le tampon PBS-Tween (pH 7,2) par centrifugation (3 000 tr/min, 1-2 min). Les animaux peuvent être stockés à ce stade à 4 °C pendant quelques semaines.
  6. Recueillir les animaux par centrifugation (3 000 tr/min, 1-2 min).
  7. Dans la hotte, retirer la majeure partie du surnageant et remettre la pastille en suspension dans une solution de β-mercaptoéthanol (β-ME) de 1 ml (tableau 2).
  8. Incuber à 37 °C pendant la nuit en le balançant doucement sur un nutator.
  9. Dans la capuche, lavez les animaux 3 fois avec le tampon PBS-Tween (pH 7,2).
  10. Remettre les animaux en suspension dans 50 à 100 μl de PBS-Tween (pH 7,2). Les animaux peuvent être stockés à ce stade à 4 °C pendant quelques semaines.
  11. Récupérez les animaux par centrifugation (3 000 tr/min, 1-2 min) et retirez la majeure partie du tampon PBS-Tween.
  12. Ajouter 100 à 150 μl de solution de collagénase dans chaque tube et incuber à 37 °C avec une forte agitation (à l’aide d’un thermomélangeur ou d’un incubateur à agitation).
  13. Examinez fréquemment les animaux au stéréomicroscope, à partir de 5 min d’incubation. Lorsque 20 % des animaux sont brisés, arrêtez la réaction en plaçant le tube sur de la glace. Cette étape est très délicate ! La durée du traitement dépend des conditions de fixation et peut varier considérablement d’une souche à l’autre. Une incubation prolongée pourrait entraîner une dégradation complète des animaux. Les conditions doivent être calibrées pour chaque lot d’enzymes utilisé et la dégradation doit être surveillée attentivement.
  14. Lavez les animaux deux fois dans du PBS-Tween (pH 7,2), puis récupérez les animaux par centrifugation (3 000 tr/min, 1-2 min) et retirez la majeure partie du tampon PBS-Tween.
  15. Ajouter 1 ml de solution AbA (tableau 2) et incuber à bascule doux pendant 1 heure à température ambiante. Les animaux peuvent être stockés à ce stade à 4 °C pendant quelques semaines.
  16. Recueillir les animaux par centrifugation (3 000 tr/min, 1-2 min) et les remettre en suspension dans 200 μl d’AbA.
  17. Ajouter l’anticorps primaire dilué à 1:100-1:1 000 dans une solution d’AbA et incuber avec un léger balancement. La température et la durée d’incubation peuvent varier d’un anticorps à l’autre et doivent être calibrées pour chaque protéine examinée. Nous commençons par une incubation d’une nuit à température ambiante.
  18. Laver les animaux par centrifugation (3 000 tr/min, 1-2 min).
  19. Ajouter le tampon AbA (1 ml) et incuber en mélangeant doucement pendant 15 à 60 minutes à température ambiante. Les animaux peuvent être stockés à ce stade à 4 °C pendant quelques semaines.
  20. Facultatif : L’échantillon peut également être coloré avec des colorants fluorescents. Pour ce faire, ajoutez le colorant (par exemple DAPI (2 mg/ml) ou Phalloïdine (1:100)) à 200 μl d’AbA et incubez à l’aide d’un balancement doux jusqu’à 1 heure. Cette étape peut être effectuée lors de l’une des étapes de lavage de l’anticorps secondaire.
  21. Lavez les animaux 3 fois en répétant les étapes 4.18-4.19.
  22. Ajouter 100 μl d’AbA avec l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence, dilué à 1:100.
  23. Maintenez les échantillons couverts (ou dans un tube sombre) et incubez à bascule pendant plusieurs heures à température ambiante.
  24. Lavez les animaux 3 fois en les incubant dans un tampon AbA (1 ml) en mélangeant doucement pendant 15 à 60 minutes à température ambiante, puis par centrifugation (3 000 tr/min, 1 à 2 min). Les animaux peuvent être stockés à ce stade à 4 °C pendant quelques semaines.
  25. Pour monter des animaux sur des lames, retirez tout le liquide et mettez-le en suspension dans 10 μl du même tampon.
  26. Coupez l’extrémité de la pointe de la pipette pour éviter que les animaux ne fassent du détournement et transférez 1 à 2 μl de l’échantillon sur une lame.
  27. Ajoutez le support de montage dans un rapport de 1:1.
  28. Couvrez doucement la diapositive avec une lamelle et scellez-la avec du vernis à ongles. Si la diapositive n’est pas surveillée immédiatement, elle peut être stockée à -20 °C pendant une période prolongée.

5. Surveiller la localisation des protéines marquées

  1. Au stade requis, recueillir au moins 15 animaux dans une goutte de 10 ml de tampon M9 sur une lame.
  2. À l’aide d’un « pic à vers », placez les animaux dans une goutte de 10 ml de solution de paraformaldéhyde (4 %) (tableau 2) et attendez que tous les animaux cessent de bouger (environ 5 min).
  3. À l’aide d’un « pic à ver », placez les animaux dans une goutte de 2 ml de tampon M9 et de milieu de montage (1:1) (tableau 2).
  4. Couvrez délicatement les animaux avec une lamelle et scellez-les avec du vernis à ongles.

Utilisation d’essais ex vivo pour surveiller le repliement et la stabilité des protéines

6. Digestion partielle

  1. Laver les animaux à partir de 15 plaques (60 mm) à l’aide d’un tampon M9 de 1 à 2 ml dans un tube à microfuge. Veuillez noter que les animaux ne doivent pas être surpeuplés et qu’il doit y avoir suffisamment de nourriture pendant toute la durée de l’expérience.
  2. Lavez les animaux plusieurs fois avec le tampon M9 par centrifugation (3 000 tr/min, 2 min) et remise en suspension des animaux.
  3. Après l’essorage final, remettre les animaux en suspension dans un tampon M9 de 100 μl.
  4. Congélation instantanée dans le liquide N2. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C.
  5. À l’aide d’un pilon réfrigéré et d’une perceuse motorisée (une perceuse de culture tissulaire manuelle peut également être utilisée), broyez l’échantillon. Conservez l’échantillon sur de la glace et évitez de surchauffer.
  6. Examinez fréquemment les animaux au microscope stéréoscopique pour déterminer si le broyage est terminé. S’il reste des animaux intacts, répétez la procédure.
  7. Estimez le volume en pipetant l’extrait de ver.
  8. Ajouter un rapport de 1:1 de solution de lyse parasigère (2x) (tableau 3). N’utilisez pas d’inhibiteurs de protéase de quelque nature que ce soit.
  9. Incuber sur glace pendant 15 min.
  10. Éliminer les débris par centrifugation (1 000 x g pendant 2 min) dans une centrifugeuse prérefroidie (4 °C).
  11. Transférez le surnageant dans un tube de microfuge propre. Les échantillons peuvent être utilisés directement ou stockés à -80 °C.
  12. Préparez la solution de chymotrypsine (tableau 3) et maintenez-la sur de la glace jusqu’à utilisation.
  13. Déterminer la concentration totale en protéines à l’aide du test Bradford.
  14. Diluer l’échantillon si nécessaire de manière à ce que la concentration totale en protéines soit de 3 à 3,5 mg/ml.
  15. Ajouter la solution de chymotrypsine au lysat de protéines totales (1:1,200).
  16. Pour déterminer le temps d’incubation, incubez l’échantillon avec de la chymotrypsine pendant 60 min. Prélevez 20 μl d’aliquotes de l’échantillon à différents moments (par exemple 0, 5, 20, 40 et 60 min), mélangez immédiatement avec le tampon d’échantillon SDS et faites bouillir pendant 5 min à 96 °C. *Vous pouvez également incuber l’échantillon avec différentes concentrations de chymotrypsine et arrêter la réaction après un temps spécifique en ajoutant du tampon d’échantillon SDS et en le faisant bouillir pendant 5 min à 96 °C.
  17. Analysez des échantillons sur un gel SDS-PAGE.
  18. Effectuer une analyse par transfert Western à l’aide d’anticorps appropriés pour déterminer la stabilité relative de la protéine.
  19. Déterminer les conditions optimales (concentration de chymotrypsine et temps de digestion) qui montrent des changements significatifs entre les échantillons et utiliser ces conditions pour de futures expériences.
  20. Déterminez l’intensité de différents produits de digestion (fragments de poids moléculaire inférieur) à l’aide d’un logiciel de densitométrie, tel que le module de gel d’image du NIH.

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Résultats

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Un environnement de repliement compromis peut entraîner un mauvais repliement et une agrégation des protéines. Le mauvais repliement des protéines est associé à une conformation altérée et entraîne une perte de la fonction protéique. Nous utilisons des approches complémentaires pour surveiller le repliement et la fonction des protéines chez des animaux intacts, des cellules spécifiques et des extraits de protéines. Un choix intelligent de capteur de repliement, basé sur de forts phénotypes comportementaux et cellulaires ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les sondes de la capacité de protéostasie cellulaire doivent être très sensibles aux changements de l’environnement de repliement et être facilement surveillées afin de fournir une évaluation en temps réel des capacités de contrôle de la qualité du repliement des protéines. En utilisant des protéines métastables comme sondes de la capacité de protéostasie, nous avons surveillé les changements dans le phénotype, la localisation des protéines subcellulaires et la conformation des protéines. Les protocoles présentés ici se ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les souches de nématodes utilisées dans ce travail ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center, qui est financé par le NIH National Center for Research Resources (NCRR). Les anticorps monoclonaux mis au point par H.F. Epstein ont été obtenus à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par le Département de biologie de l’Université de l’Iowa. N. Shemesh a reçu le prix Fay et Bert Harbour. A.B.-Z. a été soutenu par une bourse Alon du Conseil israélien pour l’enseignement supérieur, par une bourse Marie Curie pour la réintégration internationale et par des subventions de la Fondation binationale des sciences et de la Fondation israélienne des sciences (subvention n° 91/11).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Résistance des anticorps et fiaxtionparaformaldéhydeMerc8187151000
Tween-20  ;Bio-Rad1706531
CollagenaseSigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa AesarA16046
&beta ; -MESigma8057400250
BSADi Cam000-40-100
  ; Digestion partielle  ;ChymotrypsineSigmaC4129-250MG
Thermo-résistanceSYTOX OrangeInvitrogenS11368
CholestérolAmaresco0433-250G
ÉQUIPEMENT
M165 FC stéréoscope fluorescentLeicaTXR filtre
EXi Blue Fluorescence Microscopie CaméraQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META microscope confocalZeiss
Pilon à granulésSigmaZ359947-100EA
Pilon à granulés Moteur sans filKontesK749540-0000
MicroCL 17 Microcentrifugeuse SeriesThermo75002455Réfrigéré, , 230 V 50/60 Hz, comprend 24 rotors de 1,5/2,0 ml avec couvercle de bioconfinement ClickSeal

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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