Article de méthode

Tests de polymérisation FtsZ : protocoles et considérations simples

15.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/50844

⸱

16 novembre 2013

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

Dans cet article

Résumé

La polymérisation de FtsZ est essentielle pour la division cellulaire bactérienne. Dans ce rapport, nous détaillons des protocoles simples pour surveiller l’activité de polymérisation de FtsZ et discutons de l’influence de la composition du tampon. Les protocoles peuvent être utilisés pour étudier l’interaction de FtsZ avec des protéines régulatrices ou des médicaments antibactériens qui affectent la polymérisation de FtsZ.

Résumé

Lors de la division cellulaire bactérienne, la protéine essentielle FtsZ s’assemble au milieu de la cellule pour former ce que l’on appelle l’anneau Z. FtsZ polymérise en longs filaments en présence de GTP in vitro, et la polymérisation est régulée par plusieurs protéines accessoires. La polymérisation FtsZ a été étudiée de manière approfondie in vitro à l’aide de méthodes de base, notamment la diffusion de la lumière, la sédimentation, les tests d’hydrolyse GTP et la microscopie électronique. Les conditions tampons influencent à la fois les propriétés de polymérisation de FtsZ et la capacité de FtsZ à interagir avec les protéines régulatrices. Ici, nous décrivons des protocoles pour les études de polymérisation FtsZ et validons les conditions et les contrôles en utilisant Escherichia coli et Bacillus subtilis FtsZ comme protéines modèles. Un test de sédimentation à basse vitesse est introduit qui permet d’étudier l’interaction de FtsZ avec des protéines qui regroupent ou tubulent les polymères FtsZ. Un protocole amélioré de dosage de la GTPase est décrit qui permet de tester l’hydrolyse de la GTP au fil du temps en utilisant diverses conditions dans une configuration de plaque à 96 puits, avec des temps d’incubation standardisés qui abolissent la variation du développement de la couleur dans la réaction de détection du phosphate. La préparation d’échantillons pour les études de diffusion de la lumière et la microscopie électronique est décrite. Plusieurs tampons sont utilisés pour établir le pH du tampon et la concentration en sel appropriés pour les études de polymérisation FtsZ. Une forte concentration de KCl est la meilleure pour la plupart des expériences. Nos méthodes fournissent un point de départ pour la caractérisation in vitro de FtsZ, non seulement à partir d’E. coli et de B. subtilis, mais à partir de toute autre bactérie. En tant que telles, les méthodes peuvent être utilisées pour des études de l’interaction de FtsZ avec des protéines régulatrices ou pour tester des médicaments antibactériens susceptibles d’affecter la polymérisation de FtsZ.

Introduction

La protéine bactérienne essentielle FtsZ est la protéine la mieux caractérisée de la machinerie de division cellulaire bactérienne. FtsZ est l’homologue procaryote de la tubuline et polymérise in vitro de manière dépendante du GTP. FtsZ est une cible très attrayante pour les nouveaux antibiotiques en raison de sa nature préservée et de son caractère unique par rapport aux bactéries1,2. Au début de la division cellulaire, FtsZ forme un anneau cytocinétique au milieu de la cellule, qui sert d’échafaudage pour l’assemblage d’autres protéines de division cellulaire. La formation de l’anneau Z est cruciale pour la localisation correcte du plan de division. La dynamique d’assemblage de FtsZ est régulée par plusieurs protéines accessoires, telles que (selon l’espèce bactérienne) MinC, SepF, ZapA, UgtP et EzrA2. La polymérisation FtsZ a été étudiée de manière intensive in vitro et de nombreuses structures différentes, y compris des protofilaments droits, des protofilaments courbes, des feuilles de filaments, des faisceaux de filaments et des tubes de filaments, ont été décrites en fonction du tampon d’assemblage, du nucléotide et des protéines supplémentaires incluses dans le test3. L’architecture des protofilaments FtsZ in vivo n’est pas encore entièrement comprise, bien que des expériences de cryotomographie électronique chez Caulobacter crescentus suggèrent que l’anneau Z est assemblé à partir de protofilaments uniques relativement courts et non continus, sans regroupement étendu4.

In vitro, les propriétés de polymérisation de FtsZ et l’interaction de FtsZ avec les protéines régulatrices sont sensibles à la composition du tampon réactionnel. Par exemple, nous avons récemment décrit le site d’interaction de SepF sur le C-terminal FtsZ et montré qu’une troncade C-terminale FtsZBs∆16 ne se lie plus à SepF5. Dans une étude précédente sur l’interaction SepF-FtsZBs, un tronc similaire de FtsZBs∆16 cosédimentait toujours avec SepF, ce qui suggérait que SepF se lie à un site secondaire sur FtsZ6. La différence entre ces études était la composition des tampons réactionnels - à pH 7,5, il n’y avait pas de cosédimentation de SepF avec le tronc FtsZ, tandis qu’à pH 6,5, il y avait cosédimentation. Gündoğdu et al. a noté que SepF n’est pas fonctionnel et précipite à pH 6,57, montrant que la cosédimentation observée à pH 6,5 est probablement causée par la précipitation de SepF plutôt que par l’interaction avec le tronc C-terminal FtsZBs∆16. L’influence du pH et de la concentration en KCl sur la polymérisation de FtsZ a déjà été examinée. Les polymères d’E. coli FtsZ (FtsZEc) à pH 6,5 sont plus longs et plus abondants que ceux formés à pH neutre8,9. Tadros et al. ont étudié la polymérisation de FtsZEc en présence de cations monovalents, notant que la liaison K+ est liée à la polymérisation de FtsZEc et est cruciale pour l’activitéFtsZ 10. Le pH est plus critique lorsque l’on étudie l’interaction de FtsZ avec d’autres protéines, comme le montre l’exemple précédent de SepF, et la dépendance du pH de l’effet inhibiteur de MinC sur FtsZ11. Étant donné que le pH et la concentration en sel peuvent influencer l’interaction de FtsZ avec d’autres protéines, il est important de choisir les bonnes conditions et les bons contrôles pour les études de polymérisation FtsZ.

Nous décrivons ici des protocoles pour étudier la polymérisation FtsZ et l’activité de la GTPase par diffusion de la lumière, microscopie électronique, sédimentation et tests de GTPase. La diffusion de la lumière à angle droit est une méthode standard pour étudier la polymérisation FtsZ en temps réel12. Nous avons apporté quelques améliorations à la sédimentation et à l’analyse de la GTPase. Nous présentons en détail comment préparer des échantillons pour la diffusion de la lumière et la microscopie électronique. Plusieurs tampons utilisés dans la littérature pour étudier la polymérisation FtsZ ont été testés et nous décrivons les meilleures conditions pour chaque expérience. Nous montrons également quels contrôles doivent être mis en place pour obtenir les meilleures données.

Ces méthodes permettent une étude rapide de la polymérisation, de l’activité et de l’interaction de FtsZ avec d’autres protéines à l’aide de méthodes et d’équipements simples disponibles dans la plupart des laboratoires. Des méthodes plus sophistiquées pour étudier la polymérisation du FtsZ existent, mais nécessitent souvent l’accès à un équipement plus spécialisé et/ou la modification du FtsZ avec des marqueurs fluorescents8,13,14. Les méthodes simples décrites dans cet article sont illustrées à l’aide de FtsZ de B. subtilis et E. coli, les organismes modèles Gram+ et Gram- les plus courants. Les protocoles peuvent être adaptés à n’importe quelle autre protéine FtsZ. D’après les essais préliminaires effectués avec ces nouveaux FtsZ, de légers changements concernant le temps, la zone tampon ou la température d’incubation peuvent être nécessaires pour obtenir un résultat optimal. Les expériences décrites ici devraient aider à trouver ces conditions optimales.

Protocole

Les protéines FtsZ non marquées ont été purifiées comme décrit précédemment11,15, dialysées contre 20 mM de Tris/HCl (pH 7,9), 50 mM de KCl, 1 mM d’EGTA, 2,5 mM de MgAc et 10 % de glycérol et stockées à -80 °C. Dans ces conditions, la protéine peut être stockée pendant plus de 2 ans sans perte d’activité significative. La protéine doit être stockée dans des aliquotes de 100 μl pour éviter la décongélation et la congélation de l’échantillon. Après décongélation, l’échantillon peut être conservé à 4 °C pendant une semaine maximum. Le FtsZ est soluble à des concentrations élevées et peut être stocké à une concentration de 7 à 10 mg/ml. Il est important de maintenir la concentration en protéines élevée pour éviter les effets indésirables des composants du tampon de stockage lors d’expériences ultérieures. Ainsi, la concentration de stockage doit permettre une dilution de FtsZ d’au moins 10x pour ramener la concentration de glycérol en dessous de 1 % et pour minimiser la concentration des autres composants du tampon de dialyse dans le mélange réactionnel. La polymérisation FtsZ peut également être affectée par la présence de concentrations élevées de sodium9 ou d’imidazole, de sorte que ces composants doivent être retirés du tampon de polymérisation. SepF a été purifié comme décrit7 et stocké dans un tampon d’élution à -80 °C. D’autres méthodes publiées pour la purification de FtsZ à partir d’E. coli et de B. subtilis ainsi que des références aux procédures de purification de FtsZ à partir de différentes sources sont résumées dans le tableau 1 (voir la section des résultats représentatifs).

1. Préparation des échantillons

  1. Préparez les tampons de polymérisation :
    150 mM Hepes/ NaOH, pH 7,5
    deux25 mM de TUYAUX / NaOH, pH 6,8
    350 mM MES/ NaOH, pH 6,5
    450 mM Hepes/NaOH, pH 7,5 ; 50 mM KCl
    525 mM de TUYAUX/NaOH, pH 6,8 ; 50 mM KCl
    650 mM MES/NaOH, pH 6,5 ; 50 mM KCl
    750 mM Hepes/NaOH, pH 7,5 ; 300 mM KCl
    825 mM de TUYAUX/NaOH, pH 6,8 ; 300 mM KCl
    950 mM MES/NaOH, pH 6,5 ; 300 mM KCl
  2. Filtre : stérilisez tous les tampons à l’aide d’un filtre à membrane de 22 μm.
  3. Préparer 100 mM de solutions mères de GTP, de GDP, de Gdp et de MgCl2 dans chaque tampon de polymérisation à partir de (1).
  4. Préclairez les protéines en les faisant tourner à 100 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour toutes les expériences.

2. Dosage de sédimentation FtsZ

  1. Préparer le mélange réactionnel par addition de MgCl2 et de FtsZ dans l’un des tampons de polymérisation (voir point de préparation de l’échantillon 1) dans des tubes compatibles avec la centrifugation à grande vitesse. Le volume total doit être de 49 μl, avec MgCl2 à 10 mM et FtsZ à 12 μM à 50 μl de volume final.
  2. Placez le tube dans un incubateur avec fonction d’agitation, incubez pendant 2 min à 30 °C à 300 tr/min (l’échantillon peut également être doucement effleuré et brièvement microfugué, suivi d’un préchauffage à 30 °C).
  3. Commencer la polymérisation en ajoutant 1 μl de solution mère de GTP ou de GDP dans le même tampon que celui utilisé dans l’expérience (concentration finale de 2 mM). Incuber pendant 10 ou 2 min (pour les tampons avec respectivement 50 mM de KCl et 300 mM de KCl) à 30 °C à 300 tr/min (ou dans un incubateur avec fonction d’agitation).
  4. Transférez les tubes dans un rotor d’ultracentrifugeuse et faites-les tourner pendant 10 min à 350 000 x g (89 700 tr/min pour le rotor TLA 120.1) à 25 °C.
  5. Après l’essorage, retirez soigneusement les tubes du rotor et transférez immédiatement le surnageant dans un tube propre. Préparez les échantillons pour SDS-PAGE en ajoutant 20 μl de surnageant à 20 μl de tampon d’échantillon 2x. Faire bouillir pendant 10 min à 98 °C.
  6. Ajouter 50 μl de tampon d’échantillon 2x à la fraction de granulés contenant des polymères FtsZ. Placez le tube de l’ultracentrifugeuse dans un tube de 2 ml. Remettre la pastille en suspension pendant 10 min à 98 °C, puis ajouter 50 μl de H2O déminéralisé pour obtenir la même dilution 2x que l’échantillon surnageant.
  7. Retournez le tube d’ultracentrifugation dans le tube de 2 ml et faites-le tourner pendant 5 minutes dans une centrifugeuse Eppendorf à 18 000 x g. Retirez le tube d’ultracentrifugation du tube de 2 ml.
  8. Chargez 10 μl de chaque échantillon de surnageant et de pastille côte à côte sur un gel SDS-PAGE à 10 %. Faites fonctionner le gel à 150 V.
  9. Teindre le gel avec Coomassie Brilliant Blue G-250 et conserver pour quantification.

3. Dosage de sédimentation FtsZ à spin lent

  1. Préparez la solution de polymérisation comme à l’étape 2, ajoutez SepF et/ou FtsZ (concentration finale 12 μM). Ces expériences peuvent être réalisées dans des tubes jetables Beckman de 1,5 ml en combinaison avec un rotor TLA-55.
  2. Placez le tube dans un incubateur avec fonction d’agitation et incubez pendant 2 min à 30 °C à 300 tr/min.
  3. Commencer la polymérisation en ajoutant 1 μl de GTP ou de GDP à partir d’une solution mère (concentration finale de 2 mM), incuber pendant 20 min à 30 °C à 300 tr/min.
  4. Rotation vers le bas pendant 15 min à 24 600 x g (20 000 tr/min pour le rotor TLA 55) à 25 °C.
  5. Retirez le surnageant et transférez-le dans un tube propre, prélevez 20 μl et transférez-le dans 20 μl de tampon d’échantillon 2x. Faire bouillir pendant 10 min à 98 °C.
  6. Ajouter 50 μl de tampon d’échantillon 2x à une fraction de granulés contenant des polymères et remettre en suspension par ébullition pendant 10 min à 98 °C, ajouter 50 μl de H2O déminéralisé.
  7. Chargez 10 μl de chaque échantillon de surnageant et de pastille côte à côte sur un gel SDS-PAGE à 10 %. Faites fonctionner le gel à 150 V.
  8. Teindre le gel avec Coomassie Brilliant Blue G-250 et conserver pour quantification.

4. Quantification des essais de sédimentation FtsZ

  1. Prenez une photo du gel coloré Coomassie à l’aide d’un système de documentation de gel (par exemple LAS-4000, Fujifilm).
  2. Ouvrez l’image du gel dans un programme adapté à l’analyse densitométrique des gels (par exemple le programme d’analyse d’images AIDA (Raytest)) et décrivez l’analyse dans ce programme ci-dessous.
  3. Cliquez sur le bouton « Évaluation » dans la barre d’outils.
  4. Sélectionnez la « Densitométrie 2D » dans la liste et cliquez sur ok.
  5. Dans le menu principal, cliquez sur « Évaluation » et choisissez l’entrée « Détermination de la région ».
  6. Pour créer une région sur le gel, cliquez sur le symbole de l’outil Contour automatique dans la boîte à outils Détermination de région.
  7. Cliquez dans le coin supérieur gauche de la bande protéinée du gel, maintenez le bouton de la souris enfoncé et faites-le glisser vers l’extrémité inférieure droite souhaitée de la bande et relâchez le bouton de la souris.
  8. Marquez chaque bande FtsZ/SepF de la même manière.
  9. Toutes les informations relatives à l’évaluation des régions attribuées se trouvent dans le rapport sur les régions. Pour obtenir le rapport de région, cliquez sur le bouton « Afficher le rapport de région » dans la boîte à outils de détermination de la région.
  10. Pour exporter le rapport, dans le menu principal, cliquez sur Fichier et choisissez l’entrée « Exporter à Rapport de Région 2D ».
  11. Dans le rapport de région, l’intensité de chaque région créée doit être trouvée. Calculez le pourcentage de protéines (FtsZ, protéine régulatrice) dans la pastille à l’aide des valeurs d’intensité du rapport.

5. Diffusion de la lumière à 90°

  1. Allumez un spectromètre à fluorescence (par exemple AMINCO-Bowman Series 2), laissez la lampe se réchauffer pendant plusieurs minutes pour éviter les fluctuations thermiques et allumez un bain-marie à circulation pour maintenir la température de la chambre de la cuvette à 30 °C.
  2. Définir les paramètres de fonctionnement du spectromètre : détecteur haute tension 300 V, longueur d’onde d’émission et d’excitation : 350 nm, largeur de fente : 4 nm. Notez que de nombreux spectromètres ajustent automatiquement le signal au début d’une expérience à un certain pourcentage (par exemple 60 %) du maximum. Cela provoque un signal de diffusion hors de portée dès que le GTP est ajouté pour polymériser FtsZ. Il est sage d’établir d’abord la bonne amplification du signal - détecteur haute tension - pour une polymérisation maximale avant de commencer une série d’expériences.
  3. Programmez un protocole d’acquisition de données. Choisissez l’acquisition basée sur le temps, d’une durée de 3 600 secondes.
  4. Nettoyez soigneusement une cuvette de fluorescence avec de l’eau et de l’éthanol, si nécessaire - sonicate au bain-marie à température ambiante pendant 5 min. Dans ce protocole, des cuvettes d’une longueur de trajet de 1 cm et d’un volume de 200 μl ont été utilisées et stockées dans une solution de stockage (0,5 à 1 % d’Hellmanex). En alternative, des cuvettes en plastique à usage unique compatibles avec les UV (UVette, Eppendorf) peuvent être utilisées.
  5. Préparez 294 μl d’un mélange maître du tampon de polymérisation (voir point de préparation de l’échantillon 1) avec 10 mM de MgCl2 et 12 μM FtsZ comme concentration finale calculée pour 300 μl, et vortex.
  6. Transférez 196 μl du tampon de polymérisation dans la cuvette et placez-le dans le spectromètre. Incuber pendant 2 min à 30 °C.
  7. Démarrez l’acquisition des données et attendez 90 secondes pour vérifier que le signal est stable.
  8. Ajouter 4 μl de 100 mM GTP ou GDP (concentration finale : 2 mM) pour obtenir un volume de réaction final de 200 μl, pipeter vers le haut et vers le bas avec une pipette de plus grand volume pour mélanger et reprendre l’acquisition.

6. Microscopie électronique en transmission

  1. Préparez les échantillons comme pour l’essai de sédimentation FtsZ (le volume peut être réduit à 10 μl de volume final pour économiser du matériel).
  2. Après le temps d’incubation, appliquez 2 μl de l’échantillon sur une grille de cuivre recouverte de carbone de 400 mailles déchargée par incandescence, incubez pendant 15 secondes.
  3. Séchez la grille en touchant ou en faisant glisser doucement la grille parallèlement ou perpendiculairement à un morceau de papier filtre.
  4. Teindre la grille à l’aide de 4 μl d’une solution d’acétate d’uranyle à 2 %. Séchez la grille comme décrit à l’étape 6.3.
  5. Visualisez la grille d’un microscope électronique Philips CM120 fonctionnant à 120 kV avec un grossissement de 39 200X.

7. Dosage de l’hydrolyse GTP

La configuration de l’expérience est conçue de telle sorte que l’hydrolyse GTP de FtsZ est arrêtée après divers temps de réaction en mélangeant la réaction avec du vert de malachite. De cette façon, le moment du développement de la couleur du vert malachite est le même pour chaque échantillon.

  1. Préparer 1,5 ml de 2 mM GTP dans l’un des tampons de polymérisation (voir préparation de l’échantillon, point 1).
    Préparez une dilution d’étalon de phosphate de 0 à 40 μM dans un tampon de polymérisation et préparez le réactif de travail au vert de malachite comme décrit dans le kit POMG-25H (Bio assays). Alternativement, les réactifs fonctionnels peuvent être préparés en interne selon les protocoles décrits par Lanzetta et al.16
  2. Préparez des mélanges maîtres dans un volume total de 360 μl :
    Je24 μM FtsZBs, 20 mM MgCl2, tampon de polymérisation
    Ii12 μM FtsZEc, 20 mM MgCl2, tampon de polymérisation
    III (contrôle 1)24 μM FtsZBs, 2 mM EDTA, tampon de polymérisation
    IV (témoin 2)12 μM FtsZEc, 2 mM EDTA, tampon de polymérisation
  3. Pipette 20 μl d’aliquotes des mélanges maîtres, 100 μl d’étalons de phosphate et 180 μl de 2 mM GTP dans une plaque qPCR à 96 puits dans l’ordre suivant :
    unLLDLLLH
    1IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    deuxIiiIiiJeJeIvIvIiIi
    3IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    4IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    5IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    6IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    7IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    8IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    9PsPsPsPsPsPsPsPs
    10PsPsPsPsPsPsPsPs
    11
    12GTPGTPGTPGTPGTPGTPGTPGTP

    PS - étalon phosphate
  4. Placez la plaque qPCR dans une machine PCR avec le programme réglé sur un cycle de 40 min à 30 °C.
  5. Préparez 20 μl d’aliquotes de réactif de travail vert de malachite dans une plaque à 96 puits. Ajouter 60 μl du tampon de polymérisation de l'expérience dans les voies 1'-8'. L'échantillon sera dilué 4 fois par rapport à l'étalon de phosphate, veuillez tenir compte de ce fait lors des calculs finaux.
    unLLDLLLH
    1'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    2'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    3'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    4'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    5'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    6'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    7'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    8'IiiIiiJeJeIvIvIiIi
    9'PsPsPsPsPsPsPsPs
    10'PsPsPsPsPsPsPsPs
  6. Ajouter 20 μl de GTP dans la voie 1, pipeter de haut en bas pour mélanger, démarrer la minuterie (c’est le point de départ de la réaction de 30 minutes).
  7. Après 10 min, 30 sec, ajoutez GTP à la voie 2, pipetez de haut en bas pour mélanger (réaction de 20 min).
  8. Après 16 minutes, ajoutez du GTP au couloir 3, pipetez de haut en bas pour mélanger (réaction de 15 min).
  9. Après 21 min, 30 sec, ajoutez GTP au couloir 4, pipetez de haut en bas pour mélanger (réaction de 10 min).
  10. Après 25 min, ajoutez GTP au couloir 5, pipetez de haut en bas pour mélanger (réaction de 7 min).
  11. Après 27 min, 30 sec, ajoutez GTP à la voie 6, pipetez de haut en bas pour mélanger (réaction de 5 min).
  12. Après 29 minutes, ajoutez du GTP au couloir 7, pipetez de haut en bas pour mélanger (réaction de 4 minutes).
  13. Après 30 min, transférez 20 μl du couloir 1 dans le couloir 1', pipette de haut en bas pour mélanger (point de départ du développement de la couleur vert malachite pour la réaction de 30 min).
  14. Après 30 min, 30 sec transférer 20 μl du couloir 2 à 2', pipette de haut en bas pour mélanger (point de départ du développement de la couleur vert malachite pour la réaction de 20 min).
  15. Répétez l’étape pour les couloirs 3 à 7 toutes les 30 secondes.
  16. Après 33 min, 30 sec, ajoutez 20 μl de GTP dans le couloir 8, pipetez de haut en bas pour mélanger et transférez 20 μl au couloir 8', pipette de haut en bas pour mélanger (réaction de 0 min et point de départ pour le développement de la couleur vert malachite pour la réaction).
  17. Après 34 min, ajouter 80 μl du couloir 9 à 9', pipette de haut en bas pour mélanger (le point de départ du développement de la couleur vert malachite pour l'étalon de phosphate 1).
  18. Après 34 min 30 sec, transférez 80 μl du couloir 10 à 10', pipetez de haut en bas pour mélanger (le point de départ du développement de la couleur vert malachite pour le phosphate standard 2).
  19. Retirez toutes les bulles d’air des échantillons et incubez la plaque à température ambiante pendant encore 25 min 30 sec.
  20. Placez la plaque dans un lecteur de plaque à 96 puits.
  21. Après 60 min, mesurez la plaque 10x toutes les 30 secondes à la longueur d’onde 630 nm (le développement de la couleur vert malachite est maintenant de 30 min pour la première réaction). Chaque mesure correspond à chaque point temporel des étapes 7.6-7.12 et 7.16 et doit être calculée séparément lors d’une analyse de données.
  22. Calculez la teneur en phosphate libre dans chaque échantillon à l’aide de la courbe d’étalonnage de l’étalon de phosphate.
  23. Tracez les données sous forme de libération de phosphate au fil du temps et calculez l’activité d’hydrolyse du FtsZ GTP à partir de la plage linéaire de la courbe.

Résultats

La purification de FtsZ à partir de différentes sources bactériennes a été décrite dans la littérature et est résumée dans le tableau 1.

SourceMéthodeModificationRendement obtenu [mg/L de culture]>Références
B. subtilis1) Précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'échange d'ionsnon40Ce travail, 11,15
2) Chromatographie d'affinitéMarqueur HisND17
E. coli1) Précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'échange d'ionsnon35Ce travail, 11,15
2) Précipitation au calcium, chromatographie d'échange d'ionsnon4018
Methanococcus jannaschii1) Chromatographie d'affinité en conditions dénaturantes/repliement/ précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'exclusion par tailleMarqueur His1,319
2) Chromatographie d'affinité/ chromatographie d'exclusion par tailleMarqueur HisND20
Thermotoga maritimaChromatographie d'échange d'ions/chromatographie d'exclusion par taillenon6,719
Pseudomonas aeruginosaChromatographie d'affinité/chromatographie d'exclusion par tailleMarqueur Strep, marqueur HisND21
Mycobacterium tuberculosis1) Chromatographie d'affinité/d'échange d'ionsnonND22
2) Chromatographie d'affinité/ chromatographie d'exclusion par taillenon3023
Aquifex aeolicusChromatographie d'affinité/chromatographie d'exclusion par tailleMarqueur His, troncature C-terminale (331-367)ND24
Caulobacter crescentusChromatographie d'échange d'ions/précipitation au sulfate d'ammonium/chromatographie d'exclusion par taillenonND25

Tableau 1. Protocoles de purification de FtsZ décrits. ND : non déterminé.

Sédimentation des polymères de FtsZ

Au départ, nous avons utilisé deux vitesses différentes pour centrifuger les polymères de FtsZ. Nous avons constaté que seule une vitesse de 350 000 × g permet de précipiter des polymères individuels de FtsZEc (Figure 1), tandis qu'à 190 000 × g, seuls des faisceaux de FtsZBs sont présents dans le culot (données non montrées). Par conséquent, la vitesse de 350 000 × g a été utilisée dans nos expériences ultérieures. Le pourcentage de FtsZEc et de FtsZBs polymérisé est similaire à 50 mM de KCl, bien que les expériences de diffusion de la lumière aient révélé un signal de diffusion nettement plus élevé pour FtsZBs. Ceci est dû aux faisceaux formés par FtsZBs, qui diffusent davantage la lumière que les polymères individuels de FtsZEc. Il n'a pas été possible d'obtenir une quantité importante de polymères de FtsZ dans le culot dans l'expérience réalisée avec 300 mM de KCl, aussi bien pour FtsZEc que pour FtsZBs (Figure 1). Nous attribuons cela à une combinaison de désassemblage rapide des structures de FtsZ et de réduction de l'agrégation des filaments.

Sédimentation des tubules FtsZ-SepF

Pour analyser l'interaction de FtsZ avec certains activateurs, des essais de sédimentation peuvent être réalisés à des vitesses de centrifugation plus faibles. À cette vitesse, seules les structures de grande taille de FtsZ peuvent être centrifugées, par exemple les longs tubules formés par les anneaux de SepF et les filaments de FtsZBs5, ou les faisceaux formés par FtsZ et ZapA. Nous avons utilisé une centrifugation à basse vitesse (24 600 × g) afin de démontrer la faisabilité de cette approche pour les tubules formés par FtsZ et SepF. FtsZ a été récupéré dans le culot au-dessus des niveaux de fond uniquement lorsque SepF et le GTP étaient tous deux présents dans l'échantillon (Figure 2), et la présence de SepF n'influence pas l'activité GTPase de FtsZ7, ce qui montre que FtsZ est pleinement actif en présence de SepF. La sédimentation spécifique de SepF et de FtsZ représente environ 45 % du SepF total et 15 % du FtsZ total (par rapport au matériel sédimenté en présence de GDP). Cela indique que les tubules SepF-FtsZ contiennent plus de SepF que de FtsZ. Cette observation peut s'expliquer par le fait que de nombreux anneaux de SepF organisent les tubules FtsZ-SepF5,7. La stœchiométrie exacte de SepF-FtsZ dans ces tubules n'est pas connue, mais nos résultats suggèrent qu'il y a plus de SepF que de FtsZ.

Propriétés de polymérisation et d'agrégation de FtsZEc et de FtsZBs

Afin de caractériser l'efficacité de polymérisation de FtsZBs et de FtsZEc dans différents tampons, nous avons analysé les deux protéines par diffusion de la lumière à un angle de 90°. À 50 mM de KCl, FtsZBs produit un signal de diffusion de la lumière 20 à 40 fois plus élevé que FtsZEc, selon le pH du tampon (Figures 3A et 3B), confirmant les résultats de Buske et al.26. L'augmentation de la concentration de KCl dans le tampon n'a pas influencé de manière significative le signal de diffusion de la lumière de FtsZEc (Figure 3D), mais le signal de FtsZBs a diminué d'environ 80 fois à pH 7,5, d'environ 30 fois à pH 6,8 et d'environ 45 fois à pH 6,5 en présence de 300 mM de KCl (Figure 3C), comparé aux tampons contenant 50 mM de KCl (Figure 3A). La désassemblage des polymères de FtsZ est plus rapide à plus forte concentration de KCl pour les deux protéines (Figures 3C et 3D). Des études de Pacheco-Gómez et al. montrent que la polymérisation et l'agrégation de FtsZ chez E. coli dépendent du pH. Ces auteurs ont observé qu'avec un tampon contenant 50 mM de KCl, le signal de diffusion de la lumière dû à la polymérisation de FtsZ était plus élevé et que la désassemblage de FtsZ était plus lente à pH 6,0 par rapport à pH 7,0 8. Ces résultats ne concordent pas avec nos données concernant la polymérisation de FtsZEc à 50 mM de KCl (Figure 3B), mais il convient de noter que nous avons utilisé trois tampons différents (HEPES, MES et PIPES), alors que Pacheco-Gómez et al. n'ont utilisé que le MES. Ainsi, ce n'est pas seulement le pH, mais aussi la composition du tampon (force ionique) qui affecte la cinétique des polymères de FtsZ à 50 mM de KCl. Toutefois, à 300 mM de KCl, ni la composition du tampon ni le pH n'ont influencé de manière détectable l'assemblage de FtsZEc.

Une expérience de diffusion de la lumière de FtsZBs dans des tampons sans KCl n'a pas été possible en raison de la précipitation de la protéine dans ces conditions. Lorsque la concentration de FtsZBs a été abaissée à 3 µM, aucune précipitation n'a eu lieu. Toutefois, 3 µM n'est pas la concentration physiologique de FtsZ dans la cellule. Dans des cuvettes en plastique, FtsZBs ne précipitait pas à 12 µM à pH 7,5, mais à pH 6,8 et 6,5, FtsZ précipitait encore en l'absence de KCl.

Morphologies des structures de FtsZ provenant d'E. coli et de B. subtilis

Les structures formées par FtsZ ont été examinées par microscopie électronique en transmission (MET). FtsZBs s'est assemblé en des polymères fortement compactés qui recouvraient entièrement la grille dans tous les tampons à faible concentration saline (Figures 4A-C). FtsZEc a formé des filaments longs, des câbles et des faisceaux dans tous les tampons à faible concentration saline (Figures 4D-F). Toutefois, la quantité observable de polymères formés par FtsZEc était inférieure à celle formée par FtsZBs. Dans les tampons à forte concentration saline, FtsZBs a formé des protofilaments unistrandés plus longs qui ne s'associaient pas en faisceaux (Figures 4G-I). Alors que la structure des protofilaments de FtsZBs changeait à plus forte concentration saline, FtsZEc formait des structures indistinguables de celles observées dans le tampon à faible concentration saline (Figures 4J-L). Aucun effet observable du pH sur la polymérisation de FtsZEc n'a été détecté, mais FtsZBs forme davantage de faisceaux à pH 6,5, visibles sous forme de polymères fortement compactés et de feuillets (Figure 4B). Ces résultats sont en accord avec nos expériences de diffusion de la lumière et des travaux antérieurs publiés utilisant la MET8,11,26.

L'activité GTPase de FtsZ à des concentrations élevées et faibles de KCl

L'activité d'hydrolyse du GTP de FtsZ a été mesurée dans différentes conditions à l'aide d'un dosage colorimétrique du phosphate libre. Comme indiqué précédemment15, l'activité GTPase de FtsZ augmentait avec la concentration croissante de KCl : selon le tampon utilisé, FtsZBs présentait un accroissement de 3 à 7 fois, et FtsZEc un accroissement de 1,5 à 2,5 fois de son activité GTPase à 300 mM de KCl par rapport à 50 mM de KCl. La réduction de l'activité GTPase à 50 mM de KCl est due au regroupement des filaments de FtsZBs. À 50 mM de KCl, FtsZEc présentait une activité GTPase 3 à 6 fois supérieure à celle de FtsZBs, en raison d'un désassemblage plus rapide des polymères de FtsZEc. La différence d'activité d'hydrolyse du GTP entre FtsZBs et FtsZEc était réduite à 300 mM de KCl, probablement en raison d'un regroupement moindre des filaments de FtsZBs (Figure 5).

Polymérisation de FtsZ, analyse du pourcentage de culot, graphique en barres, électrophorèse sur gel, comparaison de l'effet du GTP/GDP.
Figure 1. Quantification de la polymérisation de FtsZ par sédimentation. (A) 12 µM de FtsZ ont été polymérisés en présence de 2 mM de GTP ou de GDP à pH 7,5 (barres noires), 6,8 (barres grises) ou 6,5 (barres blanches). La quantité de protéine mise en culot a été déterminée par analyse densitométrique de gels colorés au Coomassie. Le GDP a servi de contrôle pour une sédimentation spécifique, et le pourcentage de FtsZ sédimenté en présence de GDP a été soustrait du pourcentage de FtsZ sédimenté en présence de GTP afin d'obtenir les valeurs représentées sur le graphique. À gauche : FtsZ sédimenté à 50 mM de KCl ; à droite : FtsZ sédimenté à 300 mM de KCl. (B) Résultats représentatifs obtenus à partir de gels colorés au Coomassie. Polymérisation de FtsZBs (gel supérieur) et de FtsZEc (gel inférieur) à 50 mM de KCl. (S) fractions du surnageant, (P) fractions du culot issues de l'expérience. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Graphique d'interaction entre FtsZ et SepF et gel montrant l'influence du GTP/GDP sur le pourcentage de protéines dans le culot.
Figure 2. Sédimentation des tubules SepF/FtsZ à basse vitesse. (A) 12 µM de FtsZBs ont été polymérisés avec 2 mM de GDP (barres blanches) ou de GTP (barres noires). La quantité de protéine dans le culot a été déterminée par analyse densitométrique de gels colorés au Coomassie. Les signes + et - sous l'axe des abscisses indiquent la présence ou l'absence de FtsZ et de SepF dans la réaction. (B) Résultats représentatifs obtenus sur un gel coloré au Coomassie. Polymérisation du FtsZBs en présence ou en absence de SepF. À titre de contrôle, SepF a été utilisé sans FtsZ. La polymérisation a été réalisée avec du GTP et du GDP. (S) fractions du surnageant, (P) fractions du culot issues de l'expérience. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Graphiques de diffusion de la lumière de FtsZ avec des concentrations de KCl ; montrant les effets du pH 6,5, 6,8, 7,5.
Figure 3. Diffusion de la lumière de 12 μM FtsZEc et 12 μM FtsZBs. Les FtsZ ont été assemblées en présence de 2 mM GTP et la polymérisation a été suivie par diffusion de la lumière à un angle de 90°. Polymérisation de FtsZBs (A) et de FtsZEc (B) à 50 mM KCl aux pH 7,5, 6,8 et 6,5. Polymérisation de FtsZBs (C) et de FtsZEc (D) à 300 mM KCl aux pH 7,5, 6,8 et 6,5. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Microscopie électronique de polymères de FtsZ à différents pH et concentrations de KCl ; analyse structurale.
Figure 4. Structures des polymères de FtsZBs et de FtsZEc visualisées par microscopie électronique. (A-L) Images de FtsZBs à 12 µM (A-C et G-I) et de FtsZEc (D-F) et (J-L) polymérisés avec 2 mM de GTP. (A-C) FtsZBs dans un tampon contenant 50 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. (D-F) FtsZEc dans un tampon contenant 50 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. (G-I) FtsZBs dans un tampon contenant 300 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. (J-L) FtsZEc dans un tampon contenant 300 mM de KCl et un pH de 7,5, 6,8 et 6,5 respectivement. Échelle : 100 nm. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Graphique de l'activité GTPase ; diagramme en barres de FtsZ à 50 mM et 300 mM de KCl, variations de pH à 7,5, 6,8 et 6,5.
Figure 5. Hydrolyse du GTP lors de la polymérisation de FtsZ dans six tampons différents. Dans toutes les expériences, 2 mM de GTP ont été utilisés. Un échantillon témoin sans MgCl2 a été utilisé. L'activité de FtsZ sans MgCl2 a été soustraite de l'activité de FtsZ en présence de MgCl2. À gauche : activité GTPase de FtsZ à 50 mM de KCl ; à droite : activité GTPase de FtsZ à 300 mM de KCl. Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande.

Discussion

Nous décrivons un ensemble de méthodes qui permettent une analyse rapide de l’activité de FtsZ et de son interaction avec d’autres protéines. La diffusion de la lumière, la sédimentation et les dosages de GTPase ainsi que la microscopie électronique ont été largement utilisés pour étudier la polymérisation de FtsZ. Nous avons apporté quelques améliorations aux protocoles existants, nous avons montré l’influence de différentes conditions sur l’assemblage des FtsZ, et nous proposons des contrôles qui devraient être inclus dans les études FtsZ.

Nous introduisons la centrifugation à basse vitesse pour distinguer les grandes structures formées par l’association entre FtsZ et ses protéines en interaction des polymères FtsZ. Cette méthode présente deux avantages par rapport à l’essai de sédimentation standard. Tout d’abord, aucun fond n’est formé par les polymères FtsZ dans la fraction de granulés, car ils ne sont pas filés à 24 600 x g. Deuxièmement, la quantité de FtsZ présente dans la structure formée par une protéine en interaction peut être calculée à partir du gel. Deux étapes critiques de cette méthode sont le temps d’incubation et la concentration de GTP. Il est important de centrifuger la grande structure protéique lorsqu’elle est complète, mais avant qu’elle ne se désassemble lorsque tout le GTP est hydrolysé. Le meilleur contrôle pour cette étude est la polymérisation de FtsZ avec GDP. Il y a une limite potentielle du test. FtsZ forme un complexe stable avec SepF, qui peut facilement être filé à 24 600 x g. Si la sédimentation avec un autre activateur ou un médicament qui regroupe des polymères FtsZ est effectuée, il peut être nécessaire d’adapter le dosage. Cela peut se faire en modifiant le temps d’incubation ou en augmentant la vitesse de centrifugation.

Une bonne préparation de l’échantillon est la plus importante pour les expériences de diffusion de la lumière. Les protéines doivent être pré-nettoyées par filage et tous les tampons doivent être filtrés avant utilisation. Si des agrégats sont présents dans l’échantillon, ils perturberont un signal stable obtenu à partir de polymères FtsZ. Pour l’analyse des structures FtsZ par microscopie électronique, la préparation d’une grille est l’étape principale. Le temps d’incubation de l’échantillon sur la grille aura pour effet de produire des polymères plus ou moins compactés. Pour les faisceaux de FtsZB, le temps d’incubation doit être plus court que pour les FtsZEc et FtsZB à forte concentration en KCl. Nous avons utilisé une concentration de 12 μM pour chaque échantillon afin de pouvoir comparer les résultats. Cependant, pour les FtsZBs à 50 mM KCl, une concentration FtsZ plus faible doit être utilisée, car 12 μM a entraîné une saturation complète de la grille. Cela rend les polymères très compacts et difficiles à détecter. Les polymères moins compactés sont mieux détectés sur EM.

Le dosage de la GTPase est la seule expérience utilisée pour étudier l’activité plutôt que les structures de FtsZ. Mg2+ est nécessaire pour le renouvellement de la GTP dans les polymères FtsZ. Ainsi, en l’absence de Mg2+, FtsZ n’hydrolyse pas le GTP. Par conséquent, un échantillon sans Mg2+ est le bon contrôle dans ce dosage, mais des cations de Mg sont présents dans le tampon de stockage FtsZ. Ils peuvent être éliminés par l’ajout de 1 mM d’EDTA à l’échantillon de contrôle. L’étape critique de ce test est le temps d’incubation. Il est important d’arrêter l’activité FtsZ après un certain temps. Ceci est réalisé en transférant l’échantillon FtsZ dans une solution de vert de malachite dans une plaque à 96 puits. Cependant, le développement de la couleur vert malachite est un processus continu. Ainsi, les mesures doivent être prises en même temps pour chaque échantillon. En utilisant un protocole d’addition GTP bien planifié avec des mesures prises toutes les 30 secondes d’intervalle dans un ordre établi, il est possible d’obtenir le même temps d’incubation et de manipulation des échantillons pour chaque point temporel. Une autre étape critique consiste à choisir la concentration de la protéine pour l’expérience. Dans l’expérience, nous avons utilisé deux concentrations différentes pour FtsZEc et FtsZBs. L’hydrolyse des GTP est beaucoup plus rapide pour lesFtsZ Ec par rapport aux FtsZBs. L’activité GTPase de FtsZEc dans les conditions choisies et à 12 μM n’est linéaire que pendant un maximum de 5 min et après cette période, le taux d’hydrolyse se stabilise. Ainsi, il est difficile d’interpréter les données de l’expérience lorsqu’elle est réalisée dans ces conditions. Dans ce cas, FtsZEc doit être utilisé à une concentration inférieure à celle de FtsZBs pour pouvoir comparer les activités des deux protéines. L’activité GTPase des FtsZ provenant de différentes sources peut varier. Ainsi, la bonne concentration doit être choisie. La concentration pour la polymérisation FtsZ doit être bien supérieure à la concentration critique (en général de 2,5 à 10 μM). La dynamique de l’assemblage et du démontage FtsZ est également importante. Certaines protéines présentent un retard significatif de polymérisation après l’ajout de GTP, comme le montrent les FtsZBs à 50 mM KCl. Il est utile d’effectuer l’essai de diffusion de la lumière avant l’essai GTPase pour estimer le moment de l’assemblage et du désassemblage des polymères FtsZ. Après cela, le moment de l’incubation et la concentration des protéines peuvent être choisis. Étant donné que les conditions choisies pour la polymérisation FtsZ sont cruciales, il est important d’utiliser le bon pH et la bonne concentration de KCl dans chaque méthode. Dans ce travail, nous avons étudié 9 tampons différents avec des pH allant de 6,5 à 7,5 et des concentrations en KCl de 0 M à 300 mM. Nous avons remarqué que la meilleure condition pour analyser les FtsZ de B. subtilis et E.coli et leur activité biologique est à un pH proche du niveau physiologique (7,5) associé à une concentration élevée de KCl. À une concentration élevée de KCl, FtsZ a une activité GTPase plus élevée et produit des polymères qui sont mieux détectables par microscopie électronique. Nous avons également confirmé que le pH physiologique et une concentration élevée de KCl sont meilleurs pour l’étude de l’interaction entre FtsZ et les protéines régulatrices que tout autre tampon principalement utilisé pour étudier l’assemblage de FtsZ. FtsZBs montre une activité similaire à celle de FtsZEc lorsqu’il est étudié à haute concentration de KCl. De plus, à une faible concentration en sel, l’influence du pH est plus visible que dans les tampons à forte concentration en sel. FtsZ précipite parfois lors de l’utilisation de tampons sans KCl, par conséquent, les tampons sans sel doivent être évités. La sédimentation des polymères FtsZ est faible lors de l’utilisation de tampons à forte concentration de KCl. Cela peut être un avantage lors de l’étude des interactions entre FtsZ et les protéines qui assemblent les filaments FtsZ telles que SepF et ZapA, car ces structures d’ordre supérieur sont faciles à détecter avec la centrifugation. Dans toutes nos expériences, nous avons utilisé du MgCl2 à une concentration de 10 mM. Il a été démontré qu’une concentration relativement élevée de Mg2+ stabilise les polymères FtsZ et réduit l’activité GTPase de FtsZ. Le tableau 2 résume les résultats de diverses études, en décrivant la polymérisation de FtsZ et l’activité de la GTPase à différentes concentrations de Mg2+ en utilisant des conditions tampons par ailleurs identiques 27. La concentration mesurée de Mg2+ cytoplasmique libre est de 0,9 mM3. Il est à noter que le GTP va chélater une quantité équivalente de Mg2+. Ainsi, la concentration optimale de Mg2+ pour les expériences de GTPase est d’environ 2-2,5 mM, ce qui est proche du niveau physiologique3. Cependant, dans nos expériences, nous avons utilisé du MgCl2 à une concentration de 10 mM pour obtenir un signal de diffusion de la lumière facilement détectable et pour stabiliser les polymères FtsZ pendant l’essai de sédimentation.

Bien que nous ayons appliqué nos protocoles aux FtsZ des organismes modèles E. coli et B. subtilis, ils peuvent être adaptés aux FtsZ de n’importe quel autre organisme. Il convient de noter que le pH physiologique et les concentrations de cations monovalents et divalents diffèrent d’un organisme à l’autre. Ainsi, les conditions optimales pour la polymérisation FtsZ peuvent varier. Les différences dans le temps de doublement et les conditions de croissance des différentes bactéries peuvent entraîner une cinétique d’assemblage différente de FtsZ et des conditions optimales des expériences. Cependant, notre protocole fournit un bon point de départ pour les expériences avec des FtsZ d’autres organismes. Les protocoles devraient être utiles pour l’étude de FtsZ avec des protéines régulatrices ou l’étude des effets de petits composés et de médicaments sur FtsZ.

SourcePolymérisation [ % de FtsZ sédimentés]GTPase [Pi/FtsZ/min]Concentration en mg2+ [mM]Concentration FtsZ [μM]Références
FtsZEc~ 28 %~ 2,11012Ce travail
~ 50 %~ 2,41012.527
~ 43 %~ 3,5512.527
~ 27 %~ 4,62.512.527
ND~ 5,42.5526
FtsZBs~ 30 %~ 0,812Ce travail
~ 52 % (avec DEAE dextran)~ 0,5101011
ND~ 2,252.5526

Tableau 2. Effet sur le Mg2+ sur la polymérisation FtsZ et la GTPase. Résultats de ce travail comparés aux données publiées. Toutes les expériences ont été réalisées dans 50 mM MES/NaOH, pH=6,5, 50 mM KCl.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Le travail dans notre laboratoire est financé par une subvention VIDI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (à DJS). Nous remercions Marc Stuart et le Département de microscopie électronique de notre université pour leur aide et leur accès au microscope électronique à transmission.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GTPRoche 10106399001Partie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Tubes en polycarbonate à paroi épaisseBeckman Coulter343776Partie 2
Ultracentrifugeuse Optima MAX-XPBeckman Coulter393315Partie 2, 3
Tube polyallomère avec capuchon encliquetableBeckman Coulter357448Partie 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FLRaytest Isotopenmessgerä ; te GmbH15000001Partie 4
Analyseur d’images de luminescence LAS-4000FujifilmPartie 4
Spectromètre thermo-spectronique AMINCO-BowmanInstruments spectroniquesPartie 5
fluorescenceHellma Analytics105-250-15-40Partie 5
Carré 400 Mesh, cuivre, 100/flaconMicroscopie électronique SciencesG400-CuPartie 6
CM120 Microscope électronique fonctionnant à 120 kVPhilipsPartie 6
96 ml x 0,2 ml PlaqueBIOplastiquesB70501Partie 7
Kit de dosage de phosphate vert de malachiteSystème de dosage BioAssayPOMG-25HPartie 7
Spectrophotomètre de microplaques PowerWave HTBioTekPartie 7
Cellule de

Références

  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Essai de diffusion de la lumi reessai de s dimentationessai d hydrolyse du GTPmicroscopie lectroniqueconditions de tamponchlorure de potassiumEscherichia coliBacillus subtilisinteraction prot ique
Tests de polymérisation FtsZ : protocoles et considérations simples
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.