Établissement de la concentration bactéricide minimale d’un agent antimicrobien pour les cellules planctoniques (MBC-P) et les cellules de biofilm (MBC-B)

Résumé

Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro à l’aide d’une plaque de microtitre de 96 puits. Les bactéries planctoniques ou biofilms sont exposées à des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix. La viabilité est dosée par croissance sur des plaques de gélose.

Résumé

Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro. Les bactéries sont inoculées dans les puits d’une plaque de microtitre de 96 puits. Dans le cas du test planctonique, des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées aux suspensions bactériennes. Dans le test du biofilm, une fois inoculées, les bactéries sont laissées pour former un biofilm sur une période de temps définie. Les cellules non attachées sont retirées des puits, le milieu est reconstitué et des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées. Après l’exposition à l’agent antimicrobien, les cellules planctoniques sont analysées pour la croissance. Pour le dosage du biofilm, le milieu est rafraîchi avec des milieux frais dépourvus de l’agent antimicrobien et les cellules du biofilm sont laissées à récupérer. La viabilité des cellules du biofilm est analysée après la période de récupération. Le MBC-P pour l’agent antimicrobien est défini comme la plus faible concentration de médicament qui tue les cellules dans la culture planctonique.  En revanche, le MBC-B d’une souche est déterminé en exposant des biofilms préformés à des concentrations croissantes d’agent antimicrobien pendant 24 heures. Le MBC-B est défini comme la plus faible concentration d’agent antimicrobien qui tue les cellules du biofilm.

Introduction

Des tests de résistance aux antibiotiques ont été initialement développés pour tester la résistance des cultures planctoniques (nageant librement) de bactéries. Étant donné que de nombreuses infections bactériennes impliquent des biofilms (cellules attachées en surface), nous étions intéressés à développer une méthode pour analyser la résistance aux antibiotiques spécifique au biofilm. Cependant, la plupart des tests de résistance aux antibiotiques sont mal adaptés pour mesurer la résistance des biofilms. Par exemple, la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est la norme de référence pour déterminer la résistance aux antibiotiques des cultures bactériennes planctoniques ¹. Ce dosage consiste à mélanger une culture planctonique diluée avec une série de dilutions d’antibiotiques.  La concentration d’antibiotique qui inhibe la croissance visible des cellules planctoniques est le MIC. Étant donné que ce test repose sur l’inhibition de la croissance, par définition, il ne peut pas fonctionner avec des cultures de biofilm, ce qui nécessite d’examiner la sensibilité aux antibiotiques des cellules d’un biofilm précroissé. Au lieu de mesurer l’inhibition de la croissance, le test MBC-B décrit ici détermine la concentration d’antibiotique qui tue les cellules déjà existantes dans un biofilm. Ainsi, ce test vise à imiter les traitements antibiotiques des infections à biofilm établies, et à fournir une vue plus pertinente de la résistance bactérienne aux antibiotiques in vivo.

Étant donné que les biofilms sont généralement plus résistants aux antibiotiques que les cultures planctoniques ^2-4, il a été nécessaire de concevoir une méthode qui relie directement la résistance aux antibiotiques d’un biofilm à celle d’une culture planctonique. Ainsi, un autre objectif de cette méthode est de pouvoir comparer directement le niveau de résistance aux antibiotiques entre les cellules planctoniques et biofilm. Les essais MBC-P et MBC-B décrits ici rendent cela possible parce que les cellules sont cultivées dans des conditions similaires. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier plusieurs gènes qui sont importants pour la résistance aux antibiotiques spécifiques au biofilm ^5-8 .

Protocole

1. MBC-B

1. Cultiver un biofilm (adapté de O’Toole⁹).
   1. Cultiver une culture de la souche d’intérêt de type sauvage et de la souche mutante pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 °C.
   2. Diluer les cultures saturées pendant la nuit 1:100 en milieu frais pour les tests de résistance aux antibiotiques. Un milieu standard pour P. aeruginosa est le milieu minimal M63 complété par du sulfate de magnésium et de l’arginine (voir le tableau 1). Ce milieu stimule la formation d’un biofilm plus robuste.
   3. Ajouter 100 μl de dilution par puits dans une parabole de microtitre de 96 puits (voir tableau 1). Étant donné que ces essais sont généralement effectués en triple exemplaire pour chaque souche, il devrait y avoir 24 puits de chaque souche.
   4. Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
2. Exposition du biofilm préformé à un gradient de concentration d’antibiotique
   1. Préparez une série d’antibiotiques à dilution 10x pour 7 puits. Exemple : pour l’antibiotique tobramycine, les concentrations finales dans les puits sont de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 et 0,006 mg/ml ^5-8 . À partir d’un stock de 25 mg/ml, préparer 10x dilutions de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 et 0,06 mg/ml. Laisser sur la glace.
   2. Retirer le surnageant usé (contenant des cellules planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanal (voir le tableau 1).
   3. Ajouter 90 μl de M63 (Mg/Arg) à tous les puits.
   4. Ajouter 10 μl de chaque concentration 10x d’antibiotique afin d’atteindre les concentrations finales souhaitées. Ajouter 10 μl d’eau (sans antibiotique) au puits final pour chaque répétition et souche.
   5. Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
3. Rafraîchir les médias et permettre le détachement des cellules vivantes.
   1. Retirez le surnageant usé (contenant des cellules planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanal.
   2. Ajouter 115 μl de M63 (Mg/Arg) à tous les puits.
   3. Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
4. Dosage pour les cellules vivantes.
   1. Étiqueter deux plaques de gélose LB par plaque de microtitration de 96 puits.
   2. Stériliser le dispositif à plusieurs broches (voir tableau 1)en trempant les broches dans de l’éthanol à 100% et en passant les broches à travers la flamme nue d’un brûleur Bunsen. répéter. Laissez les broches refroidir légèrement. À l’aide du dispositif multiprong, transférer ~3 μl (quantité qui est généralement retenue sur les extrémités des broches) de culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitre à la surface d’une plaque de gélose LB.
   3. Incuber les plaques de gélose LB pendant 16 heures à 37 °C.
   4. Déterminer la concentration bactéricide minimale de l’antibiotique en identifiant, par voie oculaire, le seuil de croissance bactérienne (Figure 1).

2. MBC-P

1. Préparation de souches bactériennes
   1. Cultiver une culture de la souche d’intérêt de type sauvage et de la souche mutante pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 °C.
   2. Diluer les cultures saturées pendant la nuit 1:100 en milieu frais pour les tests de résistance aux antibiotiques. Un milieu standard pour P. aeruginosa est le milieu minimal M63 complété par du sulfate de magnésium et de l’arginine (voir le tableau 1).
   3. Ajouter 90 μl de dilution par puits dans une parabole de microtitre de 96 puits (voir tableau 1). Étant donné que ces essais sont généralement effectués en triple exemplaire pour chaque souche, il devrait y avoir 24 puits de chaque souche.
2. Exposition de cellules planctoniques à un gradient de concentration d’antibiotique
   1. Préparer une série d’antibiotiques 10x dilution pour 7 puits. Exemple : pour l’antibiotique tobramycine, les concentrations finales dans les puits sont de 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 et 0,0005 mg/ml. À partir d’un stock de 25 mg/ml, préparer des dilutions de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 et 0,005 mg/ml. Laisser sur la glace.
   2. Ajouter 10 μl de chaque concentration 10x d’antibiotique afin d’atteindre les concentrations finales souhaitées. Ajouter 10 μl d’eau (sans antibiotique) au puits final pour chaque répétition et souche.
   3. Incuber la plaque de microtitre pendant 24 heures à 37 °C.
3. Dosage pour les cellules vivantes.
   1. Étiqueter deux plaques de gélose LB par plaque de microtitration de 96 puits.
   2. Stériliser le dispositif à plusieurs broches (voir tableau 1)en trempant les broches dans de l’éthanol à 100% et en passant les broches à travers la flamme nue d’un brûleur Bunsen. répéter. Laissez les broches refroidir légèrement. À l’aide du dispositif multiprong, transférer ~3 μl (quantité qui est généralement retenue sur les extrémités des broches) de culture planctonique de chaque puits de la plaque de microtitre à la surface d’une plaque de gélose LB.
   3. Incuber les plaques de gélose LB pendant 16 heures à 37 °C.
   4. Déterminer la concentration bactéricide minimale de l’antibiotique en identifiant, par voie oculaire, la coupure pour la croissance bactérienne (Figure 2).

Résultats

Des essais MBC-P et MBC-B ont été effectués, comparant la sensibilité du type sauvage PA14 avec PA14 ∆ndvB. La tobramycine a été utilisée comme antibiotique. Les résultats correspondant à l’étape 1.4.4(figure 1)et à l’étape 2.3.4(figure 2)sont présentés. PA14 et ∆ndvB ont été inoculés dans les essais MBC-P et MBC-B en triple exemplaire. Après avoir terminé les étapes 1.0-1.4 du protocole MBC-B et les étapes 2.0-2.3 du protocole MBC-P, les cellules viables ont été plaqué...

Discussion

La résistance aux antibiotiques dans les cellules planctoniques est définie comme une augmentation de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique due à un changement permanent dans les cellules(par exemple, une mutation). Les mécanismes de résistance ou de tolérance spécifiques au biofilm qui ont été identifiés à ce jour sont le résultat de l’expression de gènes de type sauvage dans les biofilms. Ainsi, la définition classique de la résistance ne s’applique pas aux biofilms. Cependant, un autre...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x ; M63			Préparer en tant que 5x  ; Stock M63 en dissolvant 15 g de KH2PO4, 35 g de K2HPO<>4 et 10 g (NH4)2SO4 dans 1 L d’eau. Ce stock n’a pas besoin d’être autoclavé et peut être stocké à température ambiante. Diluer 5x  ; stock 1:5, autoclave, refroidir, puis ajouter les composants souhaités.
KH2PO4	Fisher	P285-500
> K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Sulfate de magnésium	Fisher	M63-500	Ajouter à 1 mM de concentration finale.  ; Préparer sous forme de stock de 1 M dans l’eau et l’autoclave.
Tobramycine	Sigma		Préparer 50 mg/m  ; stock. Aliquote et stockage à A5131	Ajouter à 0,4 % de concentration finale.  ; Préparer à 20 % dans l’eau et filtrer la stérilisation. Cette source alternative de carbone/énergie peut remplacer le glucose et les acides casaminés
plaques de microtitration à 96 puits	Corning	3595	Stérile, à fond plat, à faible évaporation
Tranferpette (pipette multicanaux)	BrandTech	2703610	8 canaux, 20-200 &mu ; l
Dispositif multigriffes	Dan-Kar	MC48	48 broches s’insèrent dans ½ ; d’une plaque de microtitration de 96 puits