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Déclenchement à distance magnétique de sondes micrométriques pour

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DOI :

10.3791/50857

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2 mai 2014

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1Physicochime Curie, CNRS UMR 168, Institut Curie, Sorbonne Universités, UPMC, 2Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, 3Laboratoire Jean Perrin, CNRS UMR 8237, Sorbonne Universités, UPMC

Dans cet article

Résumé

Ce document montre une méthodologie originale sur la base de l'actionnement à distance de particules magnétiques ensemencées dans un biofilm bactérien et le développement des pinces magnétiques dédiés pour mesurer in situ les propriétés mécaniques locales du matériau vivant complexe construit par des micro-organismes au niveau des interfaces.

Résumé

L'adhérence bactérienne et à la croissance sur les interfaces conduisent à la formation de structures en trois dimensions hétérogènes dits biofilms. Les cellules qui demeurent sur ces structures sont maintenues ensemble par des interactions physiques induites par un réseau de substances polymères extracellulaires. Biofilms bactériens impact sur de nombreuses activités humaines et la compréhension de leurs propriétés est cruciale pour une meilleure maîtrise de leur développement - la maintenance ou l'élimination - en fonction de leur résultat négatif ou positif. Cet article décrit une nouvelle méthodologie visant à mesurer in situ les propriétés physiques locales du biofilm qui avait été, jusqu'à présent, examiné que dans une perspective de matériau macroscopique et homogène. L'expérience décrite ici consiste à introduire des particules magnétiques dans un biofilm de plus en plus aux semences sondes locales qui peuvent être actionnés à distance sans perturber les propriétés structurales du biofilm. Pinces magnétiques dédiés ont été développé pour exercer une force définie sur chaque particule noyée dans le biofilm. La configuration est monté sur la scène d'un microscope pour permettre l'enregistrement d'images de time-lapse de la période de particules de traction. Les trajectoires des particules sont ensuite extraites à partir de la séquence de traction et les paramètres viscoélastiques locaux sont obtenus à partir de chaque courbe de déplacement des particules, assurant ainsi la distribution de 3D-spatiale des paramètres. Gagner un aperçu du profil mécanique du biofilm est essentiel du point de vue d'un ingénieur des fins de contrôle du biofilm mais aussi d'un point de vue fondamental de clarifier la relation entre les propriétés architecturales et la biologie particulière de ces structures.

Introduction

Biofilms bactériens sont des communautés de bactéries associées à des surfaces biologiques ou artificiels 1-3. Ils forment par un mécanisme d'adhérence croissance, associée à la production de matrice extracellulaire riche en polysaccharides qui protège et stabilise l'édifice 4,5. Ces biofilms sont pas simplement passifs assemblages de cellules collées aux surfaces, mais les systèmes biologiques complexes dynamiques organisés et. Lorsque les bactéries planctoniques à passer de biofilm mode de vie, les changements dans l'expression des gènes et la physiologie des cellules sont observées ainsi qu'une augmentation de la résistance aux antimicrobiens et accueillent les défenses immunitaires étant à l'origine de nombreuses infections persistantes et chroniques 6. Cependant, le développement contrôlé de ces structures vivantes offrent également des possibilités pour des applications industrielles et environnementales, telles que la bioremédiation des sites de déchets dangereux, bio-filtration de l'eau industrielle ou de la formation de bio-barrières pour protéger les sols et les eaux souterraines de contamination.

Bien que les caractéristiques moléculaires spécifiques de la manière de biofilm de vie sont de plus en plus décrits, les mécanismes d'entraînement le développement communautaire et la persistance restent floues. En utilisant les dernières avancées sur les mesures micrométriques utilisant électrochimique de balayage ou la microscopie à fluorescence, ces organisations vivantes ont été montré pour présenter considérable structurel, chimique et biologique hétérogénéité 7. Pourtant, jusqu'à présent, la mécanique du biofilm ont été principalement examinés macroscopiquement. Par exemple, l'observation des banderoles de biofilm déformation due aux variations de taux d'écoulement de fluide 8,9, compression uniaxiale de pièces mécaniques de biofilm milieu d'agar ou cultivé sur le couvercle glisse 10,11, cisaillement du biofilm collecté de l'environnement, puis transféré à un parallèle rhéomètre à plaques 12,13, la spectroscopie de force atomique en utilisant une bille de verre et revêtu d'un biofilm bactérien fixé à un cantilever AFM 14 ou un micr dédiéocantilever méthode de mesure de la résistance à la traction de fragments de biofilm détachées 15,16 ont été mis en œuvre au cours des dix dernières années, fournissant des informations utiles sur la nature viscoélastique du matériau 17. Cependant, il semble probable que des informations sur des propriétés mécaniques du biofilm in situ est perdue lorsque le matériau est retiré de son environnement d'origine, ce qui est souvent le cas dans ces approches. En outre, le traitement du biofilm en tant que matériau homogène manque les informations sur l'éventuelle hétérogénéité des propriétés physiques au sein de la communauté. Par conséquent, la portée exacte de la mécanique de la structure de la formation de biofilm et des caractéristiques biologiques telles que les motifs d'expression du gène ou de gradients chimiques peuvent difficilement être reconnus. Pour progresser vers une description microscopique des propriétés physiques du biofilm, de nouveaux outils dédiés sont nécessaires.

Cet article détaille une approche originale conçue pour atteindrela mesure des paramètres mécaniques locales in situ, sans perturber le biofilm et permet le dessin de la répartition spatiale des propriétés du matériau à micro-échelle, puis l'hétérogénéité mécanique. Le principe de l'essai repose sur le dopage d'un film biologique en croissance avec des microparticules magnétiques suivie de leur chargement à distance en utilisant des pinces magnétiques dans le biofilm mature. déplacement des particules sous l'application de la force magnétique contrôlé imagé au microscope permet la dérivation de paramètre viscoélastique local, chaque particule de rapports de son propre environnement local. A partir de ces données, le profil 3D mécanique du biofilm peut être tirée, révélant état dépendances spatiales et environnementales. L'ensemble de l'expérience sera montrée ici sur un E. biofilm coli faite par une souche génétiquement modifiée portant un plasmide F-comme déréprimée. Les résultats détaillés dans un document récent 18 offrent une vision unique de l'intérieur de la mécanique du biofilm intactes.

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Protocole

1. Culture de bactéries et de préparation de Suspension

  1. Choisissez une colonie fraîchement cultivés à partir d'une plaque de gélose Lysogénie Broth (LB), inoculer dans 5 ml de milieu LB liquide contenant 100 μ g / ml d'ampicilline et 7,5 μ g / ml tétracycline et incuber pendant 5 à 6 heures à 37 ° C sur une plate-forme en secouant.
  2. Ensuite, ajouter 100 μ l de la culture bactérienne dans 5 ml de milieu minimum (M63B1) supplémenté avec 0,4% de glucose et les mêmes concentrations en antibiotique. Incuber cette nuit de culture fraîchement diluée à 37 ° C sur une table d'agitation.
  3. Après 16 heures d'incubation, ajouter 100 ul de la culture de la nuit à 5 ml M63B1, 0,4% de glucose. Garder le tube à 37 ° C à la plate-forme en secouant jusqu'à 0,5 OD est atteint. La suspension est alors prêt pour l'injection dans le canal d'essai pour la formation de biofilm.

2. Préparation de particules magnétiques

  1. Prenez 10 particules magnétiques ul -2,8 μ m de diamètre - dans le stock et les laver 3x dans 190 pi de milieu minimum à l'aide d'un porte-échantillon magnétique.
  2. Ajuster la concentration en particules de 5 x 10 6 / ml de perles. Typiquement, 50 pi de la solution de talon lavé est mélangé avec un autre 950 μ l de M63B1 avec 0,4% de glucose.

3. Préparation Manche et biofilm croissance

  1. Montage de la Manche
    1. Coupez deux carrés (800 μ m de longueur de côté) des capillaires en verre borosilicate 10 cm de long à obtenir deux 8 cm de long morceaux.
    2. Coller les deux éléments capillaires sur deux lames de verre coupées en deux - première - 2 cm de distance avec une cm-faux à chaque extrémité comme dans la figure 1 à l'aide d'une colle à base de cyanoacrylate à action rapide (appelé super-colle).
    3. Autoclave toute l'installation et le tube nécessaire requis pour obtenir une connexion de canal.
    4. Rassemblez tous les matériaux stériles sousune hotte à flux laminaire: i) le canal monté et piège 1, ii) les tubes et connecteurs, iii) les deux pièges à bulles - le filtre à bulles couramment utilisé pour sécuriser goutte-à-alimentation (le piège des enfants 1) et le piège à bulles fait maison comme un long tube de 4 cm de diamètre plus grand (piège 2), iv) des pinces, v) 30 ml seringues remplies de M63B1, 0,4% de glucose, et vi) le flacon à déchets.
    5. Connectez l'ensemble de l'installation avec connecteurs Luer Lock ou des carrefours dans l'ordre suivant: 50 ml M63B1 contrôlée par la pompe seringue, filtre à bulle pédiatrique, maison piège à bulles, capillaire (figure 1, partie B), et le tube de la bouteille de déchets seringue. Ensuite, remplissez le programme d'installation avec M63B1 stérile, 0,4% de glucose, tourner sur la pompe à seringue à un débit d'environ 10 ml / h, plus élevé que les taux expérimentales. Suivre attentivement et d'éliminer toutes les bulles dans le circuit.
    6. Débit moyen à travers le système pendant 10-15 min; simultanément mélanger 1 ml de la suspension de bactéries à DO 0,5 de la section1.3 avec 1 ml de la solution de billes lavé préparé dans la section 2.2.
    7. Attacher (mais ne pas fermer) pinces à la tubulure à deux positions: avant et après les capillaires. Mettez le flux hors tension.
    8. Introduire le mélange bactérien-perle dans le capillaire après le fait maison piège à bulles à l'aide d'une seringue de 1 ml, en prenant soin de tenir le tube se termine pour empêcher l'entrée d'air. Ré-attacher le tube et puis fermez les pinces.
    9. Répétez la même procédure pour le deuxième capillaire et de vérifier tous les tubes pour les bulles.
    10. Transférer le dispositif de microscope et la laisser reposer pendant 15 à 20 min pour permettre aux bactéries de se déposer et fixer sur la surface du capillaire. Installer le tube capillaire sur la platine du microscope avec le conteneur de déchets à un niveau légèrement supérieur. Placez la pompe de seringue sur le comptoir à côté du microscope. Élever le piège à bulles avant le capillaire légèrement plus élevé que le plan de capillaires pour capturer des bulles.
  2. Biofilm Growth
    1. Ajuster le débit de la pompe à seringue et démarrer l'écoulement, le biofilm va maintenant développer sur la surface du capillaire pendant la période nécessaire - en général de 24 ou 48 heures dans ces expériences.
    2. Focus sur le plan inférieur capillaire et commencer l'enregistrement time-lapse des exemples d'images - habituellement une fréquence d'acquisition de 2 images / min rendra compte de manière adéquate la croissance du biofilm. Ce moniteurs vidéo biofilm post-contrôle de la croissance (voir extraits en vidéos 1, 2 et 3).

4. Pinces magnétiques installation

  1. Visser les pinces magnétiques sur micromanipulateurs XYZ à commande manuelle et visser les micromanipulateurs sur la platine du microscope pour ajuster la position de la pince par rapport au capillaire. Placer la pince que sur la figure 2, pour assurer le gradient de champ magnétique approprié est généré dans la zone d'observation.
  2. Connectez les pinces to le générateur de fonction par l'intermédiaire de l'amplificateur de puissance pour générer une période de 40 secondes de temps en 24 sec de signal zéro et 16 sec de 4 A à courant continu avec un déclencheur envoyé au brillant obturateur de lumière de champ après 20 sec pour la synchronisation du signal fournissant une séquence de événements qu'à la figure 3.
    Remarque: Ces deux opérations peuvent être réalisées à tout moment entre l'installation capillaire et la mesure début. Voir expérimenter croquis aperçu dans la figure 4.

5. Acquisition courbe de fluage

  1. Utiliser la commande de déplacement xy de la platine du microscope à amener le bord du pôle magnétique gauche et le bord gauche de la capillarité dans le même champ d'observation. Prendre l'origine du référentiel analyse à l'intersection de x et y des axes définis par le bord du capillaire et le bord de la pièce polaire, respectivement (voir Figure 2).
  2. Ajustez la position verticale du capillaire à l'aide mise au point fine control bouton de la position du microscope. Plan généralement le premier examen est situé entre 4 à 7 μ m au-dessus du fond du capillaire. Vidéo 1 correspond au champ xy qui a son coin supérieur gauche à l'origine du référentiel spatial.
  3. Déclencher la séquence de 40 secondes d'événements décrits dans la section 4.2 et la figure 3 par la mise en marche du générateur de courant et dans le même temps, déclencher manuellement la séquence de la vidéo 1 d'acquisition d'image.
  4. Déplacez le capillaire au champ droit voisin par un μ m traduction 250 de la platine du microscope à gauche et à fonctionner comme dans la section 5.3 pour générer la vidéo 2 de la tranche 2 et ainsi de suite pour obtenir les vidéos nécessaires. En général 3 à 4 domaines de 250 x 250 μ m 2 sont collectées le long de l'axe x avant de changer le plan et en répétant les mêmes opérations pour le nouveau plan.

6. Calibration de travail

  1. Préparer une solution de glycérol en mélangeant 39,8 g de glycérol avec 190 μ l d'eau bi-distillée et 10 pi de particules magnétiques à une 2 x 10 9 particules / ml et remplir un canal expérimental avec ce mélange et le placer sur la platine du microscope comme décrit pour l'échantillon de biofilm.
  2. Après l'installation des pinces magnétiques comme indiqué dans l'article 4, appliquer la force magnétique, comme indiqué à la section 5.4 et faire des images en accéléré pour extraire la vitesse de chaque particule unique (v) et sa position dans le capillaire pour obtenir le fichier de calibration. Ce fichier doit contenir la force appliquée en fonction de sa position dans la zone d'analyse du capillaire conformément à la loi de Stokes, F = 6πRηv (R: rayon de la particule).

7. Analyse

  1. Utilisez un logiciel "particules traqueur" pour obtenir des fichiers de texte avec les positions de particules dans chaque trame pour toutes les piles d'images acquises, comme indiqué dans l'article 5. Using la fréquence d'acquisition d'image de la pile, de calculer le déplacement des particules en fonction du temps (par exemple de la figure 5 et vidéo 4).
  2. Utilisation du fichier d'étalonnage de la force, de convertir les courbes de déplacement à courbes de compliance (conformité totale de la matière - J (t) - en fonction du temps) selon la formule de la conformité:
    figure-protocol-1
    qui donne la relation entre la contrainte et la contrainte du matériau appliqué pour une particule de sonde de rayon R incorporé dans un milieu visco-élastique incompressible, homogène tel que précédemment établi par Schnurr et ses collaborateurs 19.
  3. Régler les courbes de compliance de fluage au modèle de Burgers général pour les matériaux viscoélastiques et d'en tirer les paramètres viscoélastiques, J 0, J 1, η 0, η 1 pour chaque particule ( La figure 6) selon la formule de la Burgers:
    figure-protocol-2
    Remarque: Cette analyse phénoménologique a déjà été utilisée pour une large gamme de matériaux, y compris les matériaux biologiques tels que les biofilms à interpréter les données de rhéologie macroscopiques 20-22.

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Résultats

Une analyse typique fournira la distribution spatiale des paramètres viscoélastiques à l'échelle du micron sur un biofilm vivant sans déranger son agencement d'origine. Des résultats typiques sont présentés dans la figure 7, où les valeurs de J 0 - la compliance élastique - sont donnés en fonction de l'axe z le long de la profondeur et de l'axe y le long d'une dimension latérale du biofilm. Chaque point correspond à un bourrelet dont l'analyse de la courbe de fluage a ...

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Discussion

Cette particule magnétique ensemencement et en tirant expérience in situ a permis la cartographie 3D des paramètres viscoélastiques d'un biofilm de plus en plus dans son état ​​d'origine en. Cette approche a révélé l'hétérogénéité de la mécanique E. coli biofilm cultivé ici et a donné des indices pour pointer les composants du biofilm soutenant les propriétés physiques du biofilm, ce qui suggère fortement une implication fondamentale de la matrice extracellulaire et plus précisémen...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à communiquer.

Remerciements

Ce travail a été supporté en partie par des subventions de l'Agence Nationale pour la Recherche, programme PIRIbio Dynabiofilm et de programme des risques interdisciplinaire CNRS. Nous remercions Philippe Thomen pour sa lecture critique du manuscrit et Christophe Beloin pour fournir l'E. coli, souche utilisée dans ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Table 1 : Réactifs et piles
Particules magnétiquesLife technologies14307DParticules magnétiques micrométriques, 2.8 µ ; m diamètre
Ampicilline (Antibiotique)Sigma-AldrichA9518
Tétracycline (Antibiotique)Sigma-Aldrich87128
Souche bactérienne MG1655gfpFUGB, Institut Pasteur, FranceProduit à sa surface des Pili F, résistants à l’Ampicillline et à la tétracycline.
Table 2 : Capillaires et tubulures
Filtres pour perfusion pédiatriqueProdimed-Plastimed6932002
Capillaires carrés creuxComposite Metal Scientific8280-100Fabriqué en verre borosilicate. Carré 0,8 mm x 0,8 mm
Tube peroxyde de siliconeVWR international228-0512Diamètre 1 mm
Tube peroxyde de siliconeVWR international228-0700Diamètre 3 mm
Tableau 3 : Croissance du biofilm
Bouillon de lysogénie (LB) solutionAmresco-VWRJ106-10PKMilieu standard utilisé pour la croissance des bactéries.
M63B1 SolutionFaitMilieu minimum standard utilisé pour la croissance des bactéries.
GlucoseSigma-AldrichG8270Utilisé pour fabriquer le milieu M63B1 avec 0,4 % de glucose.
Table 4 : Caméra électronique
EMCCD  ;   ;HamamatsuC9100-02
Contrôleur de chauffageInstruments de précision mondiale300354
Générateur de fonctionAgilent technologies33210A
Amplificateur de puissancefaitIl donne un signal de courant avec des amplitudes allant jusqu’à 4 A.
Pompes à seringueKd ScientificKDS-220
ShutterVincent AssociatesUniblitz T132
Pince à épiler magnétiqueFabricationDeux pôles électromagnétiques, chacun constitué d’une bobine de cuivre de 2 120 tours de fil de cuivre de 0,56 mm de diamètre et de noyaux en alliage magnétique doux (Supra50-Arcelor Mittal, France) de forme carrée selon le plan illustré dans Figure 10. Les deux noyaux sont montés sur le pôle nord face au pôle sud, afin de générer une force magnétique dans une direction sur toute la longueur du capillaire. Voir les détails du câblage de la bobine dans Figure 11.
Table 5 :
Microscope inversé  ;Objectif NikonTE-300
S Fluor x40 (NA 0.9, WD0.3)NikonIl s’agit d’un objectif à longue distance de travail permettant d’observer le biofilm en profondeur.
Filtres d’épifluorescence : 1) pour la fluorescence verte : Exc 480/20 nm ; DM 495 ; Em 510/20  ; 2) pour la fluorescence rouge : Exc 540/25 nm ; DM 565 ; Em 605/55Chroma1)#49020 2)#31002Le déplacement des particules lors de l’application de la force est enregistré à l’aide du bloc de filtre de fluorescence rouge.
Table 6 : Analyse d’images
ImageJNIH - plugin
maison maison maison de suivi de particules

Références

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