Des procédés pour la modulation et de l&#39;analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

Darius Widera; Janine Müller; Yvonne Imielski; Peter Heimann; Christian Kaltschmidt; Barbara Kaltschmidt

doi:10.3791/50870

Article de méthode

Des procédés pour la modulation et de l'analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

DOI :

10.3791/50870

⸱

13 février 2014

Darius Widera¹ , Janine Müller² , Yvonne Imielski² , Peter Heimann¹ , Christian Kaltschmidt¹ , Barbara Kaltschmidt²

¹Cell Biology, University of Bielefeld, ²Molecular Neurobiology, University of Bielefeld

Dans cet article

Résumé

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Des méthodes pour la manipulation et l'analyse des NF-kB-dépendante de l'hippocampe de la neurogenèse adulte sont décrits. Un protocole détaillé est présenté pour un test de comportement gyrus denté-dépendant (appelé le modèle spatial séparation Barnes labyrinthe) pour l'étude des résultats cognitifs chez la souris. Cette technique devrait également aider à permettre des enquêtes dans d'autres contextes expérimentaux.

Résumé

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L'hippocampe joue un rôle essentiel dans la formation et la consolidation de la mémoire épisodique, et dans l'orientation spatiale. Historiquement, l'hippocampe adulte a été considérée comme une région anatomique très statique du cerveau des mammifères. Cependant, des études récentes ont démontré que le gyrus denté de l'hippocampe est une zone de très grande plasticité chez les adultes, impliquant non seulement les modifications de circuits neuronaux existants, mais aussi la neurogenèse adulte. Cette plasticité est régulée par des réseaux complexes de transcription, dans lequel le facteur de transcription NF-kB joue un rôle de premier plan. Pour étudier et de manipuler la neurogenèse adulte, un modèle de souris transgénique pour l'inhibition neuronale spécifique du cerveau antérieur de l'activité de NF-kB peut être utilisé.

Dans cette étude, des méthodes sont décrites pour l'analyse de la neurogenèse NF-kB-dépendante, y compris ses aspects structuraux, et l'apoptose neuronale progénitrice, la prolifération et la signification cognitive, which a été spécifiquement évaluée par un gyrus denté (la DG) dépendant test de comportement, la répartition spatiale séparation Barnes labyrinthe (SPS-BM). Le protocole SPS-BM pourrait être simplement adaptée pour une utilisation avec d'autres modèles animaux transgéniques destinés à évaluer l'influence de certains gènes sur la neurogenèse hippocampique adulte. En outre, SPS-BM pourrait être utilisé dans d'autres contextes expérimentaux visant à étudier et manipuler l'apprentissage DG-dépendante, par exemple, l'utilisation d'agents pharmacologiques.

Introduction

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Ontologiquement, l'hippocampe est l'une des plus anciennes structures cérébrales anatomiques connues. Il est responsable de diverses tâches complexes, telles que les fonctions pivots dans la régulation de la mémoire à long terme, l'orientation spatiale, et la formation et la consolidation de la mémoire respective. Anatomiquement, l'hippocampe est constitué de couches de cellules pyramidales (stratum pyramidale), y compris la corne d'Ammon (CA1, CA2, CA3 et CA4) régions et le gyrus denté (gyrus dentatus), qui contient des cellules granulaires et quelques progéniteurs neuronaux dans sa zone sous-granulaire . Les cellules granulaire....

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Protocole

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Déclaration éthique

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les règlements de la commission des animaux et l'utilisation des soins gouvernementale, LANUV de l'état Rhénanie du Nord-Westphalie (Düsseldorf, Allemagne). Toutes les expériences animales ont été approuvés par LANUV, Düsseldorf sous le numéro de licence 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance et le nombre d'animaux requis pour l'étude.

Une. Protection des animaux et du Logement

Tous les animaux utilisés dans les protocoles décrits ici doivent être conservés d....

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Résultats

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Le croisement des IkB / - lignées de souris transgéniques et tTA mène à l'inhibition de l'activité de NF conditionnel-kB dans l'hippocampe.

Pour étudier l'expression de la IKBa-AA1-transgène dans la double transgénique souris (figure 1A), les cerveaux ont été isolés, cryosectioned et colorées en utilisant un anticorps contre la GFP (protéine fluorescente verte). La microscopie confocale à balayage laser a révélé une forte expression du transgène dans les rég.......

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Discussion

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Neurogenèse adulte, et la possibilité de sa manipulation par l'inhibition de NF-kB dans les neurones, et sa réactivation plus tard par la doxycycline, propose un système fascinant pour les enquêtes sur les nouveaux neurones dans le cerveau adulte, ainsi que dans des neurones de-et re-génération . La beauté de ce système est que le NF-kB voie de signalisation inhibition des neurones non seulement entraîne des changements dans la mort des cellules neuronales, la prolifération des progéniteurs et la migration, et les c.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflit d'intérêt.

Remerciements

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Nous remercions Angela Kralemann-Köhler pour un excellent soutien technique. Le travail expérimental décrit ici a été réalisée dans notre laboratoire et a été soutenu par des subventions du Conseil de recherches en allemand (DFG) à CK et BK et une subvention du ministère allemand de la Recherche et de l'Education (BMBF) à BK.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Moria MC17 Cuillère perforée ;	FST	10370-18	Enlèvement du cerveau Microscope
de dissection	Carl Zeiss	Stemi SV8	Enlèvement du cerveau
Ciseaux chirurgicaux ;	FST	14084-08	ablation de la cervelle
Ciseaux chirurgicaux ;	FST	14381-43	Epilation du cerveau
Pince Dumont #5	FST	11254-20	Eplation du cerveau
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	Lames pour l’immunohistochimie
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixateur
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	encastrement du cerveau
Blocage du sérum normal de chèvre	Jackson Immunolabs	005-000-001	dans l’IHC
Sérum de lapin normal	Jackson Immunolabs	011-000-001	dans l’IHC
Sérum d’âne normal	Jackson Immunolabs	017-000-001	Blocage de l’anticorps
anti-Neurofilament-M	IHC Études de développement Banque d’hybridomes	2H3	IHC, dilution 1:200
anti-Doublecortin ; anticorps	sc-8066	Santa Cruz	IHC, dilution 1:800
anticorps anti-GFP	Abcam	ab290	IHC, dilution 1:2 000
anticorps anti-BrdU	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, dilution 1:2,000 ;
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Détermination de la mort cellulaire neuronale
Désinfectant D08AG02 Bétadine	Mundipharma
Cryomicrotome	Leica	CM1900	Préparation de coupes de cerveau Sel
d’héparine sodique	Perfusion Sigma-Aldrich	H3393
Plaque circulaire en plastique dur (diamètre 120 cm)	en laboratoire	aucune	plaque pour SPS-BM, diamètre 120 cm
Désinfectant rapide Buraton ;	Schü ; lke Mayr	113 911
désinfectant Système de vidéo-suivi TSE VideoMot 2 avec progiciel VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	suivi et analyse du SPS-BM
Triton X-100 ;	Sigma Aldrich	T8787	perméabilisation/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	préparation de 40 µ ; m brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	intégration des lames
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Coloration nucléaire Granulés
alimentaires (Kellog’s Froot Loops)	Kellog’s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Évaluation statistique du logiciel SPS-BM
Zen 2008 ou Zen 2011	Carl Zeiss		Software (microscope confocal)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	support de montage pour la coloration au fluoro-jade C

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brai....

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Mots-clés

NF kappa B Adult Neurogenesis Spatial Pattern Separation Barnes Maze Confocal Microscopy Histological Analysis Transgenic Mice Dentate Gyrus Behavioral Testing Immunofluorescence Staining

Des procédés pour la modulation et de l'analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

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