Caenorhabditis elegan est un modèle utile pour explorer les fonctions d'acides gras polyinsaturés dans le développement et la physiologie. Ce protocole décrit une méthode efficace de compléter la C. elegans alimentation avec des acides gras polyinsaturés.
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Article de méthode
La supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les acides gras sont essentiels pour de nombreuses fonctions cellulaires. Ils servent molécules de stockage d'énergie efficaces, forment le noyau hydrophobe des membranes, et de participer à diverses voies de signalisation. Caenorhabditis elegans synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d'acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Ceci, combiné avec la simple anatomie et la gamme d'outils génétiques disponibles, en font un modèle intéressant pour étudier la fonction des acides gras. Afin d'étudier les voies génétiques qui assurent la médiation des effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons mis au point un procédé pour compléter l'C. alimentation elegans avec des acides gras insaturés. La supplémentation est un moyen efficace pour modifier la composition en acides gras de vers et peut également être utilisé pour sauver les défauts de mutants déficients en acides gras. Notre méthode utilise la croissance à moyen agar nématode (NGM) additionné de sels gras de acidsodium. Les acides gras présents dans les plaques deviennent incorporation complétéested dans les membranes de la source d'alimentation bactérienne, qui est ensuite reprise par le C. elegans qui se nourrissent de bactéries complétées. Nous décrivons également un protocole de Chromatographie en phase gazeuse pour contrôler les changements dans la composition d'acide gras qui se produisent dans les vers complétés. C'est un moyen efficace de compléter les régimes de grandes et de petites populations de C. elegans, permettant une gamme d'applications de cette méthode.
Introduction
Les acides gras sont des composants structurels essentiels des membranes ainsi que des molécules de stockage d'énergie efficace. En outre, les acides gras peuvent être clivés à partir de membranes cellulaires par des lipases et peuvent être modifiées par voie enzymatique pour produire des effecteurs de signalisation 1. D'origine naturelle des acides gras polyinsaturés (AGPI) contiennent deux ou plusieurs doubles liaisons cis. Les acides gras oméga-3 acides gras et les acides gras oméga-6 se distinguent l'une de l'autre sur la base des positions des doubles liaisons par rapport à l'extrémité méthyle de l'acide gras. Une alim....
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Protocole
Les acides gras polyinsaturés sont sensibles à la chaleur, la lumière et l'oxygène. Par conséquent, des précautions doivent être prises lors de la préparation de plaques de supplémentation d'acides gras tels que les acides gras ne sont pas exposés à une chaleur excessive et de la lumière. NGM support contenant 0,1% de Tergitol (NP-40) sont passés à l'autoclave et partiellement refroidies, après quoi les sels de sodium d'acides gras sont ajoutés sous agitation constante. Les plaques sont laissées à sécher à l'obscurité. L'absorption des acides gras par C. elegans cultivé sur ces plaques peut alors être surveillé par Chromatographie en ....
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Résultats
La supplémentation de la C. elegans alimentation est limitée par la capacité de la source d'alimentation à l'absorption de bactéries et d'incorporer des acides gras dans la membrane bactérienne. Pour déterminer la capacité de E. coli OP50 à assimiler différents acides gras dans ses membranes, OP50 a été plaqué sur des supports sans supplément, 0,1 mM et les concentrations mM 0,3 d'acide stéarique (18h00), l'oléate de sodium (18:1 n-9), et le sodium DGLA (20 : 3n-6). Les plaques ont .......
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Discussion
Ici, nous décrivons une méthode de supplémentation de C. elegans avec des acides gras insaturés alimentaires. Comme mentionné ci-dessus, il faut prendre soin dans la préparation de plaques PUFA supplémenté en raison de la nature réactive des doubles liaisons dans les acides gras polyinsaturés des causes de ces acides gras pour être sensible à l'oxydation par la chaleur et de la lumière 11. Pour éviter l'oxydation, il est important d'ajouter le PUFA dans le milieu de gélose de liquide aprè.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Nous remercions Chris Webster pour effectuer les expériences préliminaires de la figure 3 des résultats représentatifs et Jason Watts et Chris Webster des commentaires utiles sur le manuscrit. Le financement de cette étude a été fourni par une subvention des National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) à JLW. Certaines souches de nématodes utilisés dans ce travail ont été fournies par le Centre de Génétique Caenorhabditis, qui est financé par le Bureau NIH des programmes d'infrastructure de recherche (P40 de OD010440).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholestérol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL dans de l’éthanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Dihomogamma linolénate de sodium | NuCHEK | S-1143 | |
| Eau | Millipore stérile chaude | ||
| Eau stérile pour la collecte des | |||
| Eau sans nucléases pour solution mère DGLA | Ambion | AM9932 | |
| Ampicilline | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml dans l’eau (pour les plaques ARNi) |
| Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M dans l’eau (pour les plaques ARNi) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Méthanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophénylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Flacon en verre | Corning | 4980-2L | |
| Bouteilles en verre autoclavables avec agitateurs | Fisherbrand | FB-800 | |
| Cylindre gradué en verre autoclavable | Fisherbrand | 08-557 | |
| Plaque d’agitation | VWR | 97042-642 | |
| Bain-marie à 55+ ° ; C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Bouchon à vis Flacon en verre brun | Sun SRI | 200 494 | |
| gaz argon | |||
| Aide à la pipette automatisée | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Pipettes sérologiques stériles (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bec Bunsen | VWR | 89038-534 | |
| Microscope de dissection | Leica | ||
| Tube en verre silanisé | Thermo Scientific | STT-13100-S | pour la dérivation des EMAG |
| Bouchons à vis PTFE Kimble-Chase | 1493015D | ||
| Centrifugeuse de table clinique | IEC | ||
| GC Flacon à sertir | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Insert de flacon | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Bouchon de flacon | SUN SRi | 200 100 | |
| Chromatographe en phase gazeuse | Agilent | 7890A | |
| Détecteur de spectrométrie de masse | Agilent | 5975C | |
| Colonne pour chromatographie en phase gazeuse | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0,25 mm colonne capillaire en silice fondue |
Références
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary satu....
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Réimpressions et autorisations
