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Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

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DOI :

10.3791/50880

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18 novembre 2013

 , 
1Department of Medicine, University of Dresden, 2Center for Regerative Therapies Dresden

Dans cet article

Résumé

Les cellules souches neurales récoltés dans le cerveau adulte sont de plus en plus utilisés dans des applications allant de la recherche fondamentale du développement du système nerveux à l'exploration des applications cliniques potentielles en médecine régénérative. Cela rend le contrôle rigoureux des conditions d'isolement et de culture utilisés pour cultiver ces cellules essentielles au son des résultats expérimentaux.

Résumé

Des travaux récents montrent que le système nerveux central (SNC), la régénération et la tumorigenèse implique des populations de cellules souches (SC) résidant dans le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes de ces cellules normalement quiescentes emploient pour assurer le bon fonctionnement des réseaux de neurones, ainsi que leur rôle dans la récupération de blessures et d'atténuation des processus neurodégénératifs sont peu compris. Ces cellules se trouvent dans les régions appelées «niches» qui offrent un environnement maintien impliquant des signaux modulateurs à la fois le système vasculaire et le système immunitaire. L'isolement, l'entretien et la différenciation des CS CNS dans des conditions de culture définies qui excluent facteurs inconnus, qui les rend accessibles à un traitement par des moyens pharmacologiques ou génétiques, fournissant ainsi un aperçu de leur comportement in vivo. Nous vous proposons ici des informations détaillées sur les méthodes pour générer des cultures de Centres de SNC régions distinctes du cerveau adulte et approches pour évaluer leur dpotentiel de ifferentiation dans les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et in vitro. Cette technique donne une population cellulaire homogène d'une culture en monocouche qui peut être visualisée à étudier SC individuel et leur descendance. En outre, il peut être appliqué sur différents systèmes de modèles animaux et des échantillons cliniques, utilisé précédemment pour prédire des réactions de régénération dans le système nerveux adulte endommagé.

Introduction

Le dogme central de la neurobiologie, prévue par les observations fondamentales de la cytoarchitecture de cerveau fait par Ramón Y. Cajal il ya plus d'un siècle, a estimé que la neurogenèse est peu probable après l'adolescence étant donné la complexité des réseaux de neurones présents dans le système nerveux central 1. Malgré les travaux de Altman dans les années 1960, et plus tard Kaplan, ce qui démontre que la 3H-thymidine pourrait être trouvée dans les neurones matures indiquant que, en fait, les neurones ont été générés dans des zones distinctes du cerveau adulte, le dogme a continué à tenir deux, trois. La preuve a continué à monter avec la recherche de Nottebohm décrivant les changements saisonniers dans le nombre de neurones présents dans le cerveau des oiseaux chanteurs 4. Ce n'était pas jusqu'en 1999, quand Gould et al travail. Publié sur la génération de neurones dans l'hippocampe augmente avec l'exécution des tâches d'apprentissage associatif chez le rat, ainsi que les observations de Kornack et Rakic ​​démonstrationTing a continué la neurogenèse chez le macaque adulte que le concept d'un cerveau moins rigide, plus plastique, a été reconnu 5, 6.

La recherche de la source cellulaire de ces neurones générés de novo conduit à la découverte d'une population distincte de cellules souches (CS) qui résident dans les zones du cerveau appelée niches 7. La zone sous-ventriculaire et la zone granulaire sous de l'hippocampe sont considérés comme les deux principales régions neurogènes 8,9. Cellules isolées à partir de ces endroits présentent la caractéristique classique de CS dérivés embryonnaires ou fœtales, l'auto-renouvellement et potentiel de différenciation. Dans le cas des cellules souches neurales (NSC), ils peuvent être différenciées en neurones, astrocytes et oligodendrocytes,. En outre, ces SCs tache positive pour les marqueurs du CNS tels que la foetales intermédiaire nestine de protéine de filament 10. Des travaux plus récents souligne que les conseils sectoriels pourraient ne pas se limiter à ces Two domaines, et sont en fait localisée dans le cerveau comme une population en grande partie de repos de cellules étroitement associés à la vascularisation 11.

Les observations que les CS sont mobilisés en réponse à une blessure suggère la possibilité d'être en mesure d'utiliser ces cellules à des fins de régénération pour aider à la récupération de maladie neurodégénérative et course 12, 13. Cela n'est pas sans rappeler le rôle que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent dans la cicatrisation des tissus conjonctifs, qui sont présents sous forme de cellules périvasculaires qui ont le potentiel de devenir des ostéoblastes, les chondrocytes, les cellules adipeuses et 14. Cependant, les CNS ne peuvent être récoltées de la même manière que les cellules souches mésenchymateuses à partir de la moelle osseuse par aspiration de routine et les techniques de centrifugation à gradient de densité et par la suite utilisées dans les thérapies à base de cellules autologues. En conséquence, d'autres sources de cellules, telles que l'utilisation de NNC foetales ou des précurseurs neuronaux issus de embcellules souches ryonic ont été largement explorée dans la maladie de modèles animaux et de blessures avec différents degrés de succès 15. Technologies de cellules souches pluripotentes induites utilisant des sources de cellules somatiques offrent un autre moyen potentiel pour produire des thérapies à base de cellules thérapeutiquement utiles pour un large éventail d'applications, en surmontant la disponibilité limitée et des préoccupations éthiques concernant l'utilisation des cellules embryonnaires et les tissus fœtaux 16. Cependant, la traduction clinique de ces résultats s'est avéré être une tâche difficile, comme l'a démontré dans les luttes de traitement de divers troubles neurologiques avec thérapeutiques à base SC approches 17,18, ainsi que d'un chemin tortueux à l'autorisation réglementaire. Comme une approche alternative, l'introduction de traitements pharmacologiques spécifiques peut moduler le nombre de CSN et de faciliter la récupération dans les modèles de la maladie de Parkinson et les AVC 19. Quelle que soit la stratégie pourrait être, de comprendre comment manipuler efficacement ces cellulesexige un système in vitro accessible.

Cultures du CNS peuvent être réalisés soit sous forme de cultures globales, aussi appelées neurosphères, ou comme une monocouche 8,20. Les deux techniques ont été largement utilisés, ce qui permet l'établissement de conditions de culture définies, à savoir l'utilisation de facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) en tant que source de mitogène, qui assurent l'expansion de précurseurs multipotentes. Bien que les cultures de neurosphères peuvent être mieux adaptés à l'étude de la capacité de propagation clonale d'un type de cellule isolée, le système a été montré pour produire une population mixte de cellules lors de la détente 21. En outre, la structure fermée de neurosphères rend la manipulation pharmacologique des cellules peu pratique, et l'interprétation de l'influence de ces facteurs peuvent avoir pourrait être confondue en raison du microenvironnement établi dans la neurosphère lui-même. Des cultures monocouches, d'autre part, peuvent êtreutilisé dans les écrans à haut débit de banques de petites molécules, en fournissant un outil puissant pour explorer les mécanismes de transduction du signal qui régulent la croissance et la différenciation SC et ouvre la possibilité de découvrir de nouveaux composés qui ciblent spécifiquement cette population de cellules.

En conséquence, la capacité de générer de manière reproductible des cultures de NNC adultes provenant de différentes régions d'intérêt dans le cerveau peut être utilisée dans un large éventail d'applications de recherche, allant d'études sur le développement du système nerveux central (SNC) à explorer de nouvelles approches de la médecine régénérative . Le protocole présenté ici montre comment disséquer et évaluer le potentiel de différenciation de SNC Centres isolés du cerveau de rongeur adulte.

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Protocole

Le travail adhère à la Déclaration de Helsinski et l'état des animaux ARVO. Les animaux ont été utilisés pour la collecte des tissus et toutes les méthodes pertinentes ont été suivies selon les instructions de l'animalerie de l'Université de Dresde. Les animaux ont été manipulés et logés selon les lignes directrices fédérales allemandes pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire, et l'étude a été approuvé par le Landesdirektion Dresde. S'il vous plaît consulter la politique vétérinaire de votre établissement (IACUC ou autre conseil) en ce qui concerne la méthodologie de l'euthanasie approprié.

Concentrations de travail de réactifs actions spécifiques et peuvent être trouvés dans les tableaux accompagnant ce protocole réactif.

Une. Culture vaisselle Préparation

  1. Manteau de plats avec un volume suffisant de 75 pg / ml de poly-L-ornithine (soit 2 ml / puits d'une plaque à 6 puits) pendant une nuit dans l'incubateur de culture de cellules 2 jours avant la date prévue de dissection.
  2. Aspirer le poly-L-ornithine le jour et laver chaque puits 2x avec 3 ml de PBS pendant 5 min suivant.
  3. Retirez le lavage final, puis ajouter la fibronectine (dilué 1:250, 4 ug / ml dans PBS) à la plaque et placez les plats dans l'incubateur pendant la nuit.
  4. Aspirer la fibronectine, le jour de la dissection et de lavage des plats 2x avec du PBS. Remettre les plaques contenant encore la finale PBS laver à l'incubateur jusqu'à ce que le tissu dissocié est prêt pour la culture. À ce moment, retirer la PBS avant l'étalement du tissu.
  5. plaques de magasins recouvertes de poly-L-ornithinein l'incubateur pendant jusqu'à 3 semaines. Des plaques recouvertes de fibronectine peuvent être stockées pendant 1 semaine. revêtement de fibronectine peut être fait en aussi peu que 2 heures si urgent. La fibronectine est sensible à la dénaturation, ne pas agiter la solution ou laissez sécher la vaisselle.

2. Dissection / placage

  1. Ce protocole s'applique à l'utilisation de trois rats adultes (3-6 mois d'âge).
  2. Chill le cerveau sectionnement bloc sur la glace avant l'euthanasie chez le rat.
  3. Placer un tube Falcon de 15 ml contenant 5 ml de milieu N2 avec bFGF ajouté sur de la glace.
  4. Euthanasier les rats conformément à la politique vétérinaire de votre institution.
  5. Retirer le cerveau du crâne en faisant une incision de la ligne médiane vers le bas de la tête. Utilisez une pince à décoller de l'os permettant au cerveau pour être soigneusement extrait.
  6. Placez le cerveau dans une boîte de 10 cm de Pétri contenant glacée PBS. Cela permettra d'éliminer tous les poils résiduelle et le sang. (Figure 1A)
  7. Placer le cerveau dans le bloc de sectionnement réfrigérés. (Figure 1B)
  8. Insérez une nouvelle lame de rasoir propre dans le bloc comme illustré à la figure 1C.
  9. Insérer un second mm caudal rasoir propre pale 3 à la première, comme illustré sur la figure 1D.
  10. Soulevez délicatement les lames du bloc, emportant avec eux la section d'intérêt.
  11. Faire flotter le section de la lame en l'immergeant dans du PBS. (Figure 1E)
  12. tissu de récolte de la zone d'intérêt (dans cet exemple, nous avons utilisé la commissure antérieure, (antérieure) ACA, figure 1F) en utilisant # 5 forceps et recueillir dans un tube conique de 15 ml contenant 1 ml de milieu N2 contenant bFGF.
  13. Déplacer le tube dans une hotte de culture de cellules à flux laminaire, en continuant le reste du protocole en conditions stériles.
  14. Mécaniquement dissocier le tissu à l'aide d'une pipette de 1 ml attaché à une pipette P1000. Introduire à la pipette de haut en bas plusieurs fois (environ 20 fois à raison de 1 cycle de pipetage par seconde) tout en appuyant sur ​​l'ouverture de la pointe de la pipette contre le fond du tube conique (figures 1G 1-3). Arrêtez trituration quand la solution devient homogène.
  15. Laisser reposer la solution pendant 2 minutes pour permettre à tout le tissu non dissociée plus grande à se déposer au fond. (Figure 1G 4)
  16. Recueillir le homogeneous surnageant et le placer dans un tube conique contenant 8,5 ml de milieu N2 plus 20 ng ml de bFGF /, 500 ng ml Dll4 /, 500 ng / ml Ang2, et 200 nMJAK inhibiteur.
  17. Plate-les dans 3 puits d'une plaque à 6 puits à l'aide de 3 ml de solution cellulaire diluée / puits.
  18. Placer la plaque dans un incubateur humidifié de cellules à 37 ° C, 5% de CO 2, 5% d'O 2.

3. Entretien quotidien

  1. Remplacez le support sur les boîtes de culture avec N2 milieu contenant bFGF, Ang2, Dll4, et JAK inhibiteur 24 heures après placage.
  2. Ajouter un bolus de bFGF, Dll4, Ang2, et l'inhibiteur de JAK le jour suivant.
  3. Continuez ce processus alternatif de changements des médias et des ajouts de facteurs pour un total de 10-14 jours.

4. L'induction de la différenciation

  1. Retirer bFGF, Dll4, Ang2, et JAK inhibiteur contenant du milieu et de le remplacer par un milieu N2 qui ne contient pas de facteurs supplémentaires.
  2. Changez le milieu tous les deux jours.
  3. Fixer les cellules après 10 jours et d'effectuer immunocytochimie.

5. Détection immunocytochimique

  1. Aspirer le milieu et fixer des plaques de culture de cellules avec 2 ml de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min.
  2. Laver 2 fois avec 3 ml de PBS pendant 5 min chacun.
  3. Aspirer le PBS, puis bloquer et perméabiliser les cellules par addition de 2 ml de PBS contenant 5% de sérum normal d'âne (NDS) et 0,1% de Triton X-100 pendant 20 min.
  4. Préparer le mélange d'anticorps primaire dans du PBS contenant 5% de NDS. Anticorps anti-nestine peut être utilisé pour identifier SC, tandis que Tuj1 (classe III β-tubuline), anticorps GFAP, et CNPase peut être utilisé pour un triple coloration de marqueurs de différenciation.
  5. Aspirer la solution de blocage et ajouter 1,5 ml du mélange d'anticorps primaire à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 90 min.
  6. Retirez les anticorps primaires et laver 2 fois avec 3 ml de PBS, et 1x avec 3 ml de PBS contenant 5% de NDS pour 5 min chacun.
  7. Prepare les anticorps secondaire dans du PBS contenant 5% de NDS.
  8. Aspirer le lavage final et ajouter 1,5 ml de solution d'anticorps secondaire dans chaque puits. Incuber dans l'obscurité pendant 40 min à température ambiante.
  9. Retirer la solution d'anticorps secondaire et ajouter 2 ml d'une tache DAPI fraîchement préparé (500 ng / ml dans du PBS). Incuber pendant 3 min.
  10. Aspirer la solution DAPI puis laver 3 fois avec 3 ml de PBS pendant 5 min chacun. Les cellules peuvent maintenant être visualisées avec un microscope à fluorescence.

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Résultats

L'identification de la région d'intérêt à partir de laquelle la récolte de cellules souches neurales est la première étape critique et définir la quantité de temps qu'il faut pour obtenir une plaque de cellules confluentes. Par exemple, la SVZ est une région neurogène classique et a une proportion relativement plus élevée de cellules souches neurales donc. Cependant, la technique présentée ici peut être utilisé avec d'autres régions pas souvent reconnus comme ayant un potentiel neurogène robuste à l'...

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Discussion

Un grand nombre des étapes critiques de l'isolement, de l'expansion et la différenciation des cellules souches neuronales du cerveau adulte sont partagées en commun par des techniques de culture tissulaire standard. L'objectif de garder à l'esprit est que les CNS isolés du cerveau adulte devrait maintenir le plus grand nombre de leurs caractéristiques in vivo que possible (Figure 2J). Souvent un équilibre entre la prudence nécessaire et la vitesse appropriée doit être trouvé. Un...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à communiquer.

Remerciements

Ce travail a été financé (en partie) par le Helmholtz Alliance ICEMED - imagerie et le traitement des maladies métaboliques de l'environnement, à travers le Fonds de l'Initiative et le Réseau de l'Association Helmholtz, une subvention de la Fondation Else Kroener-Fresenius, et une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: Les cellules dans les tissus).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîtes de culture tissulaire à 6 puitsBD Biosciences353934
Poly-L-ornithineSigma-AldrichP-3655

5 mg/ml solution mère préparée dans de l’eau doublement distillée (Stable pendant plusieurs mois à -20 ° ; C).

Concentration de travail 0,5 mg/ml dans l’eau (Stable pendant 1 mois à 4 ° ; C).

FibronectineR& D Systems1030-FnNe pas agiter la solution mère
Appareil de filtrationCorning Life Sciences430769
DMEM/F-12Mediatech10-090-CVVoir la remarque ci-dessous pour la préparation complète du milieu N2
Apo-transferrineSigma-AldrichT-2036
InsulineSigma-AldrichI-0516
PutrescineSigma-AldrichP-57801 M solution mère en ddH2O (stable à 20 ° ; C pour 6 mois)
Sélénite de sodiumSigma-AldrichS-5261500 µ ; M solution mère dans ddH2O (stable à -20 ° ; C pendant 6 mois)
ProgestéroneSigma-AldrichP-8783100 & micro ; M solution mère dans l’éthanol (stable à -20° ; C pendant 6 mois)
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15140-122
Saline tamponnée au phosphateMediatech21-040-CV
Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF)R& D Systems233-FBConcentration de travail 20 ng/ml  ;
Delta4 (Dll4)R& D Systems1389-D4Concentration de travail 500 ng/ml
Angiopoétine 2 (Ang2)R& D Systems623-ANConcentration de travail 500 ng/ml
InhibiteurJAK Calbiochem420099Concentration de travail 200 nM  ;
Sérum bovin AlbumineSigma-AldrichA-2058
Tubes coniques de 15 et 50 mlCorning LifeSciences 430053, 430829
Les autres articles nécessaires comprennent : Instruments de dissection générale, y compris une lame de rasoir et une pince, Rat adulte (3-6 mois ; Sprague-Dawley ou Long Evans), chambre d’intoxication au CO2, hotte à flux laminaire pour la culture cellulaire et incubateur Incubateur (humidifié, 37 ° ; C, 5 % CO2, 5 % O2). Remarque : Pour une préparation complète du milieu N2, ajoutez à un flacon de DMEM/F-12 (500 ml) 0,05 g d’apotransférine, 0,0125 g d’insuline (fraîchement prédissoute dans 1 ml de 10 mM de NaOH), 50 &mu ; l de putrescine, 30 &mu ; l de sélénite de sodium, 100 &mu ; l de stocks de progestérone et 5 ml de solution de pénicilline/streptomycine. Ajustez le pH à 7,2, si nécessaire. Filtrer-stériliser et stocker à 4 ° ; C jusqu’à 3 semaines et protéger de la lumière.
Immunofluorescence Table
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15719
Sérum d’âne normal (NDS)Sigma-AldrichD-9663
Triton X-100Sigma-AldrichT-8787
4,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)Sigma-AldrichD-84175 mg/ml stock solution dans le méthanol
Table d’anticorps primaires
NestinChemiconMAB353

Facteur de dilution : 1:400

Espèce : Souris IgG1

Hes3Santa Cruzsc-25393

Facteur de dilution : 1:100

Espèce : IgG de lapin

Sox2R& D SystemsMAB2018

Facteur de dilution : 1:100

Espèce : Souris IgG2a

CNPaseChemiconMAB326

Facteur de dilution : 1:200

Espèce : Souris IgG1

&beta ;-tubuline III (TUJ1)R& D SystemsMAB1195

Facteur de dilution : 1:500

Espèce : Souris IgG2a

Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP)Dako North AmericaZ0334

Facteur de dilution 1:500

Espèce : Lapin

Table d’anticorps secondaires
Alexa  ;   ; 568InvitrogenA-21124

Facteur de dilution : 1:200

Espèce : Chèvre anti souris IgG1

Alexa 488InvitrogenA-21131

Facteur de dilution : 1:200

Espèce : Chèvre anti souris IgG2a

Cy5Jackson ImmunoResearch59883

Facteur de dilution : 1:200

Espèce : Chèvre anti Lapin

de

Références

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Mots-clés

Cerveau adulteculture cellulairepotentiel de diff renciationculture en monocouchedissociation tissulairepoly L ornithinerev tement la fibronectinesuppl mentation en FGFmarqueurs de cellules souches

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