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Article de méthode

Évaluation échocardiographique du cœur droit chez la souris

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DOI :

10.3791/50912

⸱

27 novembre 2013

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Pulmonary and Critical Care Medicine, Vanderbilt University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit un protocole pour l'évaluation échocardiographique de la taille du ventricule droit et l'hypertension pulmonaire chez la souris. Les applications comprennent la détermination du phénotype et évaluation de série en modèles transgéniques et de souris induite par la toxine de myocardiopathie et une maladie vasculaire pulmonaire.

Résumé

Modèles transgéniques et toxiques de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) sont largement utilisés pour étudier la physiopathologie de l'HTAP et d'enquêter sur des traitements potentiels. Étant donné le coût et le temps nécessaires à la création de modèles animaux de la maladie, il est essentiel que les chercheurs disposent d'outils pour évaluer avec précision l'expression phénotypique de la maladie. Dysfonction ventriculaire droite est la principale manifestation de l'hypertension pulmonaire. L'échocardiographie est le pilier de l'évaluation non invasive de la fonction ventriculaire droite dans les modèles de rongeurs et a l'avantage de la traduction claire à l'homme en qui le même outil est utilisé. Protocoles d'échocardiographie publiés dans des modèles murins de HAP font défaut.

Dans cet article, nous décrivons un protocole d'évaluation RV et la fonction vasculaire pulmonaire dans un modèle de souris de l'HTAP avec une mutation dominante négative BMPRII, mais ce protocole est applicable à toutes les maladies affectant le système vasculaire pulmonaire ou cardiaque droite. Nousfournir une description détaillée de la préparation de l'animal, l'acquisition des images et le calcul hémodynamique du volume systolique, débit cardiaque et une estimation de la pression artérielle pulmonaire.

Introduction

Pression pulmonaire élevée et du ventricule droit (RV) de dysfonctionnement sont les maîtres mots de la maladie vasculaire pulmonaire dans des modèles animaux et des patients humains atteints d'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Transgénique et toxiques modèles (par exemple monocrotaline ou hypoxie) de HAP sont largement utilisés pour étudier la physiopathologie de l'HTAP et d'enquêter sur des traitements potentiels. Étant donné le coût et le temps nécessaires à la création de modèles animaux de la maladie, il est essentiel que les chercheurs disposent d'outils pour évaluer avec précision l'expression phénotypique de la maladie.

L'échocardiographie est le pilier de l'évaluation non invasive de la fonction ventriculaire chez les rongeurs 1,2. L'échocardiographie a l'avantage de traduction claire à l'homme en qui le même outil est utilisé. En outre, certains modèles génétiques présentent une pénétrance incomplète 3; la capacité d'identifier de façon non invasive les animaux atteints de gagner du temps et des ressources précieuses. Évaluation non invasive de diseasoi gravité sans sacrifier un animal permet également aux chercheurs d'étudier en série les effets des thérapies enquête. Ceci est particulièrement important compte tenu de la rapidité avec laquelle les thérapies traductionnelles peuvent progresser à des essais humains 4,5.

Chez les humains, l'évaluation échocardiographique de la taille de RV et l'hypertension artérielle pulmonaire est particulièrement difficile en raison de la position rétrosternale et la forme irrégulière de la RV 6. modèles de rongeurs ont des défis supplémentaires de petite taille et le rythme cardiaque extrêmement rapide (300-700 battements / min). Les progrès récents, y compris des taux de trame plus élevés et les plus petits capteurs ont une meilleure qualité d'image et l'imagerie conscient même permis dans certains protocoles expérimentaux, mais la plupart d'imagerie de rongeur se fait sous anesthésie 7,8. Excellents protocoles expérimentaux de l'échocardiographie dans les modèles de rats de HAP ont été décrites et validées à l'IRM et l'hémodynamique invasives 1,9. Cependant, l'échocardiographie publiéprotocoles dans des modèles murins de HAP font défaut.

Dans cet article, nous décrivons un protocole d'évaluation RV et la fonction vasculaire pulmonaire dans un modèle de souris de l'HTAP avec une mutation BMPRII dominant négatif et un modèle de isolé RV post-charge après cerclage de l'artère pulmonaire, mais ce protocole est applicable à toutes les maladies affectant la vasculaire pulmonaire ou cardiaque droite. Nous allons décrire la préparation de l'animal et de l'évaluation détaillée de la taille de RV et de la fonction ainsi que artère pulmonaire principale (PA) de taille. Nous démontrons également les techniques et les calculs nécessaires pour estimer le volume systolique et le débit cardiaque. Limitations techniques empêchent estimations Doppler précis de la pression pulmonaire, mais nous avons appliqué un substitut bien-validé, l'artère pulmonaire temps d'accélération, pour estimer la pression PA.

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Protocole

Une. Préparation de l'équipement

  1. Examiner le transducteur ultrasonore de défauts. En fonction de l'équipement utilisé, cette étape peut ne pas être nécessaire.
    1. Si une bulle d'air est observée, enlever la vis située sur le côté droit de la tête de capteur, et ajouter de l'eau stérile à travers le trou d'une aiguille 26 G. Les bulles d'air à l'intérieur de la tête de transducteur sont communs. Ils empêcher l'acquisition d'images de qualité.
    2. Vérifiez la membrane qui recouvre la sonde de fuites ou de trous. Remplacer si nécessaire.
  2. Ouvrez le logiciel et initialiser la sonde.
    1. Choisissez le forfait cardiaque à partir du menu déroulant, avec le capteur approprié. Cliquez sur "initialiser". Utilisez une sonde 20-60 MHz pour les souris de moins de 35 g et une sonde 15-45 MHz pour les souris de plus de 35 g.
    2. Sélectionnez l'opérateur, l'animal et la date sur l'écran de la démographie, et sélectionnez "Démarrer".

2. Souris Preparation Y compris l'anesthésie, Épilation, et positionnement

  1. Anesthésie: Placez la souris dans une chambre d'induction et anesthésier avec, dessus de table machine d'anesthésie portable contenant un vaporisateur isoflurane et un récipient de gaz d'échappement.
    1. Régler le vaporisateur à 3% avec un débit de 3 l / min de débit d'oxygène. Ce taux d'anesthésie relativement élevée est utilisé pour obtenir un effet anesthésique rapide et donc de minimiser la réponse au stress qui peuvent influer sur la fonction cardiaque. La courte durée du protocole minimise tout risque potentiel pour l'animal. Il est très important de toujours garder le taux d'anesthésie même. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation exclusive de l'isoflurane comme l'anesthésie, donc des conditions optimales pour les autres agents peuvent varier de ce protocole. Une faible profondeur de l'anesthésie peut être choisi en fonction des besoins expérimentaux, mais une fois un protocole d'anesthésie est établi, il ne doit pas être modifié. Anesthésie affecte le rythme cardiaque et Other des mesures hémodynamiques. Par conséquent, si la profondeur de l'anesthésie est changé au cours d'une expérience, les données peuvent ne pas être utiles pour les analyses. Si plusieurs souris sont à imager en un jour, anesthésier séparément.
    2. Surveillance de la température ambiante afin de s'assurer qu'elle est identique entre les groupes expérimentaux. La température ambiante peut affecter vasoréactivité, même lorsque la souris est sur une table chauffée, donc il doit être surveillé et gardé la même entre les groupes expérimentaux qui seront comparés. Bien que ce protocole ne permet pas de mesurer la température de l'animal directement ambiante et la table température constante assure qu'il ya peu de variation de température entre les groupes expérimentaux.
  2. Epilation: Enlever les poils de la poitrine avec une crème dépilatoire après que la souris est anesthésiée. Commencer l'application avec un coton-tige, les clavicules, et continuera à juste au-dessous du diaphragme.
    1. Placer la souris en arrière dans la chambre de l'anesthésie pendant 1 minpour permettre à l'épilation au travail. Pour déterminer si l'anesthésie est efficace, appuyez fermement sur l'ongle du pouce contre l'une des pattes de la souris. S'il n'y a pas de retrait, l'anesthésie est suffisante. Si le membre se retire, placer la souris dans le dos de la chambre de l'anesthésie pendant une minute.
    2. Appliquez une petite quantité de lubrifiant pommade pour les yeux de la souris pour éviter d'endommager la cornée.
    3. Enlever les poils de la poitrine avec un 2 x 2 dans un tampon de gaze. Le produit chimique utilisé dans la crème dépilatoire est caustique, et nuira à la peau si elle est laissée trop longtemps, donc il faut prendre soin de retirer tous les produits de la peau.
    4. Appliquez une crème hydratante de la peau après le retrait de cheveux.
  3. Positionnement: Placez la souris dans une position ventro-dorsale sur une table chauffée, installée à 37 ° C. Le positionnement correct est impératif de l'acquisition d'images de qualité. Utilisez une table qui peut capturer la température du corps, la respiration et le rythme cardiaque. Utilisation d'un système de rail intégré toutux pour un positionnement précis et par la suite, optimisation de l'image.
    1. Ruban adhésif doucement les quatre pattes et appliquer une quantité de taille dime de gel de transduction de la poitrine.

3. Acquisition des images: Imagerie en parasternale long axe Voir

  1. Verrouiller le transducteur à ultrasons en place à l'intérieur du montage sur le système ferroviaire, et le faire tourner de 10 ° vers la gauche, de sorte que la sonde métallique du transducteur est positionné directement au-dessus du cœur. Plus précisément, la sonde doit être sur le côté gauche de la poitrine, dans le 2ème ou 3ème espace intercostal, et latérale au sternum.
    1. Manipuler les x et y des axes situés sur le système ferroviaire, jusqu'à ce que le point de vue correct est obtenu.
    2. Sélectionnez "Mode B". Il se trouve dans la partie supérieure droite de la console système, afin de projeter une image 2D en direct.
    3. Voir les structures anatomiques suivantes sur l'écran:
      1. L'ensemble du coeur de sommet à Aorta - Le sommet sera visualisé à l'extrême gauche de l'écran, et l'aorte à l'extrême droite.
      2. La lumière du ventricule gauche (LV)
      3. paroi postérieure du ventricule gauche (LPW)
      4. Septum interventriculaire (IVS)
      5. La lumière du ventricule droit (VD)
      6. Antérieures et postérieures feuillets de la valve mitrale (AML et PML)
      7. Aorte ascendante (AO)
      8. Oreillette gauche (LA)
  2. Obtenir une mesure diamétrale de l'aorte dans cette vue en appuyant sur le bouton de numérisation / de gel de "geler" l'image. Ensuite, utilisez la souris pour tirer en arrière à travers la boucle vidéo au bas de l'image jusqu'à ce que le ventricule gauche est en systole et l'aorte est à son plus grand diamètre.
    1. Cliquez sur l'outil de mesure dans le coin supérieur gauche de l'écran et sélectionnez l'icône qui ressemble à une ligne diagonale. Cliquez à gauche sur votre souris et tracer une ligne droite à partir de la partie antérieure de la paroi postérieure de l'aorte, perpendicular à son axe long. Enregistrer en appuyant sur le bouton "Cadre de magasin".
    2. Créer une vidéo en boucle en appuyant sur "Cine Store"

. 4 Acquisition d'Images: Imagerie en parasternale petit axe Voir

  1. Repositionner le capteur aux positions 3 et 9 heures (transversales). Angle légèrement caudale en manipulant le transducteur de montage pour obtenir la meilleure vue de l'aorte et lumière BT. La sonde métallique sera positionné horizontalement et directement sur le sternum.
    1. Manipuler les x et y des axes sur le système de rail jusqu'à ce que le point de vue correct est obtenu. La lumière BT seront considérés, avec les muscles papillaires antérolatérale et postéro, qui sont visibles sur la droite de l'écran. C'est le point de référence pour l'axe court, indiquant la partie médiane du ventricule gauche, Où les mesures de dimension sont faites. S'écartant légèrement du point de référence avec les x et y axes d'apporter différentes structures anatomiques en vue sera nécessaire, mais le positionnement est expliqué par référence à la vue ci-dessus.
  2. Obtenir les mesures suivantes dans la vue petit axe:
    1. mode B
      1. Deux mesures diamétrales plus de l'aorte.
      2. Trois mesures de la voie d'éjection pulmonaire.
    2. Pulsé mode Doppler (PW)
      1. Trois mesures intégrales de temps de vitesse (VTI) de l'aorte
      2. Trois mesures VTI de l'artère pulmonaire mesurée juste en amont de la valve pulmonaire.
      3. Mesurer l'artère pulmonaire temps d'accélération en traçant la courbe VTI depuis le début de la circulation sanguine à vitesse maximale.
    3. mode M
      1. Trois mesures du diamètre interne du ventricule gauche en diastole (LVIDd)
      2. Trois mesures du diamètre interne du ventricule gauche en systole (LVIDs)
      3. Trois mesures du diamètre interne du ventricule droit (RVID). La lumière de RV ne seront visibles que dans cette vue si elle est dilatée.
      4. Mesurer la fréquence cardiaque à l'aide de trois fois en mode M en traçant la distance entre deux pics diastolique de la paroi antérieure de la LV pendant trois cycles cardiaques différents.
  3. Mode B mesures:
    1. Manipuler l'axe Y céphalique du point de vue de muscle papillaire, jusqu'à ce que la valve semi-lunaire de l'aorte est au point.
    2. Obtenir des mesures de l'aorte juste au-dessus de la vanne au plus grand diamètre.
    3. Cliquez sur l'outil de mesure dans le coin supérieur gauche de l'écran, puis sélectionnez l'icône qui ressemble à une ligne diagonale.
    4. Clic gauche de votre souris et tracer une ligne droite à partir de la partie antérieure de la paroi postérieure de l'aorte.
    5. Manipuler til X et Y axes jusqu'à l'artère pulmonaire principale bifurque. Cette structure sera vu en avant, et vers la droite de l'aorte sur le moniteur.
    6. Manipuler le crânienne axe y jusqu'à ce que l'anneau de l'artère pulmonaire principale est en vue. Il ne sera pas aussi clairement défini que l'aorte.
    7. "Freeze" l'image et obtenir la mesure en systole.
    8. Recueillir trois mesures au total.
  4. Doppler pulsé (DP) des mesures Doppler: Mode PW est principalement utilisé pour l'évaluation hémodynamique de la circulation sanguine dans les artères et les veines. Dans ce protocole, il sera utilisé pour récupérer des trois mesures de temps de la vitesse intégrante de l'aorte et l'artère pulmonaire.
    1. Apportez l'aorte retour en vue de la manière décrite à l'étape 4.3.1, et 1 point de balle.
      1. Sélectionnez "Mode PW". Il est situé sur le coin supérieur droit de la console du système et produire une lecture de Doppler du flux sanguin à travers l'aorte.
      2. Placez la SAvolume de mple juste au-dessus du niveau de la valve aortique. Peuvent avoir besoin d'être ajustée légèrement pour obtenir des enveloppes Doppler suffisamment les x et y axes. Les enveloppes doivent avoir des bordures blanches, et un intérieur creux indiquant flux sanguin laminaire.
      3. Une fois une vue suffisante est obtenue, "geler" l'image et de tracer la frontière de l'enveloppe de Doppler. Cet exemple va calculer le VTI.
      4. Tourner le bouton "Angle" situé sur la console du système dans le sens horaire jusqu'à ce que la ligne jaune segmenté vu dans l'image sur le côté supérieur droit de l'écran est à 0 °. Cette ligne jaune représente la direction de l'écoulement sanguin à travers le vaisseau. Etant donné que le transducteur lui-même est inclinée de telle manière à produire une vue en coupe transversale ou transversale du coeur, la ligne doit être ajustée à 0 °, pour s'aligner avec l'écoulement vertical de sang à travers l'aorte ascendante.
    2. Placer l'proximale de volume de l'échantillon au niveau de la valve pulmonaire dans le centre de l'droit d'éjection du ventricule et répéter les mesures VTI comme ci-dessus. L'écoulement de sang doit apparaître inversé, ou en face de l'écoulement du sang par rapport à l'aorte sur le moniteur.
  5. Mesures en mode M: l'imagerie en mode M fournit une haute résolution temporelle du mouvement du tissu le long d'un faisceau ultrasonore unique, et est utilisé pour quantifier les dimensions de la cavité, et pour étudier valvulaire, infarctus, et le récipient un mouvement de paroi.
    1. Reprendre "Mode B" et repositionner la sonde pour obtenir la "vue de référence» (la vue en coupe transversale du ventricule gauche au niveau des muscles papillaires).
    2. Appuyez sur "M-mode". Ceci va produire un flux vidéo continu dans lequel le mouvement des structures anatomiques suivantes sera visible comme un "ruban". Si dilatée, la lumière de VR apparaîtront en haut de l'alimentation comme un très mince ruban noir. Le septum interventriculaire (IVS) sera visible comme un ruban opaque directement en dessous de la RVlumen. La lumière BT seront visibles directement en dessous de l'IVS. C'est le grand espace noir qui occupe la majorité de la charge d'alimentation. Ci-dessous, la lumière BT est la paroi postérieure LV (LVPW) qui sera considéré comme un ruban opaque.
    3. Figer l'image et tirez à travers la boucle de la vidéo si nécessaire à un point où la respiration ne se produit pas. Lorsque les souris respire, l'acquisition de l'image est perturbée par un mouvement de la paroi de la membrane et de la poitrine, en produisant ainsi un artefact déformée "enduit" dans la charge qui se produit avec une fréquence régulière.
    4. Obtenir les mesures suivantes en utilisant l'icône de la ligne diagonale:
      1. Trois mesures de LV finissent dimension diastolique, qui apparaît comme la plus grande distance entre le SVI et LVPW.
      2. Trois mesures de LV fin systolique dimension, qui apparaît comme la plus courte distance entre l'IVS et LVPW.
      3. Trois mesures de la fréquence cardiaque, qui se fait en cliquant sur l'icône de coeur et la mesure de pic systoliquepic systolique de la LVPW.
      4. Si la lumière de RV est dilaté, obtenir trois mesures en utilisant l'icône de la ligne diagonale.
    5. Enregistrer une vidéo en boucle de la vue parasternale axe court en mode "B" en appuyant sur le bouton "Cine Store".
    6. Allez dans "Fichier", sélectionnez "Parcourir étude" pour récapituler vos mesures, cliquez sur "Fin de session", puis "Commit données de session."
    7. Récupérer la souris comme indiqué par le protocole IACUC, et nettoyer.
    8. Exporter des données dans un fichier CSV vers un lecteur de pouce pour une analyse ultérieure.
  6. Calculer les paramètres suivants de la fonction cardiaque (Tableau 1):
    1. Ventriculaire gauche zone des sorties de voies
    2. Volume d'éjection systolique du ventricule gauche
    3. Le débit cardiaque du ventricule gauche
    4. La fraction de raccourcissement
    5. Niveau de l'artère pulmonaire
    6. Artère pulmonaire temps d'accélération
    7. Droit volume d'éjection systolique du ventricule
    8. L'index cardiaque

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Résultats

Les principaux objectifs de ce protocole sont de quantifier la taille et la fonction VR, et de comprendre la mesure dans laquelle le système vasculaire pulmonaire est malade. Préparation appropriée de l'équipement à la fois la souris et l'échocardiographie est essentielle pour obtenir des résultats précis et reproductibles. Souris auraient leur poitrine épilée et membres solidaire de la plate-forme d'imagerie avec du ruban adhésif. Anesthésie, dans ce cas, l'isoflurane, est administré par cône. La sonde ...

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Discussion

Des modèles murins de la maladie, soit transgénique ou liés toxine, nécessitent validation phénotypique que le modèle reprend en fait la maladie chez l'homme, il est destiné à émuler. Cette validation peut souvent être réalisée en présence ou en l'absence d'une caractéristique particulière, par exemple le développement d'une tumeur. Toutefois, les modèles qui se traduisent par des anomalies hémodynamiques tels que les modèles de constriction de l'aorte de l'hypertrophie ventriculaire gauche ou no...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vevo 770 Système de micro-échographie haute résolutionVisualsonics Inc.obtenir plus d’informations sur www.visualsonics.com/products
RMV (Real-Time MicroVisualization) 704B 40 mH Scanhead w/ Encapsulated TransducerVisualsonics Inc.Pour plus d’informations, rendez-vous sur www.visualsonics.com/products
système de rail intégré Vevo, y compris le système de surveillance physiologiqueVisualsonics Inc.obtenir plus d’informations sur www.visualsonics.com/products
Moniteur d’ordinateur configuré pour être utilisé avec le Vevo770DELL ou un autre fournisseur
Souris d’ordinateur configurée pour être utilisée avec le Vevo770Fournisseur
Vevo770 Cardiac Package SoftwareVisualsonics Inc.obtenir plus d’informations sur www.visualsonics.com/products
VetEquip Portable Tabletop Anesthesia Machine avec un vaporisateur d’isofluraneVetEquipobtenir plus d’informations sur vetequip.com
Conteneurs de gaz résiduaires de charbon actifVetEquip/Vaporguard931401obtenir plus d’informations sur vetequip.com
Puralube Eye OintmentHenry Scheinobtenir plus d’informations
Ecogel 100 Gel à ultrasonsEcoMed Pharmaceuticals30GBobtenir plus d’informations sur ecomed.com
3M Transpore TapeFisher Scientific1527-0obtenir plus d’informations sur fishersci.com
Petit tournevis à tête plateFournisseur général Stérile
H2ODDI H2O du robinet puis autoclave
6 en coton Applicateurs à pointesFisher Scientificobtenir plus d’informations sur fishersci.com
Nair (crème dépilatoire)Fournisseur
2 po x 2 po Éponges de gazeFisher Scientificobtenir plus d’informations sur fishersci.com
généralgénéral sur henryschein.comgénéral

Références

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