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Article de méthode

Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d'épithélium de la vessie

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DOI :

10.3791/50919

⸱

7 novembre 2013

 , 
1Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un modèle in vitro qui imite un élément important de la réponse inflammatoire aiguë lors d'une infection de la vessie avec Escherichia coli uropathogènes. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial permet une évaluation quantitative de la migration des neutrophiles humains à travers l'épithélium de la vessie, cultivées sur des supports perméables, en réponse à une infection bactérienne ou substances chimiotactiques.

Résumé

Le recrutement de cellules immunitaires de la périphérie vers le site de l'inflammation est une étape essentielle dans la réponse immunitaire innée à n'importe quelle surface de la muqueuse. Au cours de l'infection de la vessie, les leucocytes polymorphonucléaires (PMN; neutrophiles) migrent de la circulation sanguine et traversent l'épithélium de la vessie. L'incapacité à résoudre l'infection en l'absence d'une réponse neutrophile démontre l'importance de PMN dans la défense de la vessie. Afin de faciliter la colonisation de l'épithélium de la vessie, uropathogène d'Escherichia coli (UPEC), l'agent causal de la majorité des infections du tractus urinaire (ITU), atténuer la réponse inflammatoire aiguë en utilisant une variété de mécanismes partiellement définies. Pour approfondir l'interaction entre l'hôte et l'agent pathogène bactérien, nous avons développé un modèle in vitro de cet aspect de la réponse immunitaire innée à l'UPEC. Dans le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial, une variante de la chambre de Boyden, en culture vessie epithElial cellules sont cultivées jusqu'à confluence sur la face inférieure d'un support perméable. PMN sont isolés à partir de sang veineux humain, et sont appliquées sur le côté basolatéral des couches de cellules épithéliales de la vessie. Migration des PMN représentant la direction basolatérale à apicale physiologiquement pertinents en réponse à une infection bactérienne ou molécules chimiotactiques est énumérée en utilisant un hématimètre. Ce modèle peut être utilisé pour étudier les interactions entre les cellules eucaryotes et UPEC ainsi que pour interroger les exigences moléculaires pour la traversée de l'épithélium de la vessie par les PMN. Le modèle de la migration des neutrophiles transuroepithelial fera progresser notre compréhension de la réponse inflammatoire initiale à l'UPEC dans la vessie.

Introduction

Le mouvement des cellules dans tout le corps, souvent sur de longues distances, est nécessaire pour la croissance et le développement, la cicatrisation des plaies, et la réponse immunitaire. La migration cellulaire est complexe et nécessite la coordination de nombreux processus différents, y compris les cascades de signalisation et le réarrangement des composants du cytosquelette. Les cellules peuvent se déplacer de façon aléatoire (chimiokinèse) ainsi que vers des gradients chimiques définies (chimiotaxie). De nombreuses techniques ont été développées pour étudier la migration cellulaire in vitro. La technique la plus ancienne et la plus commune, la chambre de Boyden, se compose d'un système vertical à deux compartiments où une substance chimiotactique est placé dans la chambre et les cellules d'intérêt bas sont placés dans la chambre supérieure 1. La circulation des cellules à travers le filtre perméable, avec des pores d'une taille définie, séparant les deux chambres est surveillée. D'autres techniques ont été développées pour étudier la migration cellulaire, y compris la chambre Zigmond 2 et la chambre Dunn3. Ces approches collectives ont donné un aperçu significatif dans le mouvement de nombreux types de cellules différents.

En plus d'interroger les principes de base de la chimiokinèse et la chimiotaxie, des dosages à deux chambres ont facilité l'étude de la migration des cellules à travers les composants de la matrice extracellulaire et les deux couches de cellules endothéliales et épithéliales. Un avantage des systèmes à deux chambres par rapport aux autres techniques est que la membrane poreuse peut être revêtu avec des protéines telles que le collagène ou le fibrinogène, et la migration cellulaire à travers une barrière de la matrice extracellulaire analogue peut être évaluée. En outre, les lignées cellulaires cultivées peuvent être cultivées et différenciées sur les supports perméables. Pour étudier le mouvement des cellules à travers une barrière endothéliale, les cellules endothéliales en culture sont ensemencées et cultivées dans le réservoir supérieur des supports perméables. Cellules mobiles, tels que les cellules du système immunitaire, sont ajoutés au réservoir supérieur et la migration dans le réservoir inférieur à travers la sallebarrière endothéliale dans le sens physiologique apicale à basolatérale est observée. Ce modèle a été inestimable dans la compréhension de l'extravasation des cellules immunitaires de la circulation sanguine. A la différence de la migration trans-endothéliale, la circulation des cellules à travers une barrière épithéliale se produit généralement dans le sens basolatéral à apical. Afin de modéliser ces événements in vitro, les chercheurs semences et la croissance des cellules épithéliales cultivées sur la face inférieure des supports perméables. Cellules mobiles sont ajoutés au réservoir supérieur et la migration à travers la barrière epitheliale, qui représente le sens basolatéral à apical, est surveillée. Ces modèles de migration trans-épithéliale ont contribué de manière significative à notre compréhension des réactions inflammatoires au niveau des surfaces muqueuses, en particulier ceux du poumon et l'intestin 4,5.

En revanche, le trafic des cellules immunitaires à travers l'épithélium du tractus urinaire a reçu beaucoup moins d'attention. Pour approfondir notre understanding des réponses immunitaires innées dans les voies urinaires pendant l'infection avec uropathogène Escherichia coli (UPEC), nous avons développé un test in vitro, le test de la migration des neutrophiles transuroepithelial, qui permet l'étude des leucocytes polynucléaires (PMN; neutrophiles) mouvement à travers une barrière vessie épithéliale 6 -8. Comme avec d'autres modèles à deux chambres de migration trans-épithéliale, des cellules humaines cultivées de la vessie épithéliales sont cultivées sur la face inférieure d'un support perméable et forment des couches epitheliales confluentes. Les neutrophiles humains, isolés à partir de sang veineux, sont appliquées sur le côté basolatéral de la couche epitheliale, et la migration à travers l'épithélium dans le sens basolatéral à apical physiologiquement pertinent est quantifiée en réponse à l'infection par différentes souches de E. coli ou de la présence de molécules chimiotactiques. De nombreuses recherches ont porté sur le mouvement des neutrophiles, à la fois la chimiokinèse et la chimiotaxie, en l'absence de types de cellules additionnelles. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial est avantageuse car elle prend en compte les interactions complexes entre les cellules épithéliales de la vessie et les cellules du système immunitaire lors de l'infection. Cette docile modèle in vitro a le potentiel de permettre la vérification détaillée de la réponse immunitaire au niveau des surfaces uroépithéliales.

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Protocole

Une. La culture de cellules de la vessie 5637 épithéliales

Effectuez les étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire préparé par irradiation UV et essuyé avec 70% d'éthanol.

  1. Préparer un milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) [appelé RPMI +], stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um de taille de pore, et chaude à 37 ° C dans un bain d'eau.
  2. Décongeler un cryotube de 5637 cellules (American Type Culture Collection HTB-9; dérivée d'un carcinome de la vessie) dans un bain d'eau à 37 °. Transférer rapidement les cellules décongelées à un tissu flacon de 75 cm 2 de culture contenant 20 ml de RPMI +.
  3. Incuber la fiole à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules sont confluentes à environ 95% (environ 6 x 10 6 cellules par flacon), environ 4 jours.
  4. Pour repiquer les cellules 5637:
    1. Retirez le milieu du ballon. Laver les cellules avec tampon phosphate Salin de 10 ml Dulbeccoe (DPBS) à la température ambiante.
    2. Ajouter 6 ml chaude (37 ° C) 0,05% de trypsine, une solution d'EDTA à 0,02% dans le ballon, et incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 15 min.
    3. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml, et le culot par centrifugation à 300 xg pendant 5 min. Retirer la solution de trypsine / EDTA.
    4. Remettre en suspension les cellules dans 6 ml de RPMI + (10 6 cellules / ml), et transfert de 1 ml (10 6 cellules) à un nouveau flacon de 75 cm 2 contenant 20 ml de RPMI +.
  5. Répétez l'étape 1.4 pour repiquer les cellules tous les 4 jours ou lorsque les cellules atteignent 95% de confluence.

2. Ensemencement et croissance de 5637 cellules sur supports perméables

Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu en utilisant une technique aseptique. Pour des résultats optimaux, utiliser 5637 cellules qui ont subi moins de 10 sous-cultures.

  1. En utilisant des pinces stériles, inverser les supports perméables à un 25 mm boîte de culture des tissus profonds stérile.
  2. Trypsiniser un flacon de 75 cm2 de cellules 5637 à 95% de confluence selon les étapes 1.4.1-1.4.3.
  3. En utilisant une pipette de 1000 ul, remettre en suspension les cellules doucement dans ~ 2 ml de RPMI + à une concentration de 3 x 10 6 cellules / ml, déterminé par comptage en utilisant un hémocytomètre cellule.
  4. Appliquer 50 ul de la suspension de cellules (1,5 x 10 5 cellules) pour chaque support perméable sans toucher la membrane. Placer le couvercle sur le plat, et placer soigneusement le plat à 37 ° C avec 5% de CO 2 pour pas plus de 16 heures.
  5. En utilisant des pinces stériles, à droite les supports perméables dans une plaque de 24 puits contenant 0,6 ml de RPMI + par puits. Ajouter 0,1 ml de RPMI + vers le réservoir supérieur de chaque support perméable. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  6. Remplacez le support tous les 2 jours. Tout d'abord, moyen d'aspiration du réservoir supérieur suivi par le réservoir inférieur, et ensuite appliquer frais RPMI + dans l'ordre inverse, vers le réservoir inférieur (0,6 ml), puis le rése supérieurervoir (0,1 ml).
  7. Sept jours après le semis, les supports perméables à 5637 cellules, évaluer confluence des cellules. Remplir le réservoir supérieur avec du RPMI + (~ 0,35 ml). Les cellules confluentes sont suffisamment lorsque le milieu n'est pas s'équilibrer entre les réservoirs supérieur et inférieur.

3. Préparation de l'inoculum bactérien

  1. En utilisant une technique aseptique, ajouter 20 ml de bouillon de culture approprié d'un ballon de 250 ml avec un bouchon. Utilisez Luria-Bertani (LB) pour E. coli cultures, et ajouter des antibiotiques pour le bouillon, le cas échéant.
  2. En utilisant une boucle d'inoculation stérile, ensemencer le bouillon avec des bactéries à partir d'un stock de glycérol ou une plaque de série. Pour les souches UPEC, incuber la culture bactérienne à 37 ° C pendant environ 16 heures, sans secousses (pour favoriser la production de pili de type 1).
  3. Transférer la culture bactérienne dans un tube de centrifugeuse. Sédimenter les bactéries par centrifugation à 8000 xg pendant 10 min.
  4. Décanter le surnageantEt remettre en suspension les bactéries dans du PBS à DO 600 = 1,000, ce qui correspond à ~ 10 9 UFC / ml.
    1. Pour générer un stimulus bactérien tué par la chaleur, incuber une partie aliquote (par exemple, ~ 1,5 x 10 8 CFU dans 150 ul) des bactéries remises en suspension à 55 ° C pendant 30 min. Plaque d'une aliquote de la suspension tué par la chaleur de confirmer la mort bactérienne.
  5. Immédiatement avant utilisation, diluer les bactéries remises en suspension (vivent ou tués par la chaleur) de 10 fois à 10 8 UFC / ml dans RPMI chaud sans sérum [appelé RPMI-] dans un tube de centrifugeuse.

4. Isolement des neutrophiles humains du sang périphérique

La collecte de sang de volontaires adultes nécessite l'examen préalable et l'approbation d'un comité d'examen institutionnel. Porter un équipement de protection individuelle approprié et la mise au rebut des matières dangereuses à éviter l'exposition au sang humain.

  1. Environ 25 ml de sang veineux d'un adulte en bonne santé volunteer doit être aspiré dans 3 tubes de collecte de sang contenant de l'héparine de sodium stérile par du personnel formé à la saignée.
    1. Envelopper un garrot en caoutchouc autour du bras, au-dessus du coude.
    2. Désinfecter le site d'entrée, le pli du coude, en utilisant une aiguille stérile de 70% d'alcool essuyer.
    3. Fixer un support de tube en plastique pour un système d'aiguille à ailes de papillon.
    4. Insérez l'aiguille dans une veine du pli du coude à un angle de 30 ° ou moins, biseau vers le haut. L'aiguille a percé la veine quand une poussée de sang apparaît dans le tube en plastique.
    5. Insérer un tube de collecte de sang dans le support de tube en matière plastique. Lorsque le premier tube de collecte est plein, le remplacer par le second tube de collecte. Répéter l'opération avec le troisième tube.
    6. Lorsque le troisième tube de collecte est d'environ à moitié plein, enlever le garrot.
    7. Couvrir le site de ponction avec une boule de coton stérile et retirer lentement l'aiguille dans la veine. Faites glisser le bouclier protecteur sur l'aiguille et le lieu ina biohazard contenant pour objets pointus.
    8. Appliquer une pression sur le site de ponction. Couvrir le site de ponction et une boule de coton avec un pansement adhésif.
    9. Retourner délicatement les tubes de collecte de sang pour disperser la héparine.

Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu en utilisant une technique aseptique.

  1. L'utilisation d'un pipette de 10 ml, transférer délicatement le sang à un, 50 ml stériles nouveau tube conique. Ajouter un volume équivalent de 3% (p / v) de dextrane à 0,9% de NaCl et mélanger par retournement. Incuber le tube en position verticale à température ambiante pendant 20 min.
  2. Sans perturber la couche inférieure, aspirer soigneusement la couche supérieure et la transférer à un nouveau tube conique de 50 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant.
  3. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume de NaCl à 0,9% équivalent au volume initial de sang.
  4. Couche 10 ml de solution de centrifugation par densité de moins de la suspension de cellules, préservant l'interface entre les deux phases. Centrifuger à 400 g pendant 30 min sans frein. Jeter le surnageant.
  5. Pour lyser les restants des globules rouges, remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de NaCl 0,2% froid. Incuber pendant 30 sec, puis ajouter rapidement 10 ml de NaCl 1,6% froid pour rétablir isotonique.
  6. Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 6 min. Jeter le surnageant.
  7. Répéter les étapes 4.6 à 4.7 jusqu'à ce que le culot cellulaire semble être exempt de globules rouges, typiquement trois cycles de lyse.
  8. En utilisant une pipette de 1000 ul, remettre en suspension le culot de cellules, principalement des PMN, à chaud (37 ° C) du milieu RPMI-à une concentration de 10 7 cellules / ml, déterminée par comptage de cellules en utilisant un hématimètre. Maintenir les cellules à 37 ° C jusqu'à utilisation. Typiquement, PMN viabilité et la pureté sont> 99% évaluée par exclusion au bleu trypan et la visualisation de la morphologie nucléaire après coloration, respectivement.

5. Transuroepithelial neutrophiles migrations Commedire

Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu en utilisant une technique aseptique. Utilisez uniquement des supports perméables portant confluentes 5637 couches de cellules, tel que déterminé à l'étape 2.7. Les plaques à 24 puits contenant du milieu RPMI-peuvent être préparés à l'avance et conservées à 37 ° C avec 5% de CO2 jusqu'à utilisation.

  1. Aliquote de 1 ml réchauffer RPMI-par puits dans une plaque de 24 puits; préparer 3 puits par support perméable.
  2. Aspirer le milieu des réservoirs supérieur et inférieur des supports perméables.
  3. En utilisant des pinces stériles, transférer les supports perméables à la plaque de 24 puits préparé à l'étape 5.1. Laver les supports perméables à trois reprises par le transfert des supports de puits en puits.
  4. Si un inoculum bactérien est utilisé, inverser les supports perméables à un 25 mm boîte de culture de tissus profonds stérile. Si un chemoattractant (par exemple, la N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) ou IL-8) doit être utilisé, passez à l'étape 5.6.
  5. Pour les expériences avec bact vivant ou tuéstimuli erial, inoculer le côté apical de chaque support perméable avec 60 ul de RPMI-(pseudo-infection) ou avec l'inoculum bactérien (6 x 10 6 CFU) préparé à l'étape 3.5. Placer le couvercle sur la boîte et incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 1 heure.
  6. Ajouter 0,6 ml de RPMI-par puits dans une plaque de 24 puits à faible attachement; préparer 1 puits par support perméable. Préparer trois puits contenant 0,5 ml du milieu RPMI-énumérer entrée de PMN.
    1. Si un agent chimio-attractif est utilisé à la place de bactéries, la chimio-attractif pour ajouter 0,6 ml de RPMI-dans la plaque à 24 puits préparée à l'étape 5.6.
  7. Droite supports perméables dans la plaque de 24 puits à faible attachement.
  8. Ajouter 0,1 ml PMN (10 6 PMN), préparé à l'étape 4.9, le réservoir supérieur (côté basolatéral) de chaque support perméable. Ajouter 100 ul PMN directement aux puits contenant 500 pi RPMI. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 1 heure.
  9. En utilisant des pinces stériles, gratter délicatement l'Membrane perméable à l'appui de la contre le bord du puits pour éliminer les PMN supplémentaire à partir du côté apical et ensuite éliminer le support.
  10. Recueillir PMN en grattant doucement le fond de chaque puits à la pointe de la pipette de 1000 pi, et transférer les suspensions de PMN à Microfuge tubes.
  11. Énumérer PMN en utilisant un hématimètre.
  12. Pour calculer le nombre total de PMN dans le réservoir inférieur, il faut multiplier le nombre de PMN dans de 1 mm 2 (100 nl) par 6000. Les données peuvent être exprimées en pourcentage de l'entrée PMN, ou que le nombre de PMN normalisées à 10 6 entrée PMN.

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Résultats

Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial permet l'évaluation quantitative de la migration des PMN humains à travers les couches de cellules épithéliales de la vessie en culture en réponse à divers stimuli (figure 1B). Alors que le protocole est très simple, il existe un certain nombre de variables qui peuvent influencer la migration des PMN et par conséquent d'affecter la reproductibilité de cet essai. Des mesures devraient être prises lors de la préparation des supports per...

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Discussion

En utilisant une lignée de cellules épithéliales de la vessie de culture et fraîchement isolé PMN humain, nous avons établi un modèle in vitro de migration des neutrophiles transuroepithelial. Ce modèle a contribué à commencer à disséquer la complexité de la réponse immunitaire innée lors de l'infection des voies urinaires (UTI), une infection bactérienne très commune généralement causée par UPEC 9. Au cours de l'infection de la vessie, ou la cystite, le recrutement de PMN vers le lumen de la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01-DK080752 et P50-DK064540. Nous remercions J. Loughman pour ses efforts dans l'établissement de ce test.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Inserts Transwell (c’est-à-dire   ; supports perméables)Corning34726,5 mm, 3 &mu ; Insert de membrane en polyester BD
Vacutainer Blood Collection TubesBecton, Dickinson and Company (BD)36648016 mm x 100 mm x 10 ml Tubes à capuchon vert contenant de l’héparine sodique
BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion SetBecton, Dickinson and Company (BD)36728121 G x 0,75 po aiguille x 12 po tube
BD Vacutainer à usage unique, support non empilableBecton, Dickinson and Company (BD)364815
DextranSigma-AldrichD4876De Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS solution de centrifugation à densitéGE Healthcare17-1440-02
Plaques de fixation ultra-bassesCorning347324 puits, fond
plat transparentN-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)Sigma-AldrichF3506Reconstitué en DMSO à 10 mM
Humain recombinant CXCL8/IL-8R& D Systems208-ILReconstitué en PBS à 100 &mu ; g/ml

Références

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