La préparation d'extraits de levure de haute qualité est une première étape nécessaire à l'analyse des protéines individuelles ou protéomes entiers. Nous décrivons ici un protocole d'homogénéisation rapide, efficace et fiable pour les cellules de levure en herbe qui a été optimisé afin de préserver les fonctions des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles.
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Article de méthode
Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l'étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles
Dans cet article
Résumé
Résumé
Homogénéisation en battant perle est un moyen rapide et efficace pour libérer l'ADN, l'ARN, les protéines et les métabolites à partir de cellules de levure en herbe, qui sont notoirement difficiles à perturber. Nous décrivons ici l'utilisation d'un homogénéiseur broyeur à billes pour l'extraction des protéines dans des tampons optimisés pour maintenir les fonctions, les interactions et les modifications post-traductionnelles des protéines. Cellules en croissance logarithmique exprimant la protéine d'intérêt sont cultivées dans un milieu de croissance liquide de choix. Les milieux de culture peuvent être complétées par des réactifs pour induire l'expression de la protéine à partir de promoteurs inductibles (par exemple le galactose), synchroniser stade du cycle cellulaire (par exemple le nocodazole), ou d'inhiber la fonction du protéasome (par exemple MG132). Les cellules sont ensuite culot et remises en suspension dans un tampon approprié contenant la protéase et / ou inhibiteurs de phosphatases et soient traités immédiatement ou congelés dans l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. L'homogénéisation est réalisée par six cycles de 20 sec bead-battement (5,5 m / s), chacun suivi d'une incubation d'une minute sur la glace. L'homogénat obtenu est clarifié par centrifugation et les petites particules peut être éliminé par filtration. L'extrait de cellules entières dégagé résultant (WCE) est précipité en utilisant 20% de TCA pour l'analyse directe des protéines totales par SDS-PAGE suivie par Western blot. Extraits sont également appropriés pour la purification par affinité de protéines spécifiques, la détection des modifications post-traductionnelles, ou l'analyse de protéines co-purification. Comme c'est le cas pour la plupart des protocoles de purification des protéines, des enzymes et des protéines peuvent exiger des conditions particulières ou des compositions de tampons pour leur purification et d'autres peuvent être instables ou insoluble dans les conditions indiquées. Dans ce dernier cas, le protocole présenté peut fournir un point de départ utile pour déterminer empiriquement la meilleure stratégie de perles battre pour l'extraction et purification des protéines. Nous montrons l'extraction et la purification d'un épitope étiqueté SUMO E3 ligase, SIZ1, un cycle cellulaireréglage protéine qui devient à la fois sumoylée et phosphorylé, ainsi que d'une sous-unité de l'ubiquitine ligase SUMO ciblée, Slx5.
Introduction
La puissance impressionnante de levure génétique est légendaire, mais la préparation et l'analyse des protéines natives de levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, est souvent source de nombreux problèmes. Celle-ci est due à la résistance mécanique importante et l'élasticité de la paroi une cellule de levure. Différents moyens ont été décrits pour la perturbation des cellules de levure pour obtenir un extrait de protéines de cellules entières 2-6 enzymatique, chimique, mécanique, et basée sur la pression. Ces techniques varient considérablement dans leur efficacité à produire des extraits de protéines de cellules représen....
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Protocole
Purification des protéines marquée à la 6XHis exprimés dans les cellules de levure en herbe dans des conditions natives
1. La croissance des cellules de levure et l'induction de l'expression des protéines
(Modification de 2)
OPTION: Utilisez croissance logarithmique des cultures de levures exprimant la protéine d'intérêt à la place des cultures galactose induits décrits ci-dessous.
- Transformer des cellules d'une souche de levure Gal + avec un plasmide codant pour un inductible par le galactose 6xHIS protéine marquée de choix. Par exemple, voir la liste des ....
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Résultats
Nos résultats représentatifs révèlent que le protocole d'extraction de perles coups et protéine décrite est utile pour la préparation reproductible de protéines pour une variété d'applications en aval (résumées dans le tableau 2). SDS-PAGE suivie d'une coloration de Coomassie de ACEE montrent qu'une large gamme de protéines (~ 12 à> 250 kDa) peut être reproductible extrait des cellules de levure (figure 1A). Bandes discrètes sur une gamme de poids moléculaires sont ré.......
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Discussion
Ce protocole met l'accent sur la préparation du intact, indigène, et modifications post-traductionnelles des protéines à partir de cellules de levure en herbe pour les applications en aval. Avant de tenter ce protocole, il est essentiel de déterminer si la protéine d'intérêt peut être facilement détectée dans des extraits protéiques préparés dans des conditions dénaturantes 12. Si des anticorps polyclonaux sont pas disponibles, il peut être avantageux d'épitope tag la protéine d'intérêt de sor.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions tous les membres du laboratoire Kerscher pour leur soutien. Nous remercions Mark Hochstrasser pour la souche de levure MHY3765. Ce travail a été soutenu par la NSF subvention 1051970 (OK) et Hughes Medical Institute cycle de subvention de voyage Howard et Monroe Scholars Programme de subventions (pour ES).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Levure souche ORF en BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | Souche de levure GAL+ pouvant être utilisée pour l’induction et l’extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | Souche de levure GAL+ pouvant être utilisée pour l’induction et l’extraction ; contient une étiquette V5/6xHIS |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail ( 100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Tube à jupe avec bouchon à vis attaché | BioExpress | C-3369-3 | Assurez-vous que le tube s’insère correctement dans la perle Ruptor |
| Perles de verre, lavées à l’acide, 425-600 & micro ; m (tamis 30-40 US) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X | centrifuge Sigma-Aldrich | CLS8161 | Utilisation pour le filtrage supplémentaire du lysat clarifié |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Pour la purification de protéines marquées 6xHIS |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | Pour préparer et/ou éluer des échantillons avant l’application SDS-PAGE et Western Blotting |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel Life | Technologies | NP0321BOX | Gels préfabriqués souvent utilisés pour SDS-PAGE avant Western Blot |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Coloration au gel protéique |
| Tampon de lyse des mammifères | Promega | G9381 | Tampon de lyse commercial alternatif Agarose |
| anti-V5Sigma | A7345 | Méthode d’immunoprécipitation | |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| Membrane PVDF | Gels Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS Life | Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc | Covance | mms-150R | |
| anticorps secondaire | Abcam | ab97040 | IgG de chèvre à souris (HRP) |
Références
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19....
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Réimpressions et autorisations
