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Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

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DOI :

10.3791/50925

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13 décembre 2013

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1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Le poisson-zèbre est maintenant un outil établi et puissant pour modéliser les dystrophies musculaires, les myopathies congénitales et les maladies neuromusculaires associées. La biréfringence et le comportement d’évasion évoqué par le toucher sont deux tests non invasifs courants utilisés pour déterminer le degré de désorganisation musculaire et de déficience locomotrice des embryons de poisson-zèbre au cours du développement précoce.

Résumé

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un outil particulièrement efficace pour modéliser les maladies humaines affectant les muscles squelettiques, y compris les dystrophies musculaires1-3, les myopathies congénitales4,5 et les perturbations de l’assemblage sarcomérique6,7, en raison d’une conservation génomique et structurelle élevée chez les mammifères8. La désorganisation musculaire et la déficience locomotrice peuvent être rapidement évaluées chez le poisson-zèbre au cours des premiers jours suivant la fécondation. Deux tests pour aider à caractériser les défauts musculaires squelettiques chez le poisson-zèbre sont la biréfringence (structurelle) et la réponse d’évasion évoquée par le toucher (comportementale).

La biréfringence est une propriété physique dans laquelle la lumière tourne lorsqu’elle traverse une matière ordonnée, comme le réseau pseudo-cristallin de sarcomères musculaires9. Il s’agit d’une approche simple et non invasive pour évaluer l’intégrité musculaire des larves de poisson-zèbre translucides au début du développement. Les poissons-zèbres de type sauvage avec un muscle squelettique très organisé apparaissent très brillants au milieu d’un fond sombre lorsqu’ils sont visualisés entre deux filtres de lumière polarisée, tandis que les mutants musculaires ont des motifs de biréfringence spécifiques au trouble musculaire primaire qu’ils modélisent. Les poissons-zèbres modélisant les dystrophies musculaires, des maladies caractérisées par une dégénérescence des myofibres suivie de cycles répétés de régénération, présentent des taches sombres dégénératives dans les muscles squelettiques sous une lumière polarisée. Les myopathies non dystrophiques ne sont pas associées à une nécrose ou à des modifications régénératives, mais entraînent une désorganisation des myofibres et une faiblesse des muscles squelettiques. Les poissons-zèbres myopathiques présentent généralement une réduction globale de la biréfringence, ce qui reflète la désorganisation des sarcomères.

Le test d'évasion évoquée par le toucher consiste à observer le comportement de nage d'un embryon en réponse à une stimulation tactile10-12. Par rapport aux larves de type sauvage, les larves mutantes présentent souvent une faible contraction d’échappement, suivie d’une nage lente ou d’un autre type de mouvement altéré qui ne parvient pas à propulser les larves sur plus d’une courte distance12. L’avantage de ces tests est que la progression de la maladie chez le même type de poisson peut être surveillée in vivo pendant plusieurs jours, et qu’un grand nombre de poissons peuvent être analysés en peu de temps par rapport aux vertébrés supérieurs.

Protocole

1. Analyse in vivo de la structure musculaire squelettique par biréfringence

  1. Préparez des cages d’accouplement séparant le(s) mâle(s) de la (des) femelle(s) de la (des) ligne(s) de poisson-zèbre souhaitée(s) tard dans l’après-midi après le repas.
    1. Distinguent les femelles par leur ventre plus gros et leur légère coloration bleue/blanche, et les mâles par la forme élancée de leur corps et leurs teintes roses/jaunes.
    2. Le succès des croisements par paires (un mâle et une femelle) peut n’être que d’environ 50 %. Pour un taux de réussite plus élevé, accouplez un mâle avec 2-3 femelles.
  2. Retirez les séparateurs de cage le lendemain matin, peu après le début de la lumière, et laissez les poissons frayer sans être dérangés.
  3. Récupérez les œufs à l’aide d’une passoire lorsqu’un nombre suffisant d’œufs fécondés sont pondus au fond du réservoir.
  4. Transférez les embryons dans une boîte de Pétri profonde en rinçant la passoire avec de l’eau de poisson et remettez les poissons parents dans leurs réservoirs. Placez les boîtes d’embryons dans un incubateur à 28,5 °C.
  5. Nettoyez les œufs et les débris non viables plus tard dans la journée ou le lendemain matin, et retournez les embryons dans l’incubateur pour une croissance ultérieure.
  6. Les embryons/larves atteignent l’âge approprié pour observer la biréfringence 3 à 7 jours après la fécondation (dpf), car les résultats avant 3 dpf peuvent potentiellement souffrir d’un contraste limité. Les embryons de type sauvage éclosent de leur chorion entre 48 et 60 heures après la fécondation (hpf), suivie d’un redressement de l’axe du corps. Les embryons de type sauvage ou mutants à éclosion tardive peuvent nécessiter une déchorisation manuelle.
    1. Faites doucement une déchirure dans le chorion avec des pinces tranchantes et retournez-le pour que l’embryon tombe.
    2. Laissez les embryons déchorionnés se redresser avant de commencer le test.
    3. Anesthésie le(s) embryon(s) avec de la tricaïne (0,04 % dans l’eau de poisson) pour aider à leur positionnement correct.
  7. Installez un microscope à dissection avec une lentille polarisée qui peut être tournée pour ajuster l’angle de la lumière polarisée (Figure 1A).
  8. Placez le(s) embryon(s) déchorionné(s) anesthésié(s) directement sur un deuxième cristallin polarisé le long de l’axe latéral du corps. La deuxième lentille doit être placée sous la lentille supérieure, sur la platine du microscope (Figure 1B). N’utilisez pas de boîtes de Pétri en plastique à aucun moment pendant le test de biréfringence, car le plastique n’est pas un support approprié pour la transmission de la lumière réfractée.
  9. Faites pivoter la lentille supérieure avec l’embryon d’intérêt en vue jusqu’à ce que les axes de polarisation des deux lentilles soient orientés à 90° l’un de l’autre et que l’arrière-plan soit complètement sombre.
  10. Le résultat optimal du test dépend de l’orientation des poissons entre deux lentilles polarisées. Déplacez les poissons pour vous assurer qu’ils sont aussi plats que possible.
    1. Si le poisson est courbé, seuls les segments avec cette orientation plate passeront la lumière polarisée et présenteront une biréfringence. Dans de tels cas, mesurez la biréfringence dans les zones plates et notez la biréfringence de la zone correspondante chez les poissons de type sauvage (par exemple, somites 1-10 chez les poissons de type sauvage et mutants).
  11. Observez le phénotype biréfringent du poisson.
    1. Les poissons de type sauvage avec un muscle squelettique très organisé présentent une biréfringence brillante, car l’indice de réfraction de la lumière parallèle aux myofilaments est plus élevé que la lumière polarisée perpendiculaire à ces structures.
    2. Les poissons dont le muscle squelettique est désorganisé et qui suggèrent une myopathie non dégénérative ou un défaut de développement présentent généralement une réduction globale de la biréfringence.
    3. Les poissons dont le muscle squelettique est désorganisé, caractéristique d’une dystrophie musculaire, présentent généralement un motif de biréfringence en forme de patch, avec des zones sombres représentant la dégénérescence musculaire parmi les zones lumineuses de l’architecture musculaire normale.
  12. Quantifiez la biréfringence en prenant des images de poissons de type sauvage et mutants sous une lumière polarisée avec les mêmes paramètres d’exposition et de grossissement. Enregistrez les images sous forme de fichiers .tiff.
    1. Ouvrez les images de biréfringence dans le logiciel ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Pour chaque image, sélectionnez la zone du muscle du poisson-zèbre en traçant une ligne autour du corps à l’aide de l’option « Sélections de polygones » de la barre d’outils.
    3. Utilisez « Définir les mesures » dans le menu déroulant « Analyser » pour sélectionner les statistiques requises pour l’image.
      1. La sélection minimale nécessite que les cases « Surface », « Valeur de gris moyenne » et « Valeur de gris min et max » soient cochées.
      2. Une valeur de gris maximale de >255 indiquera la saturation des pixels. Par conséquent, utilisez des images avec des valeurs de gris maximales inférieures à 255.
    4. Normalisez l’intensité moyenne avec la zone sélectionnée et répétez cette même procédure de quantification pour chaque image de biréfringence.

2. Essai de comportement d’échappement évoqué par le toucher

  1. Établissez des couples d’accouplement de la ou des lignées de poisson-zèbre appropriées et collectez les embryons comme décrit ci-dessus aux étapes 1.1 à 1.5.
  2. De 2 à 7 jours après la fécondation, placez les embryons/larves déchoionnés individuellement dans une boîte de Pétri profonde ou dans les chambres des plaques multipuits.
  3. En travaillant avec un seul embryon à la fois, centrez l’embryon dans le champ de vision d’un stéréomicroscope Nikon SMZ1500 avec un système d’appareil photo numérique SPOT RT3 ou similaire, et commencez l’imagerie séquentielle.
    1. La même fréquence d’imagerie doit être utilisée pour les poissons de type sauvage et mutant. Les fréquences d’images >30 Hz sont recommandées, car des fréquences plus lentes ne seront généralement pas suffisantes pour capturer la nage rapide des poissons sauvages.
  4. Délivrez des stimuli mécanosensoriels à l’embryon en touchant la queue avec une épingle à insectes.
  5. Arrêtez l’imagerie lorsque l’embryon a cessé de nager ou a nagé hors du champ de vision.
  6. Convertissez des images séquentielles en fichier vidéo ou analysez des images individuelles d’images accélérées hors ligne à l’aide du logiciel SPOT 5.1 Advanced. Parmi les logiciels similaires, citons Open Lab, NIS Elements ou ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  7. Quantifiez le comportement de nage en effectuant la réponse évoquée par le toucher chez plusieurs embryons.
    1. Cela peut être réalisé en faisant la moyenne de la distance que les embryons sont capables de nager dans un intervalle de temps fixe à l’aide d’un logiciel ou d’une règle métrique pour marquer les points de départ et d’arrivée de la nage.
    2. Évitez que les embryons ne s’habituent au stimulus tactile au fil du temps en effectuant le test avec un nouvel embryon pour chaque répétition expérimentale. Les comportements dans les modèles mutants de type sauvage et fiables ont tendance à être hautement reproductibles.

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Résultats

La biréfringence peut être utilisée comme un test efficace et non invasif permettant d'évaluer l'état de l'organisation des myofibrilles chez des embryons vivants de poisson zèbre. Des exemples de poissons zèbres de type sauvage ainsi que de poissons zèbres présentant une expression réduite de gènes essentiels au développement et à la fonction du muscle squelettique sont présentés. À 5 dpf, les poissons zèbres de type sauvage présentent des muscles squelettiques fortement biréfringents en lumière polarisée, en raison de ...

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Discussion

Les troubles neuromusculaires primaires sont traditionnellement classés comme des processus dystrophiques ou non dystrophiques. Les dystrophies musculaires sont caractérisées par une dégénérescence des myofibres suivie de cycles répétés de régénération, qui conduisent finalement à un processus final caractérisé par une fibrose et un remplacement par le tissu adipeux14. Les myopathies non dystrophiques, en revanche, ne sont pas associées à une nécrose ou à des changements régénératifs, mais entraînent une désor...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Nous remercions Behzad Moghadaszadeh pour son aide précieuse dans la quantification des images de biréfringence. Ce travail a été financé par la Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) et le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345), ainsi que par le généreux soutien de A Foundation Building Strength, Cure CMD et la AUism Charitable Foundation. VAG est soutenu par le AR062601 K01 de l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées, et le LLS est soutenu par le NS081928 F31 de l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tricaine SigmaA5040
Boîtes de PétriFischer Scientific0875711Z
PinceFischer Scientific100189-588
Épingle à insectesFischer ScientificS67375
Objectifs polarisésRitz CameraQuantaray Tristar Optics C-PL 72mm
IncubateurFischer Incubateur scientifique Isotemp Modèle 630D
MicroscopeNikon Instruments Inc.SMZ 1500
CameraDiagnostic Instruments Inc.SPOT RT3
Diagnostic Instruments Inc.SPOT 5.1 Avancé
Logiciel d’imagerie

Références

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  3. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
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Mots-clés

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