Article de méthode

Analyse quantitative et caractérisation des lésions d'athérosclérose dans le murin aortique Sinus

DOI :

10.3791/50933

⸱

7 décembre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons des procédures pour quantifier et caractériser les lésions athéroscléreuses dans des modèles murins en utilisant une section de précision du sinus aortique et de l’aorte ascendante combinée à une analyse histochimique et immunohistochimique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’athérosclérose est une maladie des grosses artères et une cause sous-jacente majeure d’infarctus du myocarde et d’accident vasculaire cérébral. Plusieurs modèles murins différents ont été développés pour faciliter l’étude de la physiopathologie moléculaire et cellulaire de cette maladie. Dans ce manuscrit, nous décrivons des techniques spécifiques pour la quantification et la caractérisation des lésions athéroscléreuses du sinus aortique murin et de l’aorte ascendante. L’avantage de cette procédure est qu’elle fournit une mesure précise de la section transversale et du volume total de la lésion, ce qui peut être utilisé pour comparer la progression de l’athérosclérose dans différents groupes de traitement. Cela est possible grâce à l’utilisation des feuillets valvulaires comme repère anatomique, ainsi qu’à un réglage minutieux de l’angle de section. Nous décrivons également les méthodes de coloration de base qui peuvent être utilisées pour commencer à caractériser la progression de l’athérosclérose. Ceux-ci peuvent être modifiés pour étudier des antigènes d’intérêt spécifique pour le chercheur. Les techniques décrites sont généralement applicables à une grande variété de modèles d’athérogenèse diététiques et génétiquement induits existants et nouvellement créés.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des deux dernières décennies, le développement et l’utilisation de modèles de souris sujettes à l’athérosclérose par manipulation alimentaire et/ou génétique ont considérablement amélioré notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement des lésions athéroscléreuses1-3. Une grande partie de nos connaissances et de notre compréhension de l’athérogenèse provient d’études menées sur des souris déficientes en apolipoprotéine (Apo)-E4 chez lesquelles des lésions athéroscléreuses se développent spontanément et déficientes en récepteurs de lipoprotéines de basse densité (LDLR)-5 souris, chez qui l’athérosclérose est induite par l’alimentation. Un avantage important de ces modèles est qu’ils permettent d’étudier un nombre relativement important d’animaux génétiquement définis dans des conditions alimentaires et environnementales contrôlées. De plus, les lésions athéroscléreuses avancées qui se développent chez certaines de ces souches de souris semblent être très similaires à celles observées chez les sujets humains, contenant des noyaux nécrotiques remplis de lipides et des coiffes fibreuses. L’athérosclérose se développe rapidement dans ces modèles murins, ce qui rend très réalisable l’étude du développement des lésions, de la traînée graisseuse à la plaque avancée, en quelques semaines. De plus, il a été démontré que les facteurs de risque connus de maladies cardiovasculaires chez l’homme, notamment le diabète6, la dyslipidémie7, l’obésité8, l’hypertension9, la fumée de cigarette10 et un environnement sédentaire11, accélèrent davantage le développement des lésions.

Dans la plupart, sinon tous les modèles de souris sujettes à l’athérosclérose, le développement de lésions peut être détecté pour la première fois au niveau du sinus aortique. Le moment d’apparition dépend de la tension et du régime alimentaire de la souris. Au fur et à mesure que les lésions augmentent en taille, elles ont tendance à développer l’aorte ascendante. Chez les souris ApoE-/- et LDLR-/-, le développement ultérieur de lésions peut être détecté au niveau des bifurcations aortiques dans l’arc aortique, dans l’aorte descendante et dans d’autres artères plus grandes12-14. Le Dr Beverly Paigen et ses collègues, en plus de développer certains des premiers modèles d’athérosclérose induite par l’alimentation, ont également établi un test pour la quantification des lésions athéroscléreuses au niveau du sinus aortique qui est devenu la norme de mesure des lésions dans les modèles murins15. Au fil des ans, cette technique a été affinée et décrite en détail16. Nous présentons ici une version modifiée de la « méthode Paigen » pour la quantification et la caractérisation des lésions athéroscléreuses chez la souris. L’analyse de coupes aortiques en série à partir d’une région vasculaire spécifique et dans une orientation définie et fixe, facilite la collecte de données précises et permet de détecter avec précision les variations de développement des lésions dans différents groupes de traitement. Les méthodes présentées ici s’appuient sur les techniques précédentes. Plus précisément, nous décrivons comment la caractérisation des lésions en termes de surface, de volume, de contenu nécrotique et cellulaire est possible grâce à l’examen de coupes en série à l’aide d’une combinaison d’histochimie et d’immunohistochimie.

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Protocole

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Le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université McMaster a préapprouvé toutes les procédures décrites dans le présent document.

1. Récolte du cœur et de l’aorte

  1. Anesthésie la souris et ouvre soigneusement la cavité thoracique pour révéler le cœur et l’aorte proximale.
    1. Extraire le sang de la souris par ponctuation directe du ventricule droit du cœur.
      Remarque : Le sang peut être stocké et utilisé pour l’analyse des lipides plasmatiques et d’autres facteurs transmissibles par le sang.
  2. Euthanasier la souris par luxation cervicale.
  3. Rincer le système vasculaire avec 5 ml de solution saline.
    Remarque : Ceci est accompli par perfusion par gravité par une ponction à l’aiguille dans le ventricule gauche. Pour permettre le drainage, une petite incision est pratiquée dans l’oreillette droite. Après le rinçage du système vasculaire, des échantillons de tissus hépatiques, musculaires et adipeux peuvent être prélevés, congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 ºC pour une analyse future.
  4. Le système vasculaire est fixé par perfusion gravitaire dans le ventricule gauche avec 10 % de formol tamponné neutre.
    Remarque : Une fois la perfusion commencée, le débit de formol tamponné neutre à 10 % est ajusté à un goutte-à-goutte lent de sorte que le processus prend 1 à 2 min. Les organes et les tissus qui ont été fixés par perfusion peuvent être utilisés pour l’étude de l’expression des protéines par immunofluorescence ou histochimie, mais ils ne peuvent généralement pas être utilisés comme échantillons pour le western blot ou pour l’étude de l’expression génique.
  5. Extraire avec précaution le cœur et environ 2 mm de l’aorte proximale de la carcasse. D’autres tissus, y compris l’aorte descendante, peuvent être prélevés et stockés pour une analyse ultérieure.
    Remarque : L’aorte descendante (à la bifurcation iliaque) peut également être utilisée pour examiner l’athérosclérose.
  6. Faites une coupe transversale avec un scalpel sur le cœur retiré de manière perpendiculaire à l’aorte ascendante.
    Remarque : L’utilisation d’un microscope à dissection facilite cette opération et peut être réalisée efficacement en coupant le long d’une ligne droite reliant les extrémités inférieures des oreillettes droite et gauche (figure 1).
  7. Stockez la partie apicale (supérieure) du cœur dans une cassette d’enrobage et immergez-la dans du formol tamponné neutre pour le traitement.

2. Préparation de l’aorte

  1. Placez la cassette avec le tissu disséqué dans le processeur de tissus.
  2. Traiter les échantillons de tissus.
    Remarque : En général, les processeurs de tissus sont programmés pour fonctionner la nuit en raison de la durée de l’opération et des solutions impliquées dans ce processus. Les échantillons sont traités selon un protocole établi :
    1. 10 % de formol neutre tamponné pendant 1 heure à 42 ºC.
    2. 10 % de formol neutre tamponné pendant 1 heure à 42 ºC.
    3. 70 % d’éthanol pendant 30 min à 40 ºC.
    4. 85 % d’éthanol pendant 30 min à 40 ºC.
    5. 100 % éthanol pendant 45 min à 40 ºC.
    6. 100 % éthanol pendant 45 min à 40 ºC.
    7. 100 % éthanol pendant 45 min à 40 ºC.
    8. Xylène pendant 1 heure à 40 ºC.
    9. Xylène pendant 1 heure à 40 ºC.
    10. Xylène pendant 1 heure à 40 ºC.
    11. Cire de paraffine pendant 45 min à 63 ºC.
    12. Cire de paraffine pendant 45 min à 63 ºC.
    13. Cire de paraffine pendant 45 min à 63 ºC.
    14. Cire de paraffine pendant 45 min à 63 ºC.
  3. Faites fondre la cire de paraffine pendant la nuit à 62 ºC (Figures 1D-E). Estimez la quantité totale de cire de paraffine à utiliser en fonction des grammes de cire de paraffine nécessaires pour remplir un moule d’histologie et du nombre de blocs à préparer.
    Remarque : Un moule histologique profond est préféré à un moule peu profond car il offre un angle de rotation potentiel plus large lors de la section. Un seul moule d’histologie profonde nécessite 11 g de cire de paraffine.
  4. Placez chaque tissu traité dans un moule d’histologie profond, puis versez de la cire de paraffine fondue pour remplir complètement le moule (Figure 1F). Couvrez le moule à l’aide d’une cassette en plastique étiquetée (Figure 1G).
  5. Refroidissez le moule rempli sur de la glace, ou sur une surface froide (Figure 1H), afin de créer le bloc solide et de séparer le bloc du moule (Figures 1I-J).
    Remarque : Lorsque vous placez le cœur disséqué dans le moule, assurez-vous que la face intérieure du cœur touche la base du moule, puis remplissez le bloc de paraffine fondue. Une cassette en plastique étiquetée recouvre le moule avant qu’il ne se solidifie afin de fournir une base pour manipuler le bloc. Une fois refroidi, le moule est retiré et les blocs de paraffine peuvent être conservés indéfiniment à température ambiante.

3. Section de l’aorte

  1. Positionnez le bloc avec le cœur dans le porte-échantillon du microtome de manière à ce qu’il puisse être sectionné de l’intérieur vers le haut du cœur (figure 2)
  2. Ajustez le microtome pour couper une section d’une épaisseur de 10 μm et procédez à la section du cœur.
  3. Prélevez des sections sur une lame de verre et examinez-les au microscope optique pour déterminer la position et l’orientation.
  4. Lorsque 1 ou 2 valves du sinus aortique deviennent évidentes, ajustez l’angle du bloc si nécessaire (Figure 3A).
    Remarque : Le sinus doit apparaître comme trois bases de valve bipartites avec des folioles attachées. Si seulement un ou deux détracts de la valve sont observés, l’angle de coupe doit être ajusté en conséquence.
  5. Ajustez le microtome pour couper à 4-5 μm et collectez les sections sur des lames de verre revêtues.
    Remarque : Bien que la procédure puisse être variée, une approche systématique est recommandée, par laquelle les 10 premières sections, du sinus aortique progressant vers le haut de l’aorte ascendante, sont collectées sur la partie supérieure d’une lame de verre étiquetée (lames étiquetées 1-10). Les coupes suivantes sont prélevées selon le même schéma : #11-20, #21-30, #31-40 jusqu’à ce que les lésions athéroscléreuses ne soient plus observées (Figure 3B). De cette façon, les lésions athéroscléreuses peuvent être examinées et caractérisées à des endroits précis le long de l’aorte ascendante. Par exemple, la diapositive 1 contient les sections 1, 11, 21, 31, 41 et 51, représentant les lésions athéroscléreuses du sinus aortique jusqu’à l’aorte ascendante. Des lames supplémentaires, étiquetées 11-20, peuvent être incluses si la lésion est grande, pour recueillir plus de coupes distales en suivant le même modèle.
  6. Continuez à prélever des coupes jusqu’à ce qu’aucune lésion athéroscléreuse ne soit observée.
    Remarque : Les lames peuvent être conservées à température ambiante pendant des mois, avant une analyse plus approfondie.

4. Coloration et quantification des lésions athéroscléreuses

Les lésions athéroscléreuses peuvent être analysées de différentes manières à l’aide de diverses techniques. L’analyse la plus élémentaire consiste à déterminer la section transversale de la lésion. Afin de comparer avec précision la surface de la lésion, il est important que le point de départ de la mesure des lésions soit cohérent d’un échantillon à l’autre. Ceci est facilité par l’utilisation des dépliants de la valve pour l’orientation. Pour faciliter l’identification et la quantification précises de la zone de la lésion, certaines coupes efficaces sont colorées à l’hématoxyline et à l’éosine. Il s’agit d’immerger les lames dans une série de solutions pendant des durées déterminées, qui déparaffiniser/colorer les tissus.

Protocole pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine :

  1. Mettez les lames dans le séchoir à air pendant 8 min puis déparaffinisez les sections en lavant 4× au xylène, pendant 3 min par lavage.
  2. Lavez les lames à 100 % d’éthanol 3× pendant 3 min chacune.
  3. Lavez 3× dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 min chacun, puis 2× dans de l’éthanol à 50 % pendant 3 min chacun.
  4. Rincer à l’eau distillée puis immerger dans l’hématoxyline de Mayer pendant 15 min.
  5. Laver à l’eau courante du robinet pendant 5 min, puis laver à l’eau distillée pendant 5 min.
  6. Immerger dans Eosin Y pendant 1 à 5 min.
  7. Laver à l’eau distillée 3× pendant 5 min chacun, laver à l’éthanol à 50 % 2× pendant 2 min chacun, puis à l’éthanol à 70 % 3× pendant 2 min chacun.
  8. Laver à 100 % éthanol 3× pendant 2 min chacun, puis laver au xylène 4× pendant 2 min chacun.
  9. Montez des sections à l’aide d’un support de montage à base de xylène et capturez des images à l’aide d’un appareil photo numérique monté sur un microscope optique.
  10. Identifier et quantifier la surface de la lésion à l’aide d’un logiciel d’imagerie.
    Remarque : La zone de la lésion peut être déterminée à des distances spécifiques du sinus aortique à des intervalles de 40 à 50 μm (en fonction de l’épaisseur de chaque section). Un graphique de ces mesures de surface en fonction de la distance donne un profil de la lésion athéroscléreuse (Figure 4). L’aire sous la courbe représente une estimation du volume total de la lésion athéroscléreuse. Une caractérisation supplémentaire de la lésion peut inclure la détermination de la zone nécrotique. Le noyau nécrotique (nc) d’une lésion avancée est formé de cellules spumeuses apoptotiques. Avec de la pratique, cela peut être déterminé en examinant les régions acellulaires des sections colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (Figure 4A). Les lésions précoces ont tendance à avoir très peu de nécrose tandis que les lésions plus avancées ont des zones nécrotiques accrues qui peuvent contribuer à l’instabilité de la plaque. Des coupes en série de la même aorte doivent être examinées pour confirmer la présence d’une région nécrotique.

5. Caractérisation plus poussée de la lésion athéroscléreuse

Des détails spécifiques concernant le stade de développement de l’athérosclérose peuvent être déterminés par coloration avec des anticorps dirigés contre des types de cellules ou des marqueurs spécifiques. L’immunohistochimie sur des coupes de paraffine est une technique standard qui est utilisée pour identifier des types ou des marqueurs cellulaires spécifiques dans le contexte du tissu non coloré environnant. La détection de l’antigène est généralement réalisée à l’aide d’un substrat de peroxydase de raifort.

La coloration par immunofluorescence implique l’utilisation d’anticorps conjugués aux fluorophores et nécessite un microscope à fluorescence et des filtres appropriés pour la détection. Cette technique permet de colorer simultanément deux (ou plus) antigènes.

Protocole général pour la coloration immunohistochimique :

  1. Placez les lames dans l’air séchant pendant 8 min.
  2. Déparaffiniser les sections en 4 changements de xylène, 3 min each.
  3. Laver à 100 % d’éthanol 3× pendant 3 min chacun pour éliminer le xylène.
  4. Lavez 3× dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 min chacun, puis 2× dans de l’éthanol à 50 % pendant 3 min chacun.
  5. Laver à l’eau distillée 5 min chacun, puis laver 3× dans du PBS pendant 5 min chacun.
  6. Effectuer la récupération de l’antigène. Cela peut être accompli à l’aide de la méthode HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) dans un autocuiseur à micro-ondes et une solution de récupération d’antigène (tampon de citrate de 10 mM, pH 6,0).
    Remarque : Le processus de fixation du formol peut masquer les antigènes d’intérêt. D’après notre expérience, le HIER améliore considérablement les performances de certains anticorps, mais n’est pas nécessaire pour d’autres. De plus, il existe d’autres alternatives à la méthode HIER de récupération d’antigènes.
  7. Lorsque l’autocuiseur a refroidi, placez les lames dans PBS pendant 15 min.
  8. Incuber des sections dans du sérum normal (de la même espèce que celle dont l’anticorps secondaire est dérivé) pendant 30 min. NE PAS LAVER LES LAMES - VIDER LE SÉRUM.
  9. Incuber avec l’anticorps primaire dilué dans un sérum bloquant normal pendant 2 heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
  10. Laver avec du PBS 3× pendant 5 min chacun.
  11. Incuber des sections avec l’anticorps secondaire biotinylé qui a été dilué dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante.
  12. Incuber les lames avec de la peroxydase de raifort streptavidine pendant 30 min, puis laver avec du PBS 3× pendant 5 min chacune.
  13. Réaction chromogène - incuber les lames dans du DAB frais (3,3'-diaminobenzidine) pendant 5 à 30 min. Cette réaction doit être surveillée à l’aide d’un microscope. Arrêtez la réaction en lavant les lames à l’eau du robinet.
  14. Contre-teinture à l’hématoxyline pendant 1 min. Laver à l’eau du robinet pendant 5 min, puis laver à l’eau distillée 3× pendant 5 min chacun.
  15. Répétez les étapes 4.7-4.9 pour le montage des glissières.

6. Protocole général pour la coloration par immunofluorescence

Un protocole similaire, avec des modifications mineures, peut être suivi pour la coloration par immunofluorescence.

  1. Placez les lames dans le séchoir à air pendant 8 minutes, puis déparaffinisez les sections en 4 changements de xylène, 3 minutes chacun.
  2. Laver à 100 % d’éthanol 3× pendant 3 min chacun pour éliminer le xylène.
  3. Lavez 3× dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 min chacun, puis 2× dans de l’éthanol à 50 % pendant 3 min chacun.
  4. Laver à l’eau distillée pendant 5 minutes chacun, puis laver au PBS 3× pendant 5 minutes chacun.
  5. Effectuer la récupération de l’antigène. Cela peut être accompli à l’aide de la méthode HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) dans un autocuiseur à micro-ondes et une solution de récupération d’antigène (tampon de citrate de 10 mM, pH 6,0).
    Remarque : Le processus de fixation du formol peut masquer les antigènes d’intérêt. D’après notre expérience, le HIER améliore considérablement les performances de certains anticorps, mais n’est pas nécessaire pour d’autres. De plus, il existe d’autres alternatives à la méthode HIER de récupération d’antigènes.
  6. Lorsque l’autocuiseur a refroidi, placez les lames dans PBS pendant 15 min.
  7. Incuber des sections dans du sérum normal (de la même espèce que celle dont l’anticorps secondaire est dérivé) pendant 30 min. NE PAS LAVER LES LAMES - VIDER LE SÉRUM.
  8. Incuber avec l’anticorps primaire dilué dans un sérum bloquant normal pendant 2 heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
  9. Laver avec du PBS 3× pendant 5 min chacun.
  10. Ajoutez un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore qui est dilué dans un sérum bloquant normal (ou PBS). Incuber pendant 1,5 heure à température ambiante.
  11. Laver avec du PBS 3× pendant 5 min chacun.
  12. Contre-teinture avec DAPI.
  13. Laver au PBS 3× pendant 5 min chacun.
  14. Appliquez une lamelle à l’aide d’un support de montage anti-évanouissement.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 Des souris LDLR-/- âgées de cinq semaines ont été nourries avec un régime standard ou un régime riche en matières grasses pendant dix semaines. Les souris ont été sacrifiées et perfusées avec du formol, comme décrit ci-dessus. Des coupes transversales du sinus aortique ont été préparées et colorées à l'hématoxyline et à l'éosine afin de déterminer la surface et le volume des lésions (Figure 4). Lorsque les souris sont nourries avec un régime standard, le développement athéroscléreux est très limité...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’athérosclérose est une maladie chronique complexe des grosses artères musculaires qui est une cause sous-jacente majeure d’infarctus du myocarde et d’accident vasculaire cérébral. La progression de la maladie implique l’interaction de nombreux types de cellules différents dans la paroi artérielle, avec les cellules sanguines circulantes, les particules de lipoprotéines et d’autres facteurs transmissibles par le sang que nous commençons à peine à comprendre. Une grande partie de nos connaissances actuelles concernant le...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par une subvention de fonctionnement des Instituts des sciences de la santé du Canada et de l’Association canadienne du diabète. DEV est soutenu par une bourse de la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chili).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
souris déficientes en LDLR  ;( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)The Jackson Laboratorystock #002207
FormalinSigma-AldrichHT5011
Histologie MoulesTed Pella Inc27195
Paramatte Paraffine19286-10
Lames enduitesFisher12-550-15
Conteneurs de solvantTissue Tek II4457
MicrotomeLeicaRM22S5
Bain-marieVWR80086-982
MicroscopeOlympusBX41TF
Appareil photoOlympusDP72
ImageJNIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
ProcesseurSakura FinetekVIP6-A1
Cassettes d’usinageVWR18000-134
Pré-cuisinièreNordic Ware
CoverslipFisher12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
Lame microtomeThermo Scientific30-518-35
Support de montage anti-décolorationSigma-AldrichF-4680
Montage Xylène moyen  ;Sigma-Aldrich44581
Milieu de montage AquousSigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4/80anticorps AbcamAb6640
Anticorps contre l’alpha-actineSanta Cruz BiotechnologySC-32251
Mayer’ s HématoxylineSigma-AldrichE4382
Eosin YSigma-AldrichMHS16
DAB (3,3'-Diaminobenzidine)DakoK3468

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Coupe histologiqueinclusion en paraffinecoloration l h matoxyline et l osineanalyse immunohistochimiquequantification des l sionsmod le murin LDLRr gime riche en graisses

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