Amélioration de la méthode pour la préparation d'une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

Résumé

Création de modèles humains de la barrière hémato-encéphalique (BHE) peut bénéficier des recherches sur les conditions du cerveau associées à l'échec du Bureau. Nous décrivons ici une technique améliorée pour la préparation d'un modèle de BBB de contact, ce qui permet de co-culture d'astrocytes humains et les cellules endothéliales du cerveau sur les côtés opposés d'une membrane poreuse.

Résumé

La barrière hémato-encéphalique (BHE) comprend capillaires du cerveau imperméables mais adaptables qui contrôlent étroitement l'environnement du cerveau. L'échec de la BHE a été impliqué dans l'étiologie de nombreuses pathologies cérébrales, créant un besoin de développement des ressources humaines dans des modèles in vitro BBB pour aider à la recherche cliniquement pertinentes. Parmi les nombreux modèles BBB décrites à ce jour, un statique (sans écoulement), contactez modèle du Bureau, où les astrocytes et les cellules endothéliales du cerveau (BEC) sont co-cultivées sur les côtés opposés d'une membrane poreuse, est apparue comme un système encore authentique simplifié pour simuler la Bureau avec une capacité de criblage à haut débit. Néanmoins, la production de ce modèle présente quelques défis techniques. Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation d'un modèle du Bureau contact humain en utilisant une nouvelle combinaison de BEC humains primaires et les astrocytes humains immortalisés. Plus précisément, nous détaillons une méthode innovante de culture des cellules sur des inserts inversées ainsi que indiquons insertiontechniques de coloration de t et illustrent la façon dont nous utilisons notre modèle pour la recherche du Bureau liées.

Introduction

Le Bureau est une interface spécialisée entre la circulation du sang périphérique et le système nerveux central, cruciale responsable de l'entretien de cerveau hémostase. Il comprend des cellules distinctes du cerveau endothéliales microvasculaires (BEC) qui sont fonctionnellement influencée par quelques composants cellulaires et acellulaires (ci-dessous) pour former un passage étanche et dynamique dans le cerveau. Dans les conditions physiologiques du Bureau restreint le passage des cellules du sang, les composants du plasma et des substances nocives, tous potentiellement neurotoxique, dans le cerveau. En parallèle, le Bureau échange sélectivement des ions et des éléments nutritifs (glucose et des amino-acides) et des clés de produits de déchets métaboliques entre le cerveau et la circulation de maintenir avec précision l'environnement de ^1,2 cerveau. Ces dernières années, il est devenu évident que l'échec de la BHE a lieu dans une variété de pathologies cérébrales chroniques telles que les maladies neuro-dégénératives ou inflammatoires liées (par exemple la maladie d'Alzheimer et multiple sclérose, respectivement) ^3, ainsi que dans les maladies aiguës, comme un AVC ischémique ^4.

Les propriétés uniques de la BBB cellules endothéliales cérébrales (BEC) sont en grande partie induites par leur environnement cérébral ^5, et en particulier par les astrocytes ^6,7. Il existe une prise de conscience croissante que d'autres types de cellules, telles que les pericytes ^8, les neurones et les microglies ^1,3, ainsi que la membrane basale ^9, supportent les CEB et forment ensemble une unité fonctionnelle appelée "unité neurovasculaire" (NVU) qui simultanément couples neuronale besoins métaboliques de leurs capillaires fournissant ^10.

La participation du Bureau dans des situations pathologiques sous-tend de nombreuses tentatives pour développer des modèles in vitro BBB pour aider dans la recherche du Bureau liées à ^11,12. Ces modèles ont pour but d'imiter aussi près que possible des caractéristiques BBB in vivo selon le principe NVU. In vitro BBB modèles reposent généralement sur ​​une monocouche de BEC étanche jonction de formation (principalement des bovins ^{13, 14} humain, le rat ^{15, 16} souris, et porcine ^17,18 origines), cultivées sur une membrane poreuse avec l'appui des astrocytes (largement examiné par Deli et al. 2005 ^11).

Les astrocytes peuvent être cultivées dans des conditions de non-contact sur ​​le fond d'une culture de tissu et, séparé de BEC (cultivées sur la surface supérieure de la membrane) par le milieu de culture pour l'instant des communications avec les CEB par des facteurs solubles ^16. Dans les modèles plus avancés qui ressemblent mieux la structure anatomique de la BHE in vivo, les astrocytes sont maintenues dans des conditions de contact et cultivées directement sur ​​le côté opposé de la membrane à proximité de BEC ^13,15,17 (figure 1). Cette configuration permet un contact physique entre les CAE et les astrocytes, établie quand les astrocytes projetleurs processus à travers la membrane poreuse. Il est important, pour un vrai contact pour produire les pores doivent être ≥ 1 um de diamètre, puisque pieds astrocytaires peuvent pas passer à travers des tailles de pores de petite taille (0,4 um) ^14,15. Notamment, les systèmes de contact de BBB sont démontrés dans des études pour être supérieurs à leurs homologues non-contact en ce qui concerne leur résistance électrique trans-endothéliale (TEER) et les valeurs de perméabilité endothéliales de différents traceurs ^13,17,18. Une dimension supplémentaire du flux média a été ajouté récemment dans un certain nombre de modèles in vitro BBB pour appliquer des forces de cisaillement à l'endothélium pour la simulation proche de la vascularisation cérébrale ^12,19.

Un obstacle technique à surmonter lors de la génération d'un modèle de contact avec la BHE est l'ensemencement des astrocytes contre la gravité sur la surface abluminale de la membrane poreuse. Protocoles antérieurs ^13,20, où les astrocytes ont été tout simplement ensemencées dans une goutte de médias sur le dessus d'un àinsert convertis, permis fois seulement à court de semis (soit 10 min ¹³ ou 2 h ²⁰⁾ qui ont été trouvées dans nos mains pour être insuffisant pour la fixation des cellules appropriée. En utilisant cette méthode de base, une plus longue période de fixation des astrocytes nécessite une surveillance constante des inserts par l'ouverture fréquente de l'incubateur (causant des fluctuations de température, le pH et l'humidité) et est également sujette à l'ensemencement des cellules inégale due à une fuite de médias à travers les pores, en particulier si les pores de plus de 1 um sont utilisés.

Ici, nous décrivons un protocole général pour la préparation d'un modèle de contact de Bureau. Notre procédure inclut une méthode alternative pour en culture des cellules sur des inserts inversées, qui traite les limitations mentionnées ci-dessus. Le procédé permet l'adhérence non perturbée des astrocytes sur la surface de la membrane abluminale, dans un incubateur équilibré, pour une période de temps prolongée. En conséquence, un ensemencement uniforme d'astrocytes est atteint ce qui augmente la qualité de la barrièreet minimise les variations de perméabilité entre les inserts basales.

Comme l'utilisation de cellules humaines est importante pour la recherche de l'homme pertinents ^21, nous démontrons en outre dans cet article l'utilisation spécifique d'une nouvelle combinaison de BEC humains primaires et immortalisé astrocytes humains pour l'établissement d'un modèle du Bureau contact humain avec une capacité de criblage à haut débit . Depuis l'affichage de cellules sur des membranes poreuses peut être, nous avons aussi des techniques de coloration de détail difficiles qui peuvent aider dans la détermination de la confluence et la morphologie des cellules sur les membranes poreuses. Enfin, nous illustrons comment notre modèle BHE humaine peut être utilisée pour examiner l'effet de type activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) - une enzyme thrombolytique qui sert comme une option de traitement unique pour l'AVC ischémique aigu - le Bureau.

Protocole

Une. Culture cellulaire (3-7 jours avant l'Assemblée Bureau)

1.1. Les cellules endothéliales microvasculaires humaines cerveau primaires (BEC)

CAE ont été obtenus dans le commerce. Les cellules ont été produites par dissociation dispase de tissu cérébral humain de cortex normal et pour autant figé au passage 3 (<12 doublements de population).

1. Substrat: navires Manteau de culture de tissus avec "facteur d'attachement» selon les instructions du fabricant.
2. entretien cellulaire: Maintenir BEC dans un milieu complet contenant du sérum. Pour l'expérimentation, de la culture BEC dans un milieu sans sérum complet. Maintenir les cellules dans un humidifiée à 5% _de CO2, 21% d'O ₂ incubateur à 37 ° C
   Remarque: Comme alternative aux réactifs spécialisés, 0,1% (p / v) de solution de gélatine peut servir de réactif de revêtement tout en DMEM/F-12 complété avec HEPES 15 mM, 10% (v / v) de sérum de veau foetal (SVF), 2 mM de L-glutamine, 50 pg/ Ml de gentamicine, 20 pg / ml d'héparine et 20 ug / complément de croissance des cellules endothéliales ml peuvent être utilisées pour l'entretien BEC.
3. Sous-culture de l'expérimentation: BEC confluentes de Split dans un rapport de 1:3 à 1:6 en fonction de l'heure prévue pour la prochaine utilisation (3-7 jours). Changer le support d'entretien tous les 3 jours. Utilisez BEC jusqu'à 15 passages.

1.2. SVG humain fœtal astrogliale Cell-ligne

SVG cellules astrocytes foetaux humains ²² étaient issues de cultures primaires de cerveau fœtal humain transformé avec réplication déficiente virus simien 40.

1. Entretien: Les cellules de la culture SVG dans du milieu essentiel minimum avec une solution saline équilibrée de Earle additionné de 20% (v / v) de SVF (même pourcentage de sérum utilisé pour maintenir leurs cellules primaires parentales ^22), 2 mM de L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine. Maintenir les cellules dans un humidifiée à 5% _de CO2, 21% d'O ₂ incubateur à 37 ° C.
2. Sous-culture de l'expérimentation: SVG confluentes de Split dans un rapport de 1:5 à 1:10, en fonction de l'heure prévue pour la prochaine utilisation (3-7 jours). L'élimination de la trypsine n'est pas nécessaire en raison de la teneur élevée de sérum dans le milieu. Changer le milieu tous les 3 jours. Utilisez SVG jusqu'à 20 passages.

2. Assemblée et co-culture de l'humain in vitro du Bureau Modèle (jour 0)

Commentaire: L'humain in vitro modèle contact du Bureau est préparé selon des protocoles publiés ^13,23, avec des modifications.

2.1. Revêtement de Inserts

1. Placez inserts de culture de tissus (6,5 mm de diamètre avec polyester membrane poreuse, 3 um taille des pores) dans les puits de la plaque de 24 puits fourni. Enduire la surface luminale des inserts pendant une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec du collagène de rat I (20 ug / cm ^2; 50 ul de 132 pg/ Ml de collagène I dans de l'acide acétique à 0,02% dans de l'eau Milli-Q (MQH ₂ O)). Laver les inserts fois (à la fois du côté abluminale et luminale) avec MQH ₂ O pour éliminer l'acide résiduel.
   Remarque: La membrane basale des capillaires du cerveau ne contient pas de collagène I, mais surtout des laminines, des isoformes de collagène de type IV, nidogens, et les protéoglycanes de sulfate d'héparane ^9. Pour cette raison, certains chercheurs utilisent des agents de revêtement tels que le collagène IV, la fibronectine ¹³ ou Matrigel (biosciences BD) ¹⁶ pour une modélisation plus authentique du Bureau.

2.2. SVG semis sur la face inférieure (abluminale) Membrane Surface

1. Inversez l'insert et monter doucement autour de la jante de la membrane poreuse un court morceau de tube en silicone élastique ("tube externe"; ~ 10 mm de long, 8 mm de diamètre intérieur de 1,6 mm mur), essentiellement la création d'un nouveau bien au-dessus de la surface abluminale (Figure 2A).
2. La face inférieure de l'insert de needs à sceller pour éviter la fuite des médias. Tout d'abord, à préparer une prise (figure 2A et 2B) constituée d'un tube en silicone (appelé "tube interne"; ~ 8 mm de long, 3,2 mm de diamètre intérieur, 1,6 mm de paroi, la figure 2B), scellé à une extrémité avec un cône d'étanchéité en matière plastique (~ 3 mm de long; préparé en coupant le fond d'une réaction en chaîne de 0,2 ml de la polymérase (PCR) de tube, la figure 2B). Ce cône non seulement assure l'étanchéité de la lumière de tubes internes, mais aussi élargit son bord pour le montage serré dans l'insert. Ensuite, en utilisant une pince stérile, insérer le bouchon de silicone dans la cavité luminale et avance jusqu'à ce qu'il atteigne la mise à ~ 1-2 mm à partir de la membrane (Figure 2A).
3. Ensuite, semences 4 x 10 ⁴ cellules SVG dans 200 milieu d'entretien de SVG pi (soiction 1.2.2 ci-dessus) directement dans la silicone bien au-dessus de la surface de la membrane abluminale (Figure 2A). Permettre SVG à adhérer pendant au moins 4 heures dans l'incubateur.
   Remarque: pour maintenir la stérilité de transporter les inserts assemblés entre deux plaques de 6 puits (une plaque inversée sur l'autre; Figure 2C) pour minimiser l'exposition à l'air non filtré au cours de la procédure. des tubes et des bouchons en silicone sont lavées dans de l'éthanol et à l'autoclave pour une utilisation ultérieure.
   Remarque: Utilisez des bouchons (section 2.2.2) que pour les insertions avec pores de la membrane taille est supérieure à 1 um. Membranes d'un diamètre de pores ≤ 1 um fuite et ne nécessitent que rarement le raccord de la tubulure en silicone externe (section 2.2.1). En outre, certains agents d'enrobage autres que le collagène I (voir la note à la section 2.1) peuvent empêcher leakiness même à travers 3 pm pores. Déterminez ce de manière empirique.
4. Afin de surveiller l'état de vos astrocytes de respect, de semences en parallèle dans96 puits un volume identique niveau de l'astrocyte suspension cellulaire. Ce bien a la même surface que l'insert 6,5 mm (0,33 cm ²⁾ et permet une visualisation plus facile des cellules par microscopie à contraste de phase de la membrane de l'insert. Lorsque vous observez une adhérence suffisante de l'astrocyte dans le contrôle de 96 puits, les astrocytes ont bien adhéré aussi à la membrane de l'insert.
5. Lorsque les astrocytes ont suffisamment respectées dans le contrôle de 96 puits, transférer les ensembles d'insertion à la hotte de culture de tissus (voir la note ci-dessus) et retirez délicatement le tube et les bouchons de silicone externe. Inserts revenir à l'(c.-à-droite) orientation normale dans les puits contenant 800 fournis pl / puits de milieu de maintenance BEC (section 1.1.2 ci-dessus).

2.3. Ensemencement des CAE dans la Chambre Luminal dessus des astrocytes

Semences 2x10 ⁴ BEC dans 200 pi sur la surface luminale collagène enduit et de restituer le insécuritérts dans l'incubateur.

2.4. Co-culture

Co-cultiver les inserts SVG / BEC graines pendant 3 jours dans un milieu BEC sans changement de support avant l'expérimentation.

3. Expérimentation avec le modèle du Bureau humain (Jour 3)

1. Pour stimuler in vitro BBB cellules de lavage dans les premiers en remplaçant les médias abluminales et luminal avec 600 ul et 100 ul de milieu sans sérum BEC, respectivement.
2. Aspirer le milieu luminale et remplacer de nouveau avec 100 ul de milieu sans sérum avec des agents stimulants.
   Remarque: si la stimulation de la chambre abluminale est nécessaire (pour activer le vitro Bureau à partir du compartiment astrocytaire), aspirer le milieu abluminale et la remplacer par 600 ul de milieu sans sérum avec des agents stimulants.
3. Testez chaque groupe expérimental en trois exemplaires (donc, si la stimulation luminale est effectuée, qui nécessite 3 x 100 pi, nous vous conseillons de diluer la re agents à leurs concentrations finales dans 350 ul de milieu sans sérum par groupe afin de minimiser les erreurs de pipetage entre les puits).
4. Effectuer paracellulaire standard et / ou des dosages de perméabilité transcellulaire des traceurs marqués ^16,24 (pour ce dernier, nous utilisons l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué à de l'albumine) et / ou la mesure de la TEER ^13,16,25 comme décrit précédemment.

Pour tenir compte des fluctuations de la perméabilité à la ligne de base entre les expériences, analyser les variations de la perméabilité par rapport à un insert enrobé sans cellules (qui sert de référence pour la perméabilité maximale) et au groupe traité avec le véhicule en utilisant la formule: perméabilité (% du max) = ( La valeur de la perméabilité de l'insert expérimentale - valeur de perméabilité moyen du groupe de véhicule) / (valeur de perméabilité de l'insert blanc - valeur de perméabilité moyen du groupe de véhicule) x 100.

4. Visualisation des cellules sur membranes poreuses

nt "> Commentaire: cellules non colorées sur les membranes d'insertion sont difficiles à observer par contraste de phase ou contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie puisque la membrane est très opaque et interfère avec la transmission de lumière Pour faire face à ce problème, nous avons développé différents procédés de coloration de cellules sur. des inserts, ce qui améliore grandement l'apparence des cellules sur la membrane. Généralement, les membranes tache d'insertion tout en fixées à l'insert, dans les puits. Les membranes doivent être enlevés seulement à la fin de la procédure de coloration à des fins de montage.

4.1. Hematoxylin coloration

1. Fixer des inserts avec glacé à 4% (p / v) de paraformaldehyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; mM NaCl 130, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 10 mM de NaH ₂ PO _4, pH 7,2) pendant 20 min. Laver une fois dans du PBS.
2. Immerger l'insert dans la solution d'hématoxyline de Mayer 0,1% pendant 2 min.
3. Lavez délicatement l'insert avec de l'eau du robinet (en submergeant les tenantsert dans un bécher contenant de l'eau du robinet et pipetage l'excès d'eau). Transférer l'insert à l'eau du robinet de la solution de Scott (2 g / L NaHCO _3, 20 g / L MgSO ₄₎ pour ~ 20 secondes jusqu'à ce que la couleur bleue souhaité se développe. Laver ensuite l'insert avec de l'eau du robinet (section 4.1.3). Une tache d'éosine en option peut être introduit ici par trempage de la plaquette dans une solution d'éosine à 1% pendant 10 s, suivi par un lavage à l'eau du robinet.
4. Air-sécher la membrane d'insertion. L'utilisation d'un scalpel (découpe sur le bord de la membrane) retirer la membrane et le monter sur une lame de verre pour l'imagerie à champ lumineux
   Remarque: Si di-N-butylphthalateinxylene (DPX) milieu de montage est utilisé laver l'insert avec de l'éthanol à 100%, suivi par le xylène avant de retirer et le montage de la membrane.

4.2. Microscope électronique à balayage (MEB)

1. Fixer des inserts avec glacé à 4% (p / v) de PFA dans du PBS pendant 20 min. Laver trois fois dans du PBS.
2. Post-fixer les membranes pendant 30 min dans 1% (w / v) Tétroxyde d'osmium dans MQH ₂ O.
3. Laver les inserts dans l'eau (section 4.1.3) et se déshydrater dans un gradient d'escalade de l'éthanol (50%, 70%, 90% pendant 5 minutes chacun, puis 3 fois avec de l'éthanol à 100% pendant 10 min par intervalle).
4. Traiter inserts déshydratés avec un mélange d'hexaméthyldisilazane (HMDS): éthanol (1:2 puis 2:1 pour 5 min).
5. Traiter avec inserts 100% HMDS pendant 5 min, l'air sec et conserver dans des conditions desséchées.
6. Retirer la membrane à l'aide d'un scalpel (découpe sur le bord de la membrane). Examiner les membranes par microscopie électronique à balayage.

4.3. Immunofluorescence

1. Fixer des inserts avec glacé à 4% (p / v) de PFA dans du PBS pendant 20 min, lavage une fois dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM de NaCl, 0,22 um filtré).
2. Effectuer immunomarquage des cellules sur la membrane de l'insert ^26, comme décrit précédemment.
3. Retirer la membrane à l'aide d'un scalpel (découpe sur le bord de la membrane) et le monter sur agdiapositive jeune fille avec la fluorescence milieu de montage. Examiner membrane par microscopie à fluorescence.

Résultats

Afin d'établir un humain, modèle contact du Bureau, nous avons dû cultiver SVG et BEC sur les membranes poreuses avec un 3 um de taille de pores, montré pour permettre le passage des astrocytes finaux pieds pour le contact avec les cellules endothéliales ^14,15,27,28. Une représentation schématique du modèle de contact complet est illustré à la Figure 1 (illustration de gauche). Le défi technique principal présenté par un système de contact est nécessaire pour ensemencer les astrocytes encontr...

Discussion

La recherche médicale sur les pathologies du cerveau souffre de difficultés de traduction. Dans le domaine de l'AVC ischémique aigu, par exemple, de nombreux médicaments qui ont montré de grandes promesses dans des modèles animaux ont échoué à la clinique ^38,39. Les raisons de ces résultats décevants sont diverses et comprennent l'infidélité des systèmes de test précliniques pour le scénario de la course humaine et surestimation des résultats provenant d'études animales ^21. Une stratégi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Facteur d’attachement	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BEC), primaires, humaines	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Support complet	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Complété par CSC JetFuel
Milieu complet sans sérum	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Complété par CSC RocketFue
DMEM/F-12 avec 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Supplément de croissance des cellules endothéliales (d’origine bovine)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Tube externe en silicone	Watson-Marlow	913.A080.016	Marque Pumpsil, diamètre intérieur 8 mm, paroi 1,6 mm
Sérum fœtal pour veau	Lonza	14-501F
Sulfate de gentamycine	Life Technologies	15750-060
Héparine sodique	Pfizer		1 000 U/ml
Hexaméthyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Tube interne en silicone	Watson-Marlow	913.A032.016	Marque Pumpsil, diamètre intérieur 3,2 mm, paroi 1,6 mm
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer' s solution d’hématoxyline	Amber Scientific	MH
Minimum milieu essentiel avec Earle' s solution saline équilibrée	HyClone Laboratories	SH30244.01
Pénicilline/Streptomycine	Life Technologies	15140
Collagène de rat I	Trevigen	3440-100-01	Marque Cultrex
Inserts de culture tissulaire	Corning Life Sciences	3472	Marque Transwell, 6,5 mm de diamètre, avec membrane poreuse en polyester, 3 & micro ; m taille des pores