Formation de structures ordonnées biomoléculaires par l'auto-assemblage de peptides courts

Summary

Ce document décrit la formation de structures à base de peptides hautement ordonnés par le processus spontané d'auto-assemblage. Le procédé utilise des peptides disponibles dans le commerce et l'équipement de laboratoire commun. Cette technique peut être appliquée à une grande variété de peptides et peut conduire à la découverte de nouveaux assemblages à base de peptides.

Abstract

Dans la nature, des structures fonctionnelles complexes sont formés par l'auto-assemblage de biomolécules dans des conditions douces. Comprendre les forces qui contrôlent l'auto-assemblage et en imitant ce processus in vitro apportera des avancées majeures dans les domaines de la science des matériaux et de la nanotechnologie. Parmi les blocs de construction disponibles biologique, les peptides ont plusieurs avantages, car ils présentent une importante diversité, leur synthèse à grande échelle est simple, et ils peuvent facilement être modifiées avec des entités biologiques et chimiques ^1,2. Plusieurs classes de peptides conçus comme des peptides cycliques, des peptides amphiphiles et des conjugués peptide-s'auto-assembler en structures ordonnées en solution. Dipeptides homoaromatiques, sont une classe de peptides auto-assemblés courtes qui contiennent toutes les informations nécessaires moléculaire pour former des structures ordonnées telles que les nanotubes, des sphères et des fibrilles ^8.3. Une grande variété de ces peptides est disponible dans le commerce. 9 Les protocoles présentés ici peuvent être adaptées à d'autres classes de peptides ou des blocs de construction biologique et peuvent potentiellement conduire à la découverte de nouvelles structures à base de peptides et d'un meilleur contrôle de leur assemblage.

Introduction

formes de la nature et des structures ordonnées fonctionnelle par le processus de l'auto-assemblage biomoléculaire. Comprendre les forces qui régissent ce processus spontané peut conduire à la capacité d'imiter l'auto-assemblage in vitro et par conséquent à des avancées majeures dans le domaine des sciences des matériaux ^10,11. Peptides, en particulier, sont très prometteurs comme un bloc de construction biomoléculaire, car ils présentent grande diversité structurelle, la facilité de la synthèse chimique, et peuvent facilement être fonctionnalisés avec des entités biologiques et chimiques. Le domaine de peptide auto-assemblage a été lancée par Ghadiri et ses collègues, qui ont manifesté l'auto-assemblage de nanotubes de peptides par des peptides cycliques avec une alternance de D-et L-acides aminés ^12. D'autres approches réussies à la conception d'ensembles de peptides comprennent des peptides linéaires de bolaamphiphile ^5, amphiphiles (AP) ^6, les peptides non conjugués auto-complémentaires ioniques ^13, les peptides de type tensioactif ^{4,14, et deux blocs copolypeptides 15.}

Une approche plus récente consiste à l'auto-assemblage de peptides courts aromatiques, appelé dipeptides homoaromatiques. Ces peptides comprennent seulement deux acides aminés avec la nature aromatique (par exemple, Phe-Phe, le dicarbonate de tert-butyle (Boc)-Phe-Phe) ^7,8,16-21. Les structures formées par ces peptides homoaromatiques comprennent des structures tubulaires, des sphères, des assemblages en forme de feuilles et de fibres ^{6,8,15,21-32.} Les fibres dans certains cas de générer un treillis de fibrilles qui donne un hydrogel ^{de 33 à 37.} Ces assemblées ont été exploitées pour des applications de biocapteurs, administration de médicaments, l'électronique moléculaire, etc ^38-45.

Ce document décrit les étapes expérimentales nécessaires pour commencer l'auto-assemblage spontané de peptides homoaromatiques. En outre, elle présente le processus de peptide co-assemblage. Ce processus implique l'auto-assemblage de plus d'un type de peptidemonomère.

Notre démonstration comprend le co-assemblage de deux peptides disponibles dans le commerce: le peptide diphénylalanine (NH _{2-Phe-Phe-COOH)} et son analogue protégé Boc (Boc-Phe-Phe-OH). Chacun des peptides s'auto-assemble en une structure supramoléculaire: les formulaires diphénylalanine peptidiques assemblages tubulaires et les Boc-Phe-Phe-OH peptides s'auto-assemble en soit des sphères ou des fibres en fonction du solvant ^7,17,46. Nous avons mélangé les deux peptides dans certains ratios et caractérisé les assemblées entraîné par microscopie électronique, la microscopie à force et la spectroscopie FT-IR. Les méthodes ont démontré la formation d'une structure à base de peptide qui est constitué d'éléments sphériques ayant un diamètre de quelques microns (1-4 um) qui sont reliées par des assemblages de forme allongée d'un diamètre de quelques centaines de nanomètres (~ 300 à 800 nm) . Les assemblages ressemblent cordes perlées dans leur morphologie, les structures sphériques semblent être vissé sur leensembles allongés. Nous avons appelé donc ces ensembles "colliers" biomoléculaires. Les "colliers biomoléculaires» pourraient servir de nouveau biomatériau, comme un agent de l'administration de médicaments ou comme un échafaudage pour des applications électroniques. De plus, la procédure qui conduit à l'auto-assemblage des peptides peut être utilisé avec d'autres classes de peptides et de biomolécules. Elle peut conduire à une meilleure compréhension des forces impliquées dans l'auto-assemblage et la formation de nouvelles structures ordonnées.

Protocol

Une. L'auto-assemblage de homoaromatiques Dipeptides

1. Peser le peptide souhaité sous sa forme lyophilisée (par exemple, NH _{2-Phe-Phe-OH,} Boc-Phe-Phe-COOH) et de préparer une solution mère en dissolvant le peptide dans du 1,1,1,3,3,3-hexafluoro -2-propanol (HFP) à la concentration appropriée (par exemple 100 mg / ml de NH _2-Phe-Phe-OH et Boc-Phe-Phe-COOH) ^7,17,46.
2. Mélanger la solution avec vortex et place sur le banc jusqu'à ce que le peptide est complètement dissous et la solution semble clair (quelques minutes).
3. Diluer la solution de peptide de magasin, avec un solvant approprié, à la concentration appropriée (par exemple, 2 mg / ml de NH _2-Phe-Phe-OH dans de l'eau distillée triple (TDW) pour la formation de nanotubes, en ajoutant 2 ul du peptide solution mère à 98 ul TDW, 5 mg / ml de Boc-Phe-Phe-COOH dans l'éthanol pour la formation de structures sphériques).
4. Conserver la solution à température ambiante pendant 24h.
5. Afin d'éviter toute preaggregation, préparer des solutions mères fraîches pour chaque expérience.

2. Co-assemblage de deux dipeptides homoaromatiques

1. Préparer une solution de 50% d'éthanol en mélangeant des volumes égaux d'éthanol absolu et TDW. Utilisez vortex pour mélanger les deux solutions.
2. Peser 2 mg du peptide NH _2-Phe-Phe-OH et 1 mg du peptide Boc-Phe-Phe-OH. Dissoudre chaque peptide dans HFP à une concentration de 100 mg / ml.
3. Mélanger les peptides solutions d'aide vortex et les placer sur le banc jusqu'à ce que les peptides sont complètement dissous et les solutions semblent claires.
4. Mélanger les peptides solutions d'actions à la proportion souhaitée. Dans cette expérience spécifique mélanger 10 ul de peptide _{NH2-Phe-Phe-OH} avec 6 pi du peptide Boc-Phe-Phe-OH (à un rapport final de 05:03 respectivement). En raison de la forte volatilité du solvant HFP, il est recommandé de préparer une grande quantité de cette solution mère (à least 10 pi).
5. Utilisez vortex pour mélanger la solution stock de peptides mélangés.
6. Diluer la solution mère de peptides mélangés avec 50% d'éthanol à la concentration finale souhaitée. Dans cette expérience particulière, de manière à obtenir une concentration finale de 5 mg / ml de NH _2-Phe-Phe-OH et 3 mg / ml de Boc-Phe-Phe-OH respectivement, ajouter 8 l de la solution mère des peptides mélangés à 92 ul de la solution d'éthanol à 50%. Utiliser une pipette pour mélanger doucement la solution.
7. Conserver la solution à température ambiante pendant 24 heures.
8. Il convient de noter qu'en raison de la nature très volatile du solvant, les expériences sont sensibles à de petits changements dans la concentration des peptides. Par conséquent, les solutions de base fraîches doivent être préparées pour chaque expérience.

3. Caractérisation des structures auto-assemblées à l'aide microscopie électronique à balayage (MEB)

1. Après 24 heures d'incubation, appliquer une goutte de 10 ul de la solution de peptides sur une crique de verrer glissement sec et à température ambiante.
2. Manteau de l'échantillon sur le verre avec une couche mince d'or (quelques nanomètres) à l'aide d'une coucheuse par pulvérisation cathodique pendant 90 sec.
3. L'image des assemblées à l'aide de SEM fonctionnant à 10-20 kV.

4. Caractérisation des structures auto-assemblées à l'aide microscopie électronique à transmission (MET)

1. Placer une goutte de 10 ul de la solution de peptides sur une grille de cuivre à 200 mailles recouverte de carbone et stabilisé par un support de film polymère.
2. Après 1 min enlever le liquide en excès avec un papier filtre.
3. Préparer une solution de 2% d'acétate d'uranyle dans TDW. Filtrer la solution à l'aide de l'unité de filtre de 0,22 um.
4. Pour colorer l'échantillon (coloration négative), déposer une goutte de 10 solution d'acétate d'uranyle pi sur la grille.
5. Après 30 sec enlever l'excès de liquide avec un papier filtre. Il convient de noter que, bien que la coloration négative améliore le contraste de l'image, il n'est pas indispensable dans tous les cas.
6. L'image de l'échantillon sur ee grille par TEM fonctionnant à 120 kV.

5. Caractérisation tridimensionnelle des assemblées par microscopie à force atomique (AFM)

1. Préparer un échantillon pour l'analyse de l'AFM en utilisant la procédure décrite au paragraphe 3.1.
2. Analyser l'échantillon sur le verre à l'aide d'un instrument AFM fonctionnant en mode AC. Utilisation cantilevers de silicium avec une constante de rappel de 3 N / m et une fréquence de résonance de 75 kHz.
3. Commencer par balayage d'une grande surface de la grille, afin de trouver la structure désirée. Puis se concentrer sur une zone spécifique plus petit et le scanner (la taille de balayage est de 2,5 um x 2,5 um pour l'image incluse dans ce manuscrit).

6. La caractérisation de la structure secondaire par FT-IR

1. Appliquer une goutte de 30 ul de la solution de peptides à une fenêtre de CaF _2.
2. Laisser sécher la solution à la température ambiante.
3. L'adsorption de l'eau dans le spectre IR est à 1650 cm ^-1.Ce pic est au centre de la bande amide I de la liaison peptidique. Il est également un pic typique pour structures α-hélicoïdale de peptides et de protéines ^47. Afin de surmonter ce problème et éviter le signal de l'eau, un échange hydrogène-deutérium-à doit être effectuée. Placer une goutte de l'oxyde de deutérium (D ₂ O) sur l'échantillon de peptide séché. La chute doit être suffisamment grand pour recouvrir complètement le dépôt de peptide sur la fenêtre.
4. Laisser l'échantillon à sécher sous vide.
5. Répéter les étapes 6.3 et 6.4 pour assurer un échange 2x maximale hydrogène-à-deutérium. Enregistrer l'échantillon sous vide jusqu'à son analyse.
6. Enregistrer les spectres FT-IR en utilisant un sulfate de triglycine deutéré (DTGS) de détecteur. Le système FT-IR comprend un générateur de gaz de purge, afin d'empêcher l'humidité dans les environs de l'échantillon. Pour les échantillons de peptides courts, il est préférable d'analyser l'échantillon 2000 x à une résolution de 4 cm ^-1. Les valeurs minimales de transmittance peuvent être déterminées par la manièreftware fourni avec l'instrument.

Results

Ce document décrit un procédé pour la formation de structures ordonnées à la nano-échelle micrométrique et par l'auto-assemblage des peptides. Afin de démontrer ce processus simple, nous présentons et caractériser le co-assemblage de deux peptides aromatiques simples (figure 1). L'un des peptides est la NH _2-Phe-Phe-OH (diphénylalanine) peptide, qui peut s'auto-assembler en une solution aqueuse dans des structures tubulaires creuses de dimensions nanométriques ^7. L'autre peptide es...

Discussion

En résumé, ce document montre la facilité avec laquelle les assemblages à base de peptides peuvent être formés in vitro. Le procédé implique des peptides et des solvants disponibles dans le commerce, et il se produit spontanément dans les conditions ambiantes, lors de l'addition d'un solvant polaire pour le tube à essai. Il est essentiel d'utiliser un solvant HFP comme des peptides, en raison de la faible solubilité des peptides dans d'autres solvants organiques. En outre, en raison de la forte ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NH2-Phe-Phe-OH	Bachem	G-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OH	Bachem	A-3205.0005
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	52512-100ML
Éthanol absolu (déshydraté) AR stérile	Bio-Lab Ltd.	52555	Mélange avec TDW pour la préparation d’une solution à 50 % d’acétate d’uranyle
	Sigma-Aldrich	73943	Pour coloration négative. Il est possible de travailler sans.
lamelle de protection en verre	Marienfeld Laboratory Verrerie	110590
Grilles TEM	Microscopie électronique Sciences	FCF200-Cu-50	Formvar/Carbon 200 Mesh, Cu
Papier filtre quantitatif	Whatman	1001055
Oxyde de deutérium (D2O)	Sigma-Aldrich	151882-100G	99,9 atome % D
CaF2 fenêtre	PIKE Technologies	160-1212	Fenêtre de 25 mm x 2 mm. Pour les mesures FT-IR :
pointes AFM : NanoScience	Instruments	CFMR	Aspire, série CFMR-25,
unités de filtrage	Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0,22 & mu ; m, PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma
SEM	FEI		Quanta 200 ESEM
TEM	FEI		Tecnai T12 G2 Spirit
AFM	JPK Instruments		A JPK NanoWizard3
FT-IR	Thermo Fisher Scientific		Nicolet 6700 spectromètre d’or avancé
FT-IR Purge	Parker		BALSTON FT-IR Générateur de gaz de purge modèle 75-52
Logiciel OMNIC (Nicolet)	Thermo Nicolet Corporation		Pour l’analyse des spectres FT-IR
Mélangeur Vortex	Wisd Équipement		ViseMix VM
Poids	Mettler Toledo		NewClassic MS
Sputter Coater	Polaron		SC7640 Sputter Coater