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À haut débit Fluorometric Mesure de sol Potentiel activités enzymatiques extracellulaires

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DOI :

10.3791/50961

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15 novembre 2013

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1Natural Resource Ecology Laboratory, Colorado State University, 2Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering, University of Colorado

Dans cet article

Résumé

Pour mesurer les taux potentiels de sol activités enzymatiques extracellulaires, des substrats synthétiques qui sont liés à un colorant fluorescent sont ajoutés à des échantillons de sol. L'activité enzymatique est mesurée en tant que le colorant fluorescent est libéré du substrat par une réaction catalysée par une enzyme, où la fluorescence est élevé, plus la dégradation du substrat.

Résumé

Les microbes dans le sol et d'autres environnements produisent des enzymes extracellulaires à dépolymérisent et hydrolyser les macromolécules organiques de sorte qu'ils peuvent être assimilés pour l'énergie et les nutriments. Mesure de l'activité de l'enzyme microbienne du sol est essentielle pour comprendre la dynamique des écosystèmes fonctionnels du sol. Le concept général de l'analyse de fluorescence qui est une enzyme de synthèse C-, N-, ou des substrats riches en P lié à un colorant fluorescent sont ajoutés à des échantillons de sol. Lorsque intact, les substrats marqués ne sont pas fluorescentes. L'activité enzymatique est mesurée comme l'augmentation de la fluorescence en tant que colorants fluorescents sont clivés à partir de leurs substrats, qui leur permet de fluorescence. mesures d'enzymes peuvent être exprimés en unités de molarité ou activité. Pour effectuer cet essai, des suspensions de sol sont préparés en combinant le sol avec un tampon de pH. Le tampon de pH (généralement un acétate de sodium à 50 mM ou du tampon Tris 50 mM), est choisi pour particulier l'acide constante de dissociation de la mémoire tampon (pKa) pour correspondre au mieux la SA du solmple pH. Les suspensions de sol sont inoculés avec une quantité non limitative de marqué par fluorescence (à savoir C-, N-, P-ou riche) substrat. Utilisation des suspensions de sol dans l'essai sert à minimiser les limitations de l'enzyme et diffusion de substrat. Par conséquent, cet essai de contrôle pour les différences de limitation de substrat, les vitesses de diffusion et les conditions de pH du sol, détecter ainsi les taux d'activité d'enzymes potentiels en fonction de la différence des concentrations de l'enzyme (par exemple).

Dosages enzymatiques fluorescence sont généralement plus sensibles que spectrophotométriques (c. colorimétriques) les essais, mais peuvent souffrir d'interférences causées par des impuretés et de l'instabilité de nombreux composés fluorescents lorsqu'ils sont exposés à la lumière, donc la prudence est requise lors de la manipulation des substrats fluorescents. De même, cette méthode ne évalue les activités enzymatiques potentiels dans des conditions de laboratoire lors de substrats ne sont pas limitatifs. Il faut être prudent dans l'interprétation des données représentant croix-sites des comparaisons avec des températures différentes ou des types de sol, comme dans le type de sol in situ et la température peuvent influer sur la cinétique enzymatique.

Introduction

Enzymes extracellulaires (EE) produites par les bactéries du sol, les champignons et les archées sont impliqués dans les processus biogéochimiques innombrables, et sont au cœur de la transformation, la stabilisation et la déstabilisation de matière organique du sol et le cycle des éléments nutritifs dans les écosystèmes terrestres 1. En produisant EE, les microbes du sol se décomposent et se transforment en matière organique polymérique en molécules solubles plus petits, ce qui libère auparavant liés micro-et macro-éléments, ce qui permet des plantes et des microbes à assimiler les nutriments disponibles dans le sol. EE ont été étudiées pendant des décennies, notamment par la mesure de leur activité dans des essais de laboratoire de 2 à 4, car il est très difficile de détecter et de quantifier directement les enzymes.

Activité enzymatique extracellulaire (EEE) est le plus fortement contrôlée par la concentration des enzymes et des substrats correspondants. L'abondance des différents C-, N-, et les enzymes dégradant P dans les sols est contrôlée par de nombreux facteurs including biomasse microbienne, la composition de la communauté, la disponibilité du substrat, le microclimat, et les exigences stoechiométriques 5,6. Cependant, dans AEE in situ au sein de l'environnement du sol sont également affectés par la température 7,8, la liaison d'enzymes pour les argiles du sol et les propriétés humiques 2, et les contraintes de diffusion 9, qui régissent finalement la piscine de l'enzyme active, en termes de taille, la disponibilité du substrat , et le taux de roulement 10-12. Par conséquent, en reconnaissant dans des conditions de sol in situ est essentiel lors de l'utilisation des tests de laboratoire de l'enzyme d'interpréter la fonction microbienne du sol dans les différents sites environnementaux.

De nombreuses classes différentes de l'EEE peuvent être quantifiés dans des essais de laboratoire en utilisant une variété de substrats synthétiques (s'il vous plaît se référer à la «Liste des réactifs tableau" pour plus de détails). Certains protocoles utilisent des substrats dans des dosages qui sont couplés à une réaction colorimétrique qui peut être détecté avec un spectrophotomètre, wien que les autres, y compris le protocole que nous décrivons ici, utiliser des substrats qui sont liés à un groupement fluorescent. Tests de fluorescence EE sont généralement plus sensibles (par un ordre de grandeur) que les tests colorimétriques (qui utilisent une partie chromogène lié à un substrat synthétique) 12-14. Sensibilité dans la détection de l'EEE comporte deux aspects: l'un est lié à la quantité de composé d'intérêt détectés et l'autre liées à l'activité la plus faible de l'enzyme potentiel détectable. Des procédés pour colorimétrique P-nitrophénol dosages à base de (PNP) peuvent être trouvés dans les travaux passés 15,16. En bref, le sol (généralement tamisé à <2 mm et séché à l'air) est incubé à température optimale et ou domaine pertinent pH. La vitesse à laquelle le produit de réaction libérée est déterminée par colorimétrie avec un spectrophotomètre 14. La plus grande sensibilité des dosages d'enzymes de fluorescence est dû en partie à la détection plus sensible de la séparation de la fraction fluorogène associé à substrmangé dégradation absorbance plutôt que l'enregistrement après la séparation d'une partie chromogène spécifique à une longueur d'onde spécifique. Les deux indicateurs fluorescents synthétiques les plus couramment utilisés sont 4 méthylumbelliférone (MUB) 17 et 7-amino-4-méthylcoumarine (MUC) 18,19. MUC-substrats liés sont généralement associés à des substrats synthétiques riches en azote tels que les protéines et / ou des acides aminés. Techniques fluorescentes ont été développés pour des échantillons aquatiques 20,21, et leur application à des sols nécessite des contrôles pour la trempe de signal et les interférences 22,23. Les dosages peuvent, soit être menées en utilisant "paillasse" chimie traditionnelle avec de grands volumes, ou peuvent être utilisés dans les protocoles de microplaques, avec un débit augmenté, mais peut-être l'erreur de mesure plus élevée. Bien qu'il existe plusieurs protocoles fréquemment cités pour la détection fluorescente AEE dans les sols 24, de nombreux laboratoires emploient subtiles variations sur ces protocoles, souvent par inadvertance ou en raison de la différences d'équipement ou de réactifs de laboratoire. Apparemment petites différences dans les détails de protocoles peuvent fortement affecter mesurée AEE 25,26 et le manque d'enzymes standardisées fait qu'il est difficile de calibrer tests entre les différents laboratoires. Ainsi, il existe un besoin important pour la diffusion des protocoles détaillés pour encourager la normalisation des tests de l'EEE.

Dans notre protocole, les échantillons de sol sont préparés en mélangeant des échantillons de sol avec un tampon de pH et l'homogénéisation avec un mélangeur. Les boues sont ensuite inoculés avec une quantité non limitative de marquage fluorescent C-, N-, ou substrat P-riche, choisi en fonction de la question spécifique de recherche d'intérêt. Utilisation des suspensions de sol dans les dosages enzymatiques sert de contrôle pour minimiser les limitations de la diffusion du substrat. Les fragments fluorescents sont trempés jusqu'à ce qu'elles soient clivées à partir de leurs substrats respectifs, et donc l'activité enzymatique peut être détectée en tant que le colorant fluorescent est libéré du substrat by une réaction catalysée par une enzyme. L'intensité de fluorescence croissante dans le temps reflète la vitesse de la réaction catalysée par une enzyme.

Le concept général de l'analyse de fluorescence enzyme est que les substrats synthétiques liées avec un fragment fluorogène (colorant fluorescent), sont ajoutés à des échantillons de sol 27. Au cours de la dégradation du substrat catalysée par une enzyme, la liaison rompt entre le colorant fluorescent et le substrat. Le colorant fluorescent libéré du substrat est par conséquent utilisé comme une évaluation indirecte de l'activité enzymatique, et peut être quantifiée en utilisant un lecteur de microplaque pour détecter l'intensité de fluorescence du colorant. En bref, la fluorescence quantification est réalisée en tant que le colorant émet de la lumière libérée d'une longueur d'onde après avoir absorbé la lumière d'une longueur d'onde différente. L'intensité de fluorescence est enregistrée par un lecteur de plaque capable à la fois d'excitation et de détection. L'activité enzymatique peut être quantifiée par la suite sur la base de la conce-colorant fluorescent connuntrations du substrat (quantités à-dire connus de substrat synthétique ajoutées à des échantillons de sol) en même temps que le référencement d'une courbe de dilution standard d'intensités de fluorescence pour le fragment fluorogène spécifique du substrat utilisé dans le dosage (c'est à dire la 4-méthylumbelliférone (MUB) ou amino-7 -4-méthylcoumarine (MUC)). (S'il vous plaît se référer à la section de protocole pour des détails précis sur l'activité enzymatique quantification).

dosages enzymatiques du sol en laboratoire sont utiles pour évaluer la fonction de la communauté microbienne, mais il existe plusieurs limitations techniques que les utilisateurs doivent reconnaître 10. tests de fluorescence peuvent souffrir d'interférences causées par des impuretés et / ou l'instabilité de nombreux composés fluorescents lorsqu'ils sont exposés à la lumière, donc la prudence est requise lors de la manipulation des substrats fluorescents 25. les particules de sol et / ou des matières organiques dans les boues, peuvent également interférer avec des intensités de fluorescence, connu sous le nom d'effet de trempe 26.En outre, des tests de laboratoire de l'enzyme ne détermine AEE potentiels dans des conditions de laboratoire. Dans des essais in vitro mesurent AEE dans des conditions où la diffusion de substrat et l'abondance n'est pas limitatif. Par conséquent, les données fournies par ces tests peuvent ne pas être un bon indicateur de SEAE conformément à l'état du sol in situ 10. Globalement, l'activité de l'enzyme est très utile pour les comparaisons relatives dans lesquelles les types de sols sont semblables. Toutefois, lorsque vous utilisez cette méthode pour comparer les activités entre les sols qui diffèrent des propriétés physiques ou chimiques, il faut être prudent. Cela est dû au fait que les différences dans le type et la température du sol peuvent considérablement altérer l'état de la cinétique enzymatique en in situ. Une autre limitation est que relativement peu de substrats sont disponibles dans le commerce (par rapport à l'environnement naturel). En outre, les substrats synthétiques utilisés pour des dosages enzymatiques sont relativement simples (facilement soluble) peuvent ne pas représenter exactement les substrats de sol présents ou disponibe in situ. Un autre facteur à considérer est que l'utilisation de boues, intégrera l'activité de certaines enzymes stabilisées (ie immobilisés par la matière organique ou des argiles) qui peuvent ne pas être active dans des conditions in situ 2. Tests de laboratoire de l'enzyme ne fournissent pas de renseignements sur la persistance des enzymes dans le sol (taux de rotation de l'enzyme) ou des informations sur les espèces microbiennes spécifiques qui produisent des enzymes du sol.

Protocole

Une. Essai Set-up

  1. Étiquette 3 plaques à puits profonds: "exemples", "standard MUB", et "standard MUC".
  2. Verser chaque standard (MUB de 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, et 100 M) et le substrat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) en propre, des réservoirs pré-marqués distincts (orientée en lignes) .
  3. Introduire à la pipette la norme MUB approprié dans les puits correspondants de MUB plaque standard (Tableau 1).
    1. Pipette 200 ul de 0 uM MUB dans la ligne A du MUB plaque standard.
    2. Pipette 200 ul de 2,5 uM MUB dans la ligne B du MUB plaque standard.
    3. Pipette 200 ul de 5 uM MUB dans la ligne C du MUB plaque standard.
    4. Pipette 200 ul de 10 uM MUB en ligne D du MUB plaque standard.
    5. Pipette 200 ul de 25 uM MUB en ligne E de MUB plaque standard.
    6. Pipette 200 ul de 50 uM MUB en ligne F de MUB plaque standard.
    7. Pipette 200 ul de 100 μM MUB en ligne G de MUB plaque standard.
    8. Répétez les étapes 1.3.1 - 1.3.8 des normes MUC dans les puits correspondants de la plaque standard MUC.
  4. les boues, de préparation pour chaque échantillon de sol.
    1. Peser 2,75 g de champ sol humide dans un mélangeur.
    2. Ajouter 91 ml de tampon 50 mM. Mélanger à haute pendant 1 min.
    3. Verser le contenu dans un bol mélangeur en verre propre au moins aussi large que 8 canaux pipette avec une barre d'agitation.
    4. Placer sur une plaque d'agitation, mélanger suspension de sol à basse température.
    5. Introduire à la pipette 800 ul de suspension de sol dans la première colonne de la plaque d'échantillon (tableau 2).
    6. Répétez en 1 ère colonne de la norme MUB et plaques standard MUC (tableau 1).
    7. Rincer mixeur, plaque d'agitation et remuer bar avec DI H 2 O ou un tampon entre les échantillons de sol.
    8. Répéter les étapes 1.4.1 - 1.4.7) pour chaque échantillon, se déplaçant à la colonne suivante avec chaque échantillon de sol subséquent (tableaux 1 et2).
  5. Introduire à la pipette le substrat approprié (dans cet exemple, 200 uM concentrations) dans les puits correspondants de la plaque échantillon (tableau 2).
    1. Pipette 200 ul de substrat BG dans la ligne A de la plaque échantillon.
    2. Pipette 200 ul de substrat de CB dans la ligne B de la plaque échantillon.
    3. Pipette 200 ul de substrat NAG dans la ligne C de la plaque échantillon.
    4. Pipette 200 ul de substrat de PHOS en ligne D de la plaque échantillon.
    5. Pipette 200 ul de substrat XYL en ligne E de la plaque échantillon.
    6. Pipette 200 ul de substrat AG en ligne F de la plaque échantillon.
    7. Pipette 200 ul de substrat LAP en ligne G de la plaque échantillon.
    8. Répétez les étapes 1.5.1 - 1.5.7 pour chaque plaque de l'échantillon de la température d'incubation.

2. L'incubation de dosage plaques

  1. Sceller les plaques à puits profonds («exemples», «norme MUB", et "standard MUC4 ;) avec plaque tapis.
  2. Inversez chaque (scellé) plaque à la main jusqu'à ce que la solution soit bien mélangé (~ 10x).
  3. Placer les plaques dans l'incubateur approprié pour la période d'incubation nécessaire (tableau 3).
  4. Enregistrer le temps initial Temps 0. Également enregistrer les temps d'incubation appropriées de sorte que vous savez quand retirer la plaque de l'incubateur (tableau 3).
  5. A la fin de chaque période d'incubation, centrifuger les plaques scellées pendant 3 min à 2900 x g ~.
  6. Après la certification, transférer 250 pi de chaque puits de plaques à puits profonds incubés dans les puits correspondants dans des plaques à 96 puits à fond plat noir (une plaque noire sera utilisée pour chaque assiette creuse des puits incubés). Il est important de transférer les échantillons à partir des plaques à puits profonds incubés dans les mêmes puits (c.-à-A1 ... A12, etc) dans les plaques de 96 puits à fond plat noires (Tableau 1, 2).

3. Mesures fluorescents surun Fluorometer de microplaques

  1. En suivant les instructions du fabricant pour le lecteur de plaque fluorimétrique utilisé, régler la longueur d'onde d'excitation de 365 nm et une émission à la longueur d'onde de 450 nm (ou utiliser des filtres appropriés).
  2. Lisez les trois plaques sur le fluorimètre. Important: les échantillons et les plaques standard (c.-à-IUM ou MUC) doivent être lus en utilisant le même gain.
    1. Régler le spectrophotomètre à gain automatique et de lire les plaques MUC et MUB standard.
    2. Ensemble gain manuel, et diminuer la valeur d'être optimale au nombre le plus bas, arrondis à cinq le plus proche, pour chaque plaque standard. Répétez 2x pour chaque plaque.
    3. Réglez le gain automatique et à exécuter la plaque échantillon. Relancez la plaque de l'échantillon manuellement pour correspondre le plus haut gain pour chacune des plaques standard (c.-à-IUM et MUC).

4. Analyse des données

  1. Entrez les données courbe de fluorescence standards dans un tableur pour MUB (tableau 4a) Et la norme MUC (tableau 4b)
    1. Autre (um) à des concentrations (mol) (tableaux 4a et 4b).
  2. Pour les données courbe de fluorescence standard de chaque échantillon, calculer la pente, ordonnée à l'origine, et R 2 valeurs pour MUB et MUC (pmol) de concentrations standard. Acceptables R 2 valeurs devraient dépasser 0,98 pour chaque échantillon (tableaux 4a et 4b). Il peut être utile de visualiser des courbes d'étalonnage dans un nuage de points; avec la fluorescence lectures tracé comme la variable dépendante (axe des y) et la concentration standard (pmol) tracée comme variable indépendante (axe des x) (figure 1).
  3. Vous allez utiliser la pente de la courbe standard MUB et MUC et valeurs ordonnée à l'origine pour calculer l'échantillon + données de fluorescence brute de substrat dans AEE potentiels. Vous devez d'abord entrer + données de fluorescence des échantillons de substrat premières dans une nouvelle feuille de calcul (tableau 5a ). Vous devrez également saisir le temps d'incubation (h) et le sol en poids sec pour chaque échantillon (tableau 5b). Notez, les valeurs entrées de temps dans cet exemple sont les 3 h, parce que les échantillons ont été incubés à 25 ° C (tableau 3).
    1. Soustraire les valeurs d'ordonnée de la courbe standard de valeurs d'échantillons correspondants de fluorescence, puis divisez par la pente de la courbe standard correspondant (tableau 5c). Pour ce faire, réorganiser l'équation de la ligne standard à résoudre pour l'échantillon concentration d'enzyme (x), x = (yb) / m où: [y = fluorescence de l'échantillon lecture brute; b = ordonnée à l'origine de MUB ou courbe MUC standard; m = pente de MUB ou MUC courbe standard].
    2. Multiplier échantillon mol, de l'étape 4.3.1 ci-dessus, par 91 ml (volume de tampon utilisé dans la suspension de sol) (tableau 5d).
    3. valeur de la fracture obtenue dans l'étape 4.3.2 par le temps d'incubation spécifique-échantillon et la masse sèche de sol (tableau 5e): [amt enzymatique. (& #956; mol) x 91 ml x incubation (h) x sol sec (g) x 0,8 ml x 1 000]
      Note: 0,8 ml est le volume de bouillie utilisé dans chaque puits, et 1000 corrige pour la quantité réelle du sol dans chaque puits.
    4. Multiplier la valeur obtenue à l'étape 4.3.3 en 1000 pour obtenir les unités désirées (activité nmol / g sol sec / h) (Tableau 5f).

Résultats

Les essais enzymatiques peuvent être utilisés pour quantifier AEE potentiels et de comparer les activités entre les échantillons similaires. Ici, nous présentons des résultats représentatifs d'une étude climatique expérimentale comparant les sols qui ont connu des conditions climatiques ambiantes (ACN) pour les sols qui ont été exposés à une élévation du CO 2 et des traitements de chauffage (EHN) (figures 2-6). La couverture végétale dans toutes les parcelles étaient caractéristiques d'une prairie mixte nord dominé par l'herbe C4 Bouteloua gracilis (HBK) Lag. et deux C3 herbes, Hesperostipa comata Trin et Rupr. et Pascopyrum smithii (Rydb.); environ 20% de la végétation est composée de carex et d'herbacées. Plus d'informations en ce qui concerne la description du site et sur ​​le terrain la conception expérimentale peut être trouvée dans les références 28-30. Les sols ont été recueillies à partir de deux profondeurs différentes (0-5 cm et de 5 à 15 cm) au sein de chacune des parcelles traitées à l'aide d'un noyau de 1,5 cm de diamètre pour évaluer AEE du sol en réponse à la température changée conditions. Dans nos exemples (c.-à-Les figures 2 à 6), la taille de l'échantillon est (N = 3). Indépendamment de cette taille minimale de l'échantillon, la variation est relativement faible dans la plupart des cas (comme le montrent les barres d'erreur) et reflète robuste variabilité AEE potentiels entre les parcelles de traitement. Analyse de variance (Anova) et soumettre des comparaisons multiples de Tukey hoc ont été utilisés pour identifier des changements importants dans l'activité enzymatique entre les parcelles traitées et les profondeurs du sol.

Les résultats représentatifs suivants ont été fournis afin de démontrer comment ce à haut débit, dosage fluorimétrique peut être utilisé pour tester (1) EEE globale dans les sols, (2) comment stoechiométrie de l'EEE peut être indicatif des processus au niveau de l'écosystème et (3) la relation entre la température d'incubation et de l'EEE. Sol EEE de sont couramment étudiés de relier les changements de la fonction microbienne dans le sol des éléments nutritifs, des indicateurs utiles pour évaluer les demandes de nutriments microbiens en réponse au changement climatique communauté, de l'usine dehifts, et plus largement l'écosystème fonctionnement 31-33. Stoechiométrie EEE a été adoptée plus récemment comme un indice pour évaluer sol biochimique cycle des éléments nutritifs par l'intersection de la théorie stoechiométrique écologique et la théorie métabolique de l'écologie pour évaluer les risques de déséquilibre en nutriments microbienne correspondant aux conditions ambiantes 5. De nombreuses études ont suggéré que de larges proportions stoechiométriques sont indicatifs des limitations de croissance nutriments 34-36, et, comme les nutriments du sol deviennent limitées, les microbes répondre en allouant des ressources pour produire des enzymes métaboliques spécifiques à acquérir des éléments nutritifs déficients 37. Ecoenzymatic C: N: ratios de stœchiométrie de P sont donc utiles pour identifier les changements relatifs à microbiennes demandes potentielles communauté de nutriments en réponse à diverses perturbations de l'environnement 5. Enfin, la sensibilité de température AEE peuvent être utiles pour évaluer la façon dont la diversité fonctionnelle des communautés microbiennes du sol est probablement influencée par les changements de température 7,38. Enzymatiques sensibilités de température peuvent varier largement entre les sols pour une seule classe d'enzymes, et les communautés microbiennes productrices d'enzymes ont montré des changements dans l'activité enzymatique correspondant à des changements dans le climat de conditions historiques 7. Ainsi questions sur l'activité des enzymes liés à l'écologie thermique des EE peuvent être un moyen utile pour évaluer la dynamique fonctionnelle microbienne et les processus des écosystèmes souterrains en réponse au climat change 39,40.

Dans cet exemple, le potentiel de C, les activités d'acquisition P-enzymatiques testés à 0-5 cm de profondeur du sol N-, et ne diffèrent pas d'un traitement expérimental (Figure 2a). Cependant, à des profondeurs de 5 à 15 cm du sol, plusieurs AEE potentiels ne diffèrent de manière significative (figure 2b). Par exemple, les enzymes de dégradation C-β-1 ,4-glucosidase et β-D-cellobiohydrolase étaient plus faibles dans les parcelles indemnes de la maladie (p ≤ 0,038; Figure 2b) par rapport aux parcelles ACN. Le mineur N et Palizing enzymes (β-1 ,4-N-acétylglucosaminidase et phosphatase, respectivement) étaient également plus faibles dans les parcelles EHN (p ≤ 0,012; figure 2b) par rapport à l'ACN à 5-15 cm de profondeur dans le sol.

Calculer et tracer la somme de tous les C-, N-, ou AEE potentiels P-vélo peut être une approche utile pour observer des modèles plus larges en ce qui concerne le potentiel du sol C-, N-, et / ou P-cycles (Figure 3). Dans cet exemple, la somme de β-1 ,4-glucosidase, β-D-cellobiohydrolase, β-xylosidase, α-1 et AEE potentiels ,4-glucosidase a été calculée pour représenter des activités potentielles C cyclistes. La somme de β-1 ,4-N-acétylglucosaminidase et la L-leucine aminopeptidase a été calculée pour représenter des activités potentielles de cyclisme N. Phosphatase a été utilisé pour représenter les activités potentielles P cyclables. Dans cet exemple, AEE potentiels pour un total de C, N et P-vélo ont affiché une tendance inférieure à la EHN parcelles par rapport aux parcelles ACN au 5-15 cm de profondeur du sol (Figure 3). Toutefois, cette tendance n'était significative que pour les activités de vélo N et P total (p ≤ 0,046; figure 3). SEAE sol ne diffèrent pas significativement entre les parcelles traitées à 0-5 cm de profondeur du sol (figure 3). Les résultats de cet exemple suggèrent une évolution contrastée en fonction l'activité enzymatique (c. C-, N-, ou des enzymes dégradant P) entre les parcelles traitées (ACN vs NHE) en réponse à la profondeur du sol. Par exemple, C-, N-et SEAE sol P-dégradantes dans les parcelles ambiantes (ACN) ont affiché une tendance plus élevée à des profondeurs plus faibles par rapport aux sols exposés aux concentrations élevées de CO 2 et de chauffage (EHN), qui a démontré un modèle inverse (Figure 3a-c ).

Stoechiométrie enzyme est une autre approche utile pour évaluer les activités enzymatiques potentiels dans l'environnement (figure 4). La demande pour les éléments nutritifs microbienne est déterminée par la stoechiométrie élémentaire de la biomasse microbienne par rapport à l'environnementla disponibilité des nutriments 32. De même, les microbes produisent des enzymes spécifiques (c. C-, N-, ou des enzymes dégradant P) pour répondre aux besoins en éléments nutritifs au sein de leurs environnements de sol, aussi appelés stoechiométrie écologique 41. Le rapport de AEE potentiels est un moyen d'évaluer les demandes de nutriments microbiens. Par exemple, un rapport de 1:1 entre les deux enzymes groupes fonctionnels (par exemple dans C: N acquisition des éléments nutritifs) suggère que la demande de N est élevé par rapport à la demande de C lors de l'examen de la biomasse microbienne ratios C: N au niveau de la communauté est typiquement de 42 08 heures 01. Dans cet exemple, l'enzyme sol stoechiométrie C: N, C: P, ou N: activités de P diffèrent significativement entre les parcelles traitées à 0-5 cm de profondeur du sol (figures 4a-c). Toutefois, le potentiel enzyme C: P et N: ratios de P étaient plus élevés dans le EHN parcelles par rapport aux parcelles ACN aux 5-15 profondeurs cm du sol (p = 0,05; figures 4b et 4c). Cette observation suggère qu'il yest relativement plus élevés AEE P de minéralisation par rapport à C et N EEE, les parcelles d'ACN (par rapport à EHN) aux profondeurs 5-15 cm du sol. Enzyme C: N des taux d'activité d'acquisition ont démontré une tendance similaire à celle mise en évidence par AEE totaux C avec un rapport C: N raison de la hausse C AEE potentiels dans les parcelles d'ACN à la profondeur inférieure par rapport à EHN (figure 4a).

La température peut fortement influencer SEAE sol. Pourtant, dans des essais de laboratoire typiques, les enzymes de sol sont mesurées à une température unique qui peut ne pas correspondre à des conditions de température in situ. Notre méthode d'analyse par fluorescence de l'enzyme permet de considérer des effets de température in situ en intégrant plusieurs températures d'incubation en laboratoire pour la comparaison. Utilisation des incubations de laboratoire à des températures multiples nous permet d'analyser la cinétique enzymatique données dépend de la température à l'aide d'Arrhenius terrain et Q 10 calculs. Arrhénius sont utilisés pour visualiser l'énergie d'activation, et sont tracées noustion du logarithme de l'activité enzymatique (variable dépendante axe des y) en fonction de la température de l'inverse convertie en degrés Kelvin (1 / K) sur l'axe x (c'est à dire variable indépendante; figures 5a-c). L'énergie d'activation est généralement définie comme l'énergie minimale nécessaire pour catalyser une réaction chimique (c.-à dégrader un substrat donné en produits plus petits). Pour nos fins, l'énergie d'activation sert de proxy pour la sensibilité à la température de réactions enzymatiques catalysées. Une énergie d'activation plus élevée indique sensibilité à la température de l'enzyme. De même, les énergies d'activation (c'est à dire les figures 5d-f) correspondent directement aux valeurs de Q 10 (c'est à dire les figures 6a-c). Une autre explication des formules utilisées pour calculer l'énergie d'activation et l'application pratique peut être trouvé dans de nombreux travaux passé 40,43-45. Parcelles d'Arrhenius, l'énergie d'activation, et Q 10 parcelles fournissent des informations redondantes et ne devrait pastous être utilisés dans le même manuscrit pour présenter des données de publication (Figures 5 et 6). Par conséquent, l'utilisation de ces techniques, il est nécessaire de choisir le type de terrain le plus approprié pour la température de l'enzyme - données cinétiques 10. Tous les types de tracé (Arrhenius et Q 10) ont été présentés ici à des fins de démonstration, de fournir des exemples visuels de la façon de présenter les résultats de l'enzyme.

Dans nos exemples, nous avons évalué la cinétique enzymatique potentiel potentiels pour C-, N-, P-et AEE entre les deux parcelles traitées aux deux profondeurs du sol (figure 5, la figure 6). Le résultat a montré que la sensibilité à la température de AEE n'était pas significativement différente entre les parcelles de traitement aux profondeurs du sol pour l'énergie d'activation comme démontré dans les parcelles d'Arrhenius (figures 5a-c) et les énergies d'activation correspondant (Figure df) et (sans surprise) pour Q 10 plots (dans cet exemple entre 15 ° C et 25 ° C incubations de laboratoire; figures 6a-c). Ceci suggère que la cinétique enzymatique ne sont pas influencés par le champ traitements expérimentaux dans cette étude particulière.

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Tableau 1. Conception de la plaque de puits profonds pour des concentrations standard de fluorescence avec des échantillons de sol. Modèle d'organisation et de normes de fluorescence de chargement (IUM ou MUC) avec des échantillons de sol dans la plaque de puits profond avant l'incubation. Remarque: Les colonnes représentent les mêmes échantillons de sol (800 ul de suspension de sol additions). Un gradient de concentration standard de fluorescence est chargé pour chaque ligne (200 ajouts ul). Chaque cellule représente la concentration standard de fluorescence ainsi sol ajouts de lisier. Par exemple, S1 - S12 représente des échantillons de sol (800 pi de suspension de sol); MUB 0-100 uM = 4 Methylumbelliferone concentrations (200 ajouts ul). Dans cet exemple, la ligne H est ouvert, et est par conséquent disponible à inclure une concentration standard de fluorescence plus élevé si nécessaire. Cette décision d'augmenter les concentrations de courbes standard peut être nécessaire pour l'activité enzymatique potentiel plus élevé (et / ou les concentrations de substrat utilisé) pour vos échantillons de sol spécifiques. L'activité enzymatique potentiel pour vos échantillons devrait tomber dans la plage des valeurs de la courbe standard. Cliquez ici pour agrandir le tableau .

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Tableau 2. Conception de la plaque de puits profonds pour des échantillons de sol avec substrat. Modèle d'organisation et de chargement des échantillons de sol et des substrats dans la plaque de puits profond avant l'incubation. Remarque: Les colonnes représentent les mêmes échantillons de sol (800 ul de sorteIL ajouts de lisier). Différents supports sont chargés dans chaque rangée (200 ajouts ul). Chaque cellule représente des échantillons de sol, plus l'addition du substrat. Par exemple, S1 - S12 représente des échantillons de sol uniques (800 ul de suspension de sol). Substrats (200 ajouts ul) comprennent: BG = 4 méthylumbelliféryl β-D-glucopyranoside, CB = 4 Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; NAG = 4 Methylumbelliferyl N-acétyl-β-D-glucosaminide; PHOS = 4 Methylumbelliferyl phosphate: XYL = 4 Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside; AG = 4 Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside et LAP = chlorhydrate L-leucine-7-amido-4-méthylcoumarine. Dans cet exemple, la ligne H est ouvert, et est par conséquent disponible pour inclure un autre substrat à évaluer une autre activité enzymatique potentiel si désiré. Cliquez ici pour agrandir le tableau .

Température Temps
4 ° C ~ 23 h
15 ° C 6 heures
25 ° C 3 heures
35 ° C 1,5 h

Tableau 3. températures de l'incubateur requis pour des périodes d'incubation correspondant. températures d'incubation et les périodes correspondantes de la procédure de test de l'enzyme.

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Tableau 4. MUB et MUC calculs de la courbe standard. Montre comment organiser un) MUB et b) les données de fluorescence brute MUC (pmol) pour calculer la suite pente, ordonnée à l'origine, et les valeurs de R-carré. Pour calculer la pente, ordonnée à l'origine, et les valeurs de R-carré de vos courbes de concentration standards, sélectionnez (ou terrain) l'MUB et / ou les données de fluorescence brute MUC comme variable dépendante (axe des y) et la concentration standard (pmol) comme variable indépendante (axe des x). Remarque:. MUB = 4 méthylumbelliférone; MUC = 7-amino-4-méthylcoumarine Cliquez ici pour agrandir le tableau .

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Tableau 5. . Calculs de l'activité enzymatique Montre comment a) organiser les données de fluorescence brute échantillon, puis effectuez les étapes nécessaires (bf) pour calculer AEE dans: activité pmol / g sol sec / h. Note: S1 - S12 représenter des échantillons de sol uniques. Substrats incluent: BG = 4 méthylumbelliféryl β-D-glucopyranoside, CB = 4 Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; NAG = 4 Methylumbelliferyl N-acétyl-β-D-glucosaminide; PHOS = 4 Methylumbelliferyl phosphate: XYL = 4 Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside; AG = 4 Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside et LAP = chlorhydrate L-leucine-7-amido-4-méthylcoumarine. Cliquez ici pour agrandir le tableau .

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Figure 1. MUB parcelle de courbe standard. Scatterplot visualisation des courbes d'étalonnage avec les données de fluorescence premières comme variable dépendante (axe des y) et la concentration standard (mol) comme variable indépendante (axe des x).

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Figure 2. C, N et P activités cyclisme enzymatiques. AEE potentiels au chauffage des Prairies et concentration élevée de CO 2 Enenrichissement par (PHACE) site dans les parcelles témoins (ACN: exposés à des conditions climatiques ambiantes) et les parcelles de traitement (EHN: exposé à une température élevée et CO 2). enzymes de sol ont été analysés au a) des profondeurs de 0-5 cm du sol et b) des profondeurs de 5-15 cm du sol. Les barres verticales représentent la moyenne ± SE Note: ACN = ambiantes - parcelles climatiques; EHN = CO 2 et des parcelles de chauffage. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 3. Totale C, N et P cyclisme enzyme rapports stoechiométriques La somme des AEE potentiels liés à l'acquisition d'une) C, b) N, et c) P-pour les deux groupes de traitement dans l'expérience de PHACE à 0-5 cm et 5. - Profondeurs de 15 cm du sol. Vbarres ertical représentent la moyenne ± SE Note: ACN = ambiantes - parcelles climatiques; EHN = CO 2 et des parcelles de chauffage. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 4. Enzyme stoechiométrie pour l'activité d'acquisition Enzyme rapports stoechiométriques au chauffage des Prairies et concentration élevée de CO 2 Enrichment (PHACE) site dans des parcelles de contrôle totale C, N et P des activités de recyclage d'enzymes. (ACN: exposé à des conditions ambiantes climatiques) et les parcelles de traitement (EHN: exposée à une température élevée et élevée de CO 2). Sol total a) C: N, b) C: P et c) N: P a été tracée pour les deux groupes de traitement à 0-5 cm et 5-15 cm de profondeur dans le sol. Les barres verticales représentent la moyenne ± SE Note: ACN= Ambiante - parcelles climatiques; EHN = CO 2 et des parcelles de chauffage. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 5. . Totale C, N et P cyclisme énergies d'activation de l'enzyme Température sensibilité AEE potentiels affiché en utilisant des parcelles d'Arrhenius pour le total a) C, b) N, et c) P enzymes dégradant, ainsi que les valeurs d'énergie d'activation correspondant pour total d) C , e) N, et f) P enzymes dégradant entre les parcelles traitées et la profondeur du sol au chauffage des Prairies et concentration élevée de CO 2 Enrichment (PHACE) site. Les barres verticales de l'énergie d'activation (c.-à-df) représentent la moyenne ± SE Note: ACN = unmbient - parcelles climatiques; EHN = CO 2 et des parcelles de chauffage. Pour la publication, il est important de noter que l'auteur sera généralement choisir de présenter soit des parcelles d'Arrhenius (c.-à-ac) ou des valeurs d'énergie d'activation (c.-à-df), mais pas les deux parcelles-types. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 6. Totale de C, N et P cyclisme enzyme Q10 sensibilités (15-25 ° C). AEE de température de potentiel mesurées comme Q 10, sur la base des incubations de laboratoire à 15 ° C et 25 ° C pour un total de) C, b) N, et c) P enzymes dégradant entre les parcelles de traitement et la profondeur du sol au chauffage et concentration élevée de CO 2 / Sub> Enrichissement (PHACE) site. Les barres verticales pour Q10 représentent la moyenne ± SE Note: ACN = ambiantes - parcelles climatiques; EHN = CO 2 et des parcelles de chauffage. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

La mesure de la SEAE sol potentiels en laboratoire peut fournir des informations importantes sur les réponses microbiennes à leur environnement abiotique, et leurs conséquences pour le fonctionnement des écosystèmes. Les résultats de cet exemple suggèrent que l'ensemble de données existe des différences minimes de l'activité enzymatique du sol ou cinétique entre parcelles traitées climatique. Cependant, les tendances inverses entre parcelles encourager une enquête plus approfondie de variables qui peuvent influer sur la production d'AEE microbiennes telles que l'humidité du sol, le pH du sol ou la croissance des plantes. Dans l'ensemble, l'évaluation AEE en termes de (1) l'EEE globale dans les sols, (2) l'EEE stoechiométrie (3) d'énergie parcelles Arrhenius / d'activation, et (4) Q 10 fournit un large éventail d'approches qui peuvent être le signe de processus au niveau de l'écosystème à partir de laquelle pour caractériser robuste dynamique fonctionnelle de l'écosystème du sol.

Haut-débit essais de l'EEE basées sur la fluorescence sont un outil utile qui est largement utilisé pour examiner AEE potentiels dans les sols etd'autres environnements. Surtout, les activités potentielles reflètent la taille de la piscine de l'enzyme, mais ne se quantifient pas par la production ou les taux de roulement enzymes 46. Bien que la technique est relativement simple, les différences apparemment mineures entre les protocoles de laboratoire peuvent nuisent à la comparabilité des résultats 13. Malheureusement, nous n'avons actuellement pas de contrôles positifs normalisés appropriés pour SEAE. L'utilisation des rapports stœchiométriques est une approche pour surmonter ces défis. Dans le cas contraire, l'avènement des techniques à haut débit a avancé l'étude des enzymes dans le milieu 4. Une interprétation prudente des données générées par ces tests peut dégager des tendances importantes de l'activité microbienne.

La robustesse du protocole découle de la possibilité de sélectionner des conditions spécifiques à chaque échantillon, mais cela peut également entraîner des limitations. Une série de modifications sera nécessaire pour s'assurer que les échantillons sont mesurés avec précision pour sites individuels sur le terrain:

Tampon

Le tampon que vous sélectionnez dépend du pH du sol. Mise en mémoire tampon stabilise également l'intensité de fluorescence des normes fluorescentes, ce qui est hautement dépendante du pH 27,47. Le tampon de pH que l'on utilise habituellement pour faire la suspension de sol est un acétate 50 mM de sodium ou du tampon Tris, qui est choisie pour le particulier, la constante de dissociation d'acide du tampon (pKa) au meilleur sol de match - le niveau de pH de l'échantillon. L'acétate de sodium a un pKa de 4,76, et Tris a un pKa de 8,06 de sorte que les quantités de ces deux mémoires tampons peut varier afin d'atteindre le pKa souhaitée pour l'échantillon individuel. Tampon phosphate (pKa = 7,2) a été proposé pour les sols neutres / légèrement basiques. Cependant, nous mettons en garde pour tester la variabilité analytique dans les études préliminaires avant d'utiliser ce tampon, comme de fortes concentrations de phosphate peuvent interférer avec l'activité de l'enzyme.

Manipulation et stockage de substrats fluorescents

jove_content "> tests de fluorescence peuvent souffrir d'interférences causées par des impuretés et / ou l'instabilité de nombreux composés fluorescents lorsqu'ils sont exposés à la lumière, donc la prudence est requise lors de la manipulation des substrats fluorescents. Nous vous recommandons fortement de minimiser toute exposition à la lumière à des substrats et MUB et normes MUC marqué par fluorescence . utilisant des bouteilles en verre ambré ou couvrant la verrerie et les récipients utilisés pour la fabrication et le stockage de substrats et les normes fluorescentes est fortement recommandé; une feuille d'aluminium pour envelopper la verrerie et des récipients fonctionne bien même, l'inoculation efficace plaques et transférer aux incubateurs sombres sont les meilleures pratiques Nous vous recommandons.. stockage des substrats et des normes (-20 ° C) pendant plus de deux mois (tout en les protégeant de la lumière) et des substrats de décongélation (5 ° C) ~ 24-48 h avant le début du test (s) de l'enzyme.

Conception et réplication

Pour mieux compte du bien aux variations de l'échantillon ainsi, la mise en œuvre negative les contrôles d'analyse et (si possible) dosage réplique est recommandé. Variation se produit généralement en raison de différences dans la quantité de particules du sol dans chaque puits et les erreurs de pipetage. Par conséquent, un fort mélange et une bonne technique de pipetage seront sensiblement réduire ainsi à une variation bien. En outre, nous vous suggérons fortement la mise en œuvre d'un contrôle de dosage négatif (tampon + solution de substrat) pour contrôler les incohérences de substrat au fil du temps. Ceci peut être facilement contrôlée lors de la lecture des plaques de l'enzyme en comparant les puits témoins négatifs (on utilise en général la dernière colonne sur les plaques à 96 puits). Les contrôles négatifs de substrat sont généralement stables, donc le signal augmente bien au-dessus de la limite de détection, elle est indicative d'une contamination ou d'un substrat d'instabilité, ce qui nécessite le remplacement du substrat et / ou des standards.

Pour maximiser le débit, notre protocole comprend plusieurs AEE potentiels dans un seul microplaques à puits profonds, bien que d'autres protocoles effectuer un type dedosage par plaque (c'est à dire un substrat par plaque) depuis différents AEE se produisent à des vitesses différentes. Peu importe, l'optimisation de l'enzyme doit être effectuée sur des sols avant d'effectuer cette démarche ou élevé tout au long de l'approche de la plaque unique. Substrats multiples peuvent être utilisés sur une seule plaque, si les vitesses de réaction sont relativement uniformes pour chaque enzyme à l'intérieur de la période de temps de l'incubation.

Notre protocole recommande ~ 2,75 g de sol pour rendre la solution de suspension, tandis que ~ 1 gramme est recommandé dans d'autres protocoles 24. Nous suggérons que l'utilisation de plus de terre (si possible) est une approche efficace pour une meilleure capture sein de l'échantillon de sol variation des niveaux d'activité enzymatique. Dans ce protocole, on incuber 800 ul de suspension de sol avec 200 ul de substrat, tandis que d'autres ne incuber 200 ul de suspension de sol avec 50 ul de substrats. Il s'agit simplement d'une fonction de mise à l'échelle jusqu'à ce que finalement, ne change pas l'activité mesurée. Il ya aussi des avantages pratiquespour l'utilisation de plus grands volumes. Premièrement, il est plus facile d'éviter les particules du sol lors du pipetage en noir des plaques à 96 puits à fond plat avant d'enregistrer l'intensité sur le fluorimètre correspondant. En second lieu, le volume supplémentaire est utile dans le cas de déversements accidentels tout en transférant les plaques à 96 puits à fond plat noires au fluorimètre avant l'enregistrement des intensités de fluorescence relatifs aux enzymes. Même de légères déviations dans le volume diminuera de façon significative la fluorescence entre puits. Enfin, en raison de la nature à haut débit de ce protocole, nous choisissons souvent de s'appuyer sur la réplication expérimentale pour représenter la variation du niveau de l'activité enzymatique plutôt que d'effectuer dosage réplique. Il est toujours préférable d'inclure la pratique répétitions d'analyse, mais dans la pratique, nous nous sentons notre protocole fournit un compromis équilibré entre les répétitions analytiques et expérimentales compte tenu des ressources limitées. De même, notre approche utilise un sol relativement plus bien homogénéisé (2,75 g) par dosage 25, qui sont inhérentesdiminue ntly-sol à l'intérieur de variations. La décision d'utiliser les répétitions d'analyse doit être soigneusement examinée par le test d'erreur d'analyse dans les études préliminaires 48. Cependant, nous recommandons que des modèles expérimentaux de moins de 4 répétitions du groupe expérimental devraient considérer sérieusement l'utilisation essai répétitions.

Sol, volumes de tampon, et l'optimisation de la concentration en substrat

Le tampon du sol: rapport de concentration substrat est une variable importante qui influence fortement la fluorescence mesurée lors de l'exécution des dosages enzymatiques. La quantité de terre dans la suspension ajoutée à doser ou la concentration du substrat peut être nécessaire d'ajuster en fonction de l'activité des enzymes dans l'échantillon de sol. Les montants retenus pour cet exemple ont été basées sur des tests précédente de ces sols pour s'assurer que la disponibilité du substrat a été non limitatif, et que nous mesurions taux maximal potentiel dans les conditions d'essai (V max) 44,45. Cependant, pour des échantillons de sol qui ont des concentrations élevées d'enzymes, la quantité de sol ou de la concentration de substrat doit être augmentée. Nous avons trouvé que l'augmentation des concentrations de substrat (et l'ajustement de la courbe d'étalonnage en conséquence) peut affecter la linéarité de la courbe. Par conséquent, nous vous recommandons de réduire les montants de sol et / ou des ajustements proportionnels à tampon volumes que nécessaire. Quoiqu'il en soit, il est important d'optimiser la concentration du substrat pour chaque type de sol à cause dosée AEE mesurés peuvent varier d'un ordre de grandeur plus grand entre les concentrations de substrat sous-saturés et saturés 26. Par conséquent les différences entre les traitements expérimentaux (etc) sont susceptibles de type II d'erreur statistique et moins susceptibles d'être détectées dans des conditions de sous-saturation, et l'erreur statistique 27,35. Pour optimiser les concentrations de substrat, préliminaires des essais enzymatiques devraient réalisée sur des échantillons représentatifs de sols en utilisant une large gamme de concentrations en substrat. Aprèsl'enregistrement de la fluorescence, tracer simplement les données (de manière similaire à l'exemple de courbe d'étalonnage, la figure 1) afin de déterminer la concentration du substrat (axe des x) qui correspond à l'activité enzymatique (axe des y), où les niveaux de réduction de pente (~ 0). De même, la concentration du substrat qui correspond au point où les niveaux de pente hors tension (0 ~) est une bonne indication de la concentration du substrat optimal pour que le sol notamment.

Ce dosage mesure la fluorescence en fin de compte sur une période donnée produite par le groupement fluorogène qui est clivé à partir du substrat à la suite de l'intermédiaire d'enzyme substrat dépolymérisation. Par conséquent, l'étape 5 (addition de substrat) est critique et doit être réalisée le plus efficacement possible afin de minimiser le temps entre le moment où le substrat est ajouté dans les sols et lorsque les dosages sont incubés. De même, une fois que le substrat entre en contact avec l'échantillon, les réactions enzymatiques vont commencer à se produire. Nous vous recommandons d'utiliser une multi-canalpipette pour cette raison. Il est fortement suggéré de devenir efficace en utilisant la pipette multi-canaux avant le jour où vous effectuez vos dosages enzymatiques. Pour ce faire, vous pouvez pratiquer le pipetage avec de l'eau jusqu'à ce que vous pouvez facilement transférer des volumes dans les plaques à 96 puits avec votre pipette.

Sol trempe

Trempe se réfère à la diminution de l'intensité de la fluorescence provoquée par des particules et / ou de matière organique dans les sols boues-incubations 26. Trempe peut être influencé par le réglage de la terre: les ratios de tampons 25. En raison de la fluorescence de fond à partir d'échantillons individuels, il est essentiel pour exécuter les normes avec des échantillons pour tenir compte de fond (trempe) fluorescence. Bien que certains protocoles utilisent une seule concentration après l'essai que le signal est linéaire, nous recommandons fortement la mise en œuvre d'un contrôle de refroidissement standard pour chaque échantillon à un meilleur contrôle des effets de la trempe. Ne pas le faire se traduira par un standcourbe ard pas applicable à l'échantillon, et une mauvaise estimation de l'activité enzymatique. L'ajout de normes pour les boues, n'est pas sensible au temps, comme l'ajout d'étalon n'affecte pas la fluorescence de l'échantillon de fond.

NaOH plus

L'addition de NaOH est utilisé dans certains protocoles d'optimiser les mesures d'activité enzymatique fluorométriques parce que le colorant fluorescent libéré à partir des substrats synthétiques présente une fluorescence pic à pH> 9,0 26,49. Lorsque l'on considère cette suggestion, la concentration de NaOH nécessaire à la suspension du sol pH (c'est à dire à pH> 9) varie en fonction du sol particulier et le tampon de pH utilisé 26. Cependant, d'autres soutiennent que NaOH peut-être pas nécessaire, car l'intensité du signal est généralement très élevé même à faible pH, et parce qu'il introduit une source supplémentaire d'erreur de mesure. Par exemple, l'effet des additions de NaOH à pH de la suspension et donc MUB fluore ou MUCchangements de scence au fil du temps 25. Substrats MUB liés ont été présentés pour démontrer fluorescence accrue cohérente pour 20 min après ajout de NaOH avant que les niveaux se rétrécissent, tandis MUC a démontré constante diminution fluorescence jusqu'à 60 min 26. Par conséquent, il est important de standardiser le temps entre l'addition de NaOH et la mesure de la fluorescence. Par ailleurs, si les niveaux de fluorescence sont suffisamment détectable sans plus, la conduite des essais sans addition de NaOH a été suggérée comme une alternative tout aussi acceptable 26.

Température

Sensibilité à la température doit être prise en compte pour déterminer la température d'incubation. Si l'intérêt principal est de comprendre la cinétique enzymatique, en utilisant trois ou plusieurs températures comme illustré en utilisant des parcelles d'Arrhenius (dans la section des résultats) est une approche robuste. Si le site de l'échantillon a caractéristique basse température tels que le sol du pergélisol, le duration de l'incubation peut être étendue pour tenir compte des enzymes pour réagir à des températures d'incubation plus froides. Bien que la cinétique enzymatique traditionnelles suggère qu'une augmentation de la température devrait se traduire par une activité accrue de l'enzyme, on a trouvé que les enzymes peuvent être spécifiques au site en terme de sensibilité à la température 50. Par conséquent, pour comprendre le potentiel de l'activité enzymatique spécifique de site, il est essentiel que soient ajustés température d'incubation et la durée de refléter les valeurs de site sur le terrain.

Conclusion

EE sont des facteurs critiques des processus biogéochimiques dans les sols, et donc nous devons être en mesure d'évaluer leurs activités. Il ya de nombreux défis à la mesure AEE dans les sols, y compris les interférences et l'inhibition. Malgré ces difficultés, des protocoles standardisés (comme celui décrit ici) peuvent être appliqués universellement pour mesurer AEE pour une large gamme d'enzymes. S'il est relativement facile de produire des données de qualité suivant ces protocoles, l'eninterprétation de ces données dans un contexte écologique nécessite un examen attentif de ce que ces tests sont vraiment mesurent, et comment AEE dans des conditions d'essai peuvent différer de ceux en vertu des conditions in situ.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Cette publication a été financée par les enzymes dans la coordination de la recherche du Réseau de recherche Environnement soutenu par la Fondation nationale des sciences des États-Unis (DEB n 1021559). Cette recherche a été financée par le US National Science Foundation (DEB n 1021559), et le Département de l'énergie Bureau des sciences (biologiques et la recherche environnementale) des États-Unis. Les opinions, constatations, conclusions ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des États-Unis NSF.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactifs :
4-Methylumbelliferyl &alpha ;-D-glucopyranoside (AG)Sigma AldrichM9766Dégradation du sucre
4-Methylumbelliferyl &beta ;-D-glucopyranoside (BG)Sigma AldrichM3633Dégradation du sucre
4-Methylumbelliferyl &beta ;-D-cellobioside (CB)Sigma AldrichM6018Dégradation de la cellulose
L-Leucine-7-amido-4-chlorhydrate de méthylcoumarine (LAP)Sigma AldrichL2145Dégradation des protéines
4-Méthylumbellifère N-acétyl-&bêta ;-D-glucosaminide (NAG)Sigma AldrichM2133chitine
4-Méthylumbellifère phosphate (PHOS)Sigma AldrichM8883Minéralisation du
phosphore4-Méthylumbellifèreryl-&bêta ;-D-xylopyranoside (XYL)Sigma AldrichM7008Dégradation de l’hémicellulose
4-Méthylombelliférone (MUB)Sigma AldrichM1381
7-Amino-4-méthylcoumarine (MUC)Sigma AldrichA9891
50 mM Acétate de sodium tampon anhydreFisher ScientificS210-500sols acides et neutres
50 mM Tris tampon de baseFisher ScientificBP154-1sols basiques
Équipement
Bel-Art Scienceware réservoirs de pipetage jetablesFisher Scientific14-512-65Électronique
 ; Eppendorf Xplorer ; Pipette à 8 canauxFisher Scientific13-684-265à 8 canaux, plage : 50-1 200 &mu ; l
TipOne 101-1 250 &mu ; l pointes naturelles de longueur allongéeUSA Scientific1112 - 172010 grilles de 96 pointes (960 pointes)
Plaque chauffante ; surface chauffante : 10 in x 10 in.Fisher Scientific11-100-100SHDisque de laboratoire plaque d’agitation magnétique
Mélangeur WaringFisher Scientific14-509-7PRécipient en acier inoxydable à deux vitesses ; 1 L (34 oz)
Distributeurs de bouteilles BRAND Dispensette III FisherScientific13-688-231Distributeur ; gamme : 5-50 ml
Wheaton Unispense &mu ; Pompes péristaltiquesP Fisher Scientific13-683-7Distributeur en option
Barre d’agitation magnétique FisherbrandFisher Scientific1451363SIXUtilisé pour agiter le sol après mélange
Bols en verre PyrexWorld Kitchen5304218Pyrex 10 oz Verre à crème pâtissière à rebords
Costar Plaques solides noires à 96 puitsFisher Scientific07-200-590Utilisé pour l’étape de lecteur de plaques
Blocs de dosage Costar 96 puitsFisher Scientific07-200-700V-bottom ; 2 ml ; stérile
Thermo Scientific Nunc 96 puits Tapis de recouvrementScientific14-387-93Tapis de recouvrement stérile 96 puits pour puits carrés
Centrifugeuse équipée de supports pour plaques de puits profondsThermo Scientific3121Centra-GP8 (ce modèle n’est plus disponible)
Lecteur de microplaques multifonctionnel Tecan Infinite série 200Tecan30016058(ce modèle n’est plus disponible)
Dégradation de la Fisher Lecteur de plaques

Références

  1. Burns, R. G., Dick, R. P. Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, CRC. (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O. Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. , Oxford University Press. (1999).
  15. Tabatabai, M. A. Methods of Soil Analysis. Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. 2, American Society of Agronomy, Inc. 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER - MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151(2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis - Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. Sterner, R. W., Elser, J. J. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279(1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79(1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

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