Nous décrivons des méthodes d'imagerie nous utilisons pour étudier la distribution et la mobilité des protéines fluorescentes transfectées résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) par l'intermédiaire de l'imagerie confocale de cellules vivantes. Nous analysons également ultrastructuralement l'effet de leur expression sur l'architecture de ce compartiment subcellulaire.
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Article de méthode
Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les lipides et des protéines dans les cellules eucaryotes sont continuellement échangés entre compartiments cellulaires, bien que ceux-ci conservent leur composition et les fonctions distinctif malgré le trafic interorganelle moléculaire intense. Les techniques décrites dans le présent document sont des moyens puissants de l'étude des protéines et de la mobilité des lipides et le trafic in vivo et dans leur environnement physiologique. récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de la fluorescence dans photoblanchiment (FLIP) sont largement utilisés techniques d'imagerie des cellules vivantes pour étudier le trafic intracellulaire par l'intermédiaire de la voie de l'exo-endocytose, la continuité entre les organelles ou des sous-compartiments, la formation de complexes protéiques, et la localisation des protéines en microdomaines lipidiques, qui peut être observée dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les limites de ces approches sont principalement dues à l'utilisation de protéines de fusion fluorescente, et leurs inconvénients potentiels comprennent un artefact sur-expression dans les cellules et la possibilité de différences dans le repliement et la localisation des protéines marquées et natives. Enfin, comme la limite de résolution de la microscopie optique (environ 200 nm) ne permet pas d'enquête de la structure fine de l'ER ou les sous-compartiments spécifiques qui peuvent provenir de cellules en situation de stress (c'est à dire l'hypoxie, l'administration du médicament, l'expression trop de transmembranaire protéines ER résidents) ou dans des conditions pathologiques, nous combinons l'imagerie des cellules vivantes des cellules transfectées cultivées avec ultrastructurale analyse basée sur la microscopie électronique à transmission.
Introduction
La découverte de la protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes spectrales, et le développement parallèle de la microscopie à fluorescence, ont ouvert complètement nouvelles avenues pour la recherche sur le comportement des protéines dans les cellules. Des techniques telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence dans photoblanchiment (FLIP), qui sont possibles en raison de la capacité intrinsèque de fluorophores à éteindre leur fluorescence sous éclairage intense, sont basées sur l'imagerie des cellules vivantes confocale et l'utilisation de transfectées des protéines de fusion fluorescente 3.1. Ils sont largement utilisés pour évaluer non seulement la localisation des protéines, mais aussi leur mobilité et le transport vésiculaire, qui peut révéler des indices importants concernant leur fonction 4.
La caractéristique unique des cellules eucaryotes est la présence de compartiments intracellulaires qui ont des compositions lipidiques et protéiques spécifiques. Bien que les organites sont physiquement isolated, ils doivent communiquer entre eux et partager des composants moléculaires, afin de maintenir l'homéostasie cellulaire. La voie de sécrétion garantit que les protéines et les lipides synthétisés dans le RE atteindre la destination finale correcte dans laquelle ils exercent leur fonction. Organites intracellulaires peuvent également être reliés par des sites de contact dynamiques qui permettent aux molécules (lipides) pour être directement échangés entre les compartiments. En outre, de nombreuses protéines ont de grands complexes assemblés dans hétéromériques ou associé avec des espèces lipidiques spécifiques (radeaux lipidiques / microdomaines) afin de devenir fonctionnellement active ou être transportés vers leur destination finale. Tous ces aspects biologiques influencent fortement les propriétés cinétiques des protéines, et peuvent donc être étudiés de façon appropriée au moyen des techniques décrites ci-dessous.
Notre groupe a largement utilisé FRAP et FLIP combinée avec la microscopie électronique pour étudier l'architecture de l'urgence et de ses différents sousdomaines. L'ER est la première station de la voie de sécrétion et joue un rôle clé dans les protéines et les lipides de tri 5. Il est un organite très dynamique dont les sous-domaines distincts refléter ses nombreuses fonctions différentes (c'est à dire des protéines et des lipides de biosynthèse et de la traite, le repliement des protéines, Ca 2 + stockage et la libération, et le métabolisme des xénobiotiques). Cependant, même si elles sont morphologiquement, spatialement et fonctionnellement distinctes, ces domaines sont continus les uns avec les autres, et leur abondance relative peuvent être modifiées dans des cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les plus connus et les domaines généralement spatialement distincts de l'ER sont l'enveloppe nucléaire, et le RE lisse et rugueux, mais nous et d'autres avons démontré qu'il existe des structures ER avec une architecture plus élaborée et organisation tridimensionnelle dans divers types de cellules et les tissus dans des conditions physiologiques qui peuvent également être induites par les moyens de stimuli stressants tels que l'hypoxie, la drogueadministration, ou la sur-expression de protéines transmembranaires 2,6 ER-résident (et les références qui y sont).
Nous avons récemment démontré la présence de telles structures dans des modèles cellulaires de maladies humaines 1,7. Originaire de la citernes empilées de RE lisse, ils ont reçu le nom collectif de réticulum endoplasmique lisse organisé (OSER) en 2003 6, mais ils sont également connus comme karmellae, lamelles, et cristalloïde ER sur la base de leur architecture qui, comme leur taille, peut varier. Après que les cellules sont transfectées avec la GFP fusionnée à la région de la queue cytosolique ancrée (TA) des protéines ER-résident (d EGFP-RE), la tendance à la dimérisation de la GFP dans faiblement trans altère considérablement l'organisation et de la structure de l'ER. FRAP et FLIP expériences ont montré que d EGFP-ER est libre de se diffuser à l'intérieur OSER, et le fait qu'il se déplace de l'ER réticulaire à la OSER et vice versa </ Em> indique que les agrégats sont en continuité avec l'ER réticulaire environnante. L'analyse ultrastructurale nous a permis de corréler les données de fluorescence avec une description détaillée de l'architecture OSER et l'organisation au niveau de l'échelle nanométrique: OSER sont toujours constitués d'empilements de citernes paires de RE lisse mais peuvent avoir différentes formes d'organisation spatiale, tels que disposés régulièrement sinusoïdale tableaux ou des spirales, ou des tableaux tubulaires "cristalloïdes" hexagonaux. Ces réarrangements conduisent à des morphologies cubes 8 qui, comme ils l'ont été trouvés dans les cellules dans des conditions physiologiques 9 et contraintes suivants tels que l'hypoxie 10, traitement de la toxicomanie 11, et le cancer 9, peuvent avoir un potentiel important en tant que marqueurs ultrastructuraux.
Après cette première démonstration en utilisant des protéines de fusion GFP, nous avons utilisé des expériences d'imagerie pour analyser la prolifération des domaines de l'urgence en réponse aux traitements pharmacologiques 12, assess la tendance des protéines fluorescentes pour oligomériser dans des cellules 13, et d'enquêter sur le rôle d'un mutant, protéines TA SLA liés à la formation d'agrégats intracellulaires d'origine ER qui peuvent être pertinents à son 1,8 de pathogénicité. Il a été suggéré que la formation d'agrégats intracellulaires (ce qui se produit dans de nombreuses maladies neurodégénératives 14) peut être un mécanisme de protection destinée à empêcher les interactions entre les protéines mutantes toxiques et les composants de la cellule autour de 15.
Ce qui suit est une description d'une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique pour enquêter sur des constructions dont les C-terminal domaines hydrophobes sont insérés dans la membrane du RE, et une analyse de leur comportement dynamique et les effets de leur surexpression sur le domaine de l'urgence l'architecture à des cellules en culture (voir la figure 1 pour un organigramme du protocole expérimental).
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Protocole
Une. Plasmide, culture cellulaire, et transfection avec ER protéines fluorescentes
- Le plasmide utilisé dans cette étude est constitué d'une version améliorée de la GFP fusionnée à son extrémité C-terminale de la région de la queue de l'isoforme d'ER de rat cytochrome b (5) (abrégé ici en tant que b (5)) par l'intermédiaire d'une séquence de liaison. La région de queue contient la séquence entière (Pro94-Asp134) qui reste associée à la membrane après le clivage par la trypsine de b natif (5), y compris la DMT de 17 résidus (domaine transmembranaire), flanqué par des séquences polaires amont et aval (UPS et DPS) . Le lieur est constitué de l'épitope myc suivi de [(Gly) 4 Ser] 3, et l'ensemble de l'ADNc est inséré dans les sites Hind3-Xba1 du vecteur d'expression de mammifère pcDNA3. Les détails de la construction de ce plasmide ont été décrites dans une publication antérieure dans laquelle elle est désignée comme la GFP-ER 16.
- Cultivez cellules COS-7 en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% fetal de sérum bovin, 2 mM de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine dans un incubateur à 37 ° C et 10% de CO 2.
- Transfection. La plaque 3 x 10 5 cellules sur une lamelle de verre ronde dans une plaque à 6 puits et, le jour suivant, transfecter avec le système JetPEI comme décrit par le fabricant. A noter que le rapport optimal JetPEI / ADN a été testé afin de déterminer l'efficacité de transfection maximale en fonction du plasmide et la lignée cellulaire utilisée: dans notre cas, une JetPEI: rapport d'ADN de 2:1 conduit à 70-80% de l'efficacité de transfection.
2. Direct fluorescence microscopie confocale à balayage
- Imagerie des cellules vivantes. Placer la lamelle sur laquelle les cellules transfectées ont été ensemencées dans une chambre de cellule de la culture de l'acier pour 24 mm lamelles remplis avec du DMEM w / o rouge de phénol, complété avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine, 25 mM d'HEPES , 50 ug / ml de cycloheximide et 1:100 OxyFluor pour empêcher les échantillons de photoblanchiment. Un microscop SP5 confocalee équipé d'un incubateur à CO2 à température contrôlée (37 ° C et 5% CO 2) est utilisé pour des expériences d'imagerie des cellules vivantes, avec d GFP-ER étant visualisé en utilisant un laser à 488 nm et d'un filtre 525/50 passe de la bande d'émission.
- récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Dessiner une région d'intérêt (ROI), correspondant à une structure OSER, et blanchir à l'aide de 20 itérations et une combinaison de 488 nm (100% d'un laser Argon 30 mW, ce qui correspond à 5,5-6 mW à l'échantillon) et 405 nm (60% de 30 mW Diode laser 405, correspondant à 11,6 mW à l'échantillon) lasers qui, dans notre expérience, conduit à photoblanchiment efficace et rapide.
- Enregistrer la reprise de la fluorescence dans les régions d'intérêt blanchis en prenant une seule image toutes les 10 secondes pendant 10 minutes (temps de pixel = 1,61 ps / px).
- perte de fluorescence dans photoblanchiment (FLIP). Dessinez un retour sur investissement correspondant à une structure OSER, et l'eau de Javel comme décrit ci-dessus. Le blanchiment est répété toutes les 30 secondes,et les images post-blanchiment sont enregistrées toutes les 10 secondes pendant 30 minutes (temps de pixel = 1,61 ps / px).
- FRAP et FLIP analyse. Toutes les images sont analysées en utilisant le logiciel ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). Dans les expériences de FRAP, la récupération de la fluorescence de la ROI blanchie est mesurée au cours du temps et normalisées par rapport à la fluorescence totale des cellules blanchie, qui est toujours contrôlée pour être constante dans le temps.
- Pour les expériences de FLIP, tirer un retour sur investissement en dehors de l'OSER blanchi et couvrant l'ensemble de la cellule. Mesurer l'intensité de la fluorescence au cours du temps et à normaliser les niveaux de fluorescence d'un retour sur investissement tirés sur une cellule non blanchie afin de corriger toute diminution de la fluorescence provoquée par la formation d'image lui-même.
- Dans toutes les expériences, soustrait le signal de fond (déterminé dans une zone à l'extérieur des cellules) à partir des intensités de fluorescence des régions d'intérêt. Enfin, tracer les résultats en utilisant Gr.aphPad logiciel Prism.
3. Ultrastructurale Analyse par microscopie électronique à transmission
Compte tenu de la toxicité de la plupart des réactifs, toutes les procédures devraient être effectuées portant un laboratoire approprié. manteau et des gants sous une hotte.
- Après élimination de la lamelle de la boîte de Pétri, fixer les cellules cultivées restantes sur le fond de la cuvette en monocouche en utilisant filtré 2% de glutaraldéhyde dans 0,1 M de tampon cacodylate, pH 7,4, pendant 10 min à température ambiante.
- Grattez les cellules en utilisant un grattoir en téflon et les transférer dans 1,5 ml tubes Eppendorf. Sédimenter les cellules par centrifugation à 9000 g pendant 10 min. Retirer le surnageant, ajouter du fixateur frais, et laisser une nuit à 4 ° C.
- Laver les pastilles avec le tampon, puis post-fixation avec une solution de tétroxyde d'osmium à 1% dans du tampon cacodylate pendant 1 heure à température ambiante.
- Rincer à l'eau MilliQ, et en bloc tache avec1% d'acétate d'uranyle dans de l'eau distillée pendant entre 20 à 60 min.
- Déshydrater les échantillons en série croissante d'éthanol (70%, 80%, 90%, 100% et 100% pendant 10 min chacun), et le laver deux fois brièvement dans de l'oxyde de propylène (15 min chacun).
- Infiltrer les échantillons dans un mélange d'oxyde de propylene + Epon (1:1) (à partir de 2 h à une nuit).
- Incorporer dans une résine époxy Epon durci à 60 ° C pendant au moins 24 h.
- Section des blocs de résine taillés manuellement à l'aide d'un ultramicrotome LEICA UC6 équipé d'un couteau de diamant de 45 ° pour obtenir sections d'une épaisseur de 60-70 nm. Recueillir les sections sur les 300 mailles des grilles de cuivre.
- Colorer les sections sur la grille avec une solution saturée d'acétate d'uranyle (20 min) et du citrate de plomb (7 min), bien se laver les grilles en les plongeant dans de l'eau filtrée bi-distillée, et laissez-les sécher à température ambiante.
- Les grilles colorées sont observées en utilisant un microscope électronique à transmission TECNAI G2, et les images sont capturées en utilisant un Bottcaméra CCD om-monté à différents grossissements finales (allant généralement de 6,000-39,000 X).
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Résultats
La figure 2 montre une étude d'FRAP d'exemple de la mobilité de la protéine. La mobilité de la protéine EGFP d-ER est démontrée par la récupération rapide de la fluorescence après photoblanchiment dans OSER blanchies. Pour l'analyse quantitative, la mi-temps et fraction mobile ont été calculées à partir des données mesurées expérimentalement par ajustement de l'équation monoexponentielle suivante:
F (t) = F + poste (poste F rec-F)...
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Discussion
Les protocoles et les méthodes d'imagerie décrites dans le présent document ont été utilisées pour étudier la distribution et la mobilité des transfectées TA protéines fluorescentes résidents dans le RE de cellules vivantes. Nous avons également analysé l'effet de l'expression excessive de ces protéines sur l'architecture de ce compartiment sous-cellulaire à l'aide d'analyses ultrastructurales.
La combinaison de cellules vivantes imagerie confocale et la microscopie é...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants à Fondazione Filarète pour son aide et son appui à la publication de cet article. Nous tenons également à remercier Centro Europeo di Nanomedicina pour l'utilisation du microscope électronique à transmission TECNAI G2.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM) sans rouge de phénol | Invitrogen | 31053028 | |
| sérum de veau fœtal (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldéhyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Cacodylate de sodium trihydraté | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Tétroxyde d’osmium 4 % solution | Microscopie électronique Science | 19150 | |
| Acétate d’uranyle dihydraté | Sigma Aldrich | 73943 | |
| Oxyde de propylène | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Microscopy Microscopy Science | 17800 | |
| Centrifugeuse de paillasse | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope confocal spectral | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Couteau diamanté | Diatome | Ultra 45 ° ; | |
| Microscope électronique à transmission | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| Chambre de cellule de culture en acier pour lamelle de 24 mm | Outils de bioscience | CSC-25 | |
| Grilles de microscopie électronique | Microscopie électronique Science | G300Cu |
Références
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