Un procédé amélioré pour la préparation de collagène de type I de la peau

Résumé

Les procédures traditionnelles pour l'isolement de soluble de type 1 collagène (COL1) nécessitent environ 10 jours à partir de début à la fin en raison d'incubations de tampons de longues et laborieuses remises en suspension de fibrilles. Ici, nous décrivons un moyen de purifier COL1 de petites biopsies cutanées en moins de 3 heures.

Résumé

Type de collagène soluble 1 (COL1) est largement utilisé comme un substrat adhésif pour des cultures de cellules et comme échafaudage pour des applications de régénération cellulaire. Cliniquement, cette protéine est largement utilisé pour la chirurgie esthétique, les injections par voie cutanée, greffe osseuse, et la chirurgie reconstructrice. Les sources de COL1 pour ces procédures sont souvent non-humain, ce qui augmente le potentiel de l'inflammation et de rejet ainsi que la transmission de la maladie des xénobiotiques. Compte tenu de cela, une méthode pour purifier efficacement et rapidement COL1 de quantités limitées de tissus autologue dérivés serait de contourner la plupart de ces questions, mais les protocoles d'isolement classiques sont longues et nécessitent souvent de grandes quantités de tissus de collagène. Ici, nous démontrons une méthode d'extraction COL1 efficace qui réduit le temps nécessaire pour isoler et purifier cette protéine d'environ 10 jours à moins de 3 heures. Nous avons choisi le derme que notre source de tissus en raison de sa disponibilité au cours de nombreuses interventions chirurgicales. Tsa méthode utilise des tampons d'extraction traditionnelles combinées avec une agitation énergique et filtration centrifuge pour obtenir très pur, COL1 soluble de petites quantités de corium. Brièvement, des biopsies dermiques sont lavées à fond dans glacée dH ₂ O après élimination de la graisse, le tissu conjonctif, et les cheveux. Les échantillons de peau sont dépouillés de protéines non collagéniques et des polysaccharides à l'aide de 0,5 M d'acétate de sodium et d'un homogénéisateur de paillasse à grande vitesse. Le collagène de solides résiduels est ensuite extrait avec un tampon de citrate de sodium 0,075 M à l'aide de l'homogénéisateur. Ces extraits sont purifiés en utilisant des filtres de 100 000 MW de coupure centrifuges qui produisent des préparations COL1 de qualité comparable ou supérieure à celle des produits du commerce ou de ceux obtenus en utilisant des procédures traditionnelles. Nous prévoyons que cette méthode facilitera l'utilisation de COL1 autologue dérivée pour une multitude de recherche et les applications cliniques.

Introduction

Pendant des décennies, les chercheurs et les fournisseurs commerciaux ont isolé solubilisé COL1 à partir d'un assortiment de sources tissulaires, y compris la peau et des tendons à l'aide des variations d'un protocole d'extraction de l'acide simple, suivie d'une neutralisation, ce qui conduit à une remise en suspension d'une matrice de fibrilles COL1 organisés qui peut être utilisé pour une multitude d'applications biomédicales ^4.1. Bien qu'il existe de nombreux exemples d'applications cliniques pour COL1, quelques-uns de ces emploient COL1 autologue dérivée parce que la préparation de cette protéine nécessite de longues extractions de prendre des jours ou des semaines pour effectuer ^5-7. En conséquence, les enquêteurs de la recherche et les médecins utilisent généralement coûteux, les préparations commerciales de COL1 qui sont préparés à partir de tissus non humains tels que le rat, le boeuf, ou corium porcine ou en utilisant la peau retirée de cadavres ou après la circoncision. Pour les applications de régénération, beaucoup de ces produits présentent la variabilité par rapport à leur capacité à former solidedes matrices ou des constructions de tissu capables de supporter la fixation et la croissance cellulaires. Par conséquent, il ya un net besoin d'une nouvelle méthode normalisée conçu pour extraire rapidement COL1 à partir de sources de tissus autologues accessibles et abondantes.

Une telle méthode permettrait d'économiser à la fois temps et argent dans le cadre de la recherche où COL1 pourrait être extrait du modèle animal d'intérêt et utilisé pour les essais précliniques de tissus modifiés assemblés sur des échafaudages à base de collagène. Dans le même temps, ayant la possibilité d'utiliser, d'une manière autologue COL1 dérivé rapidement isolées en clinique augmenterait la sécurité globale des patients qui seraient autrement recevoir allogénique ou xénogénique préparations. Pour les patients recevant une préparation autogène, cette méthode simplifiée permettrait de réduire considérablement l'intervalle entre la collecte de biopsie et de l'application de collagène. Pour ces raisons, nous avons cherché à améliorer une méthode d'isolement et de purification COL1 établie de longue date en utilisant ag haut débititation et d'exclusion de taille centrifugation. Cette méthode est simple à réaliser en utilisant des tampons et les équipements standards trouvés dans de nombreux laboratoires. En employant une agitation à grande vitesse, notre protocole réduit le temps nécessaire pour isoler soluble, cutanée COL1 d'environ 10 jours à moins de 3 h ^8. Fait important, cette méthode peut être facilement réalisée dans le cadre clinique pour préparer COL1 dérivé autologue pour une utilisation chez les patients au cours d'une seule série de procédures.

Protocole

Ici, nous allons démontrer l'isolement de COL1 de peau d'agneau. Comme écrit, ce protocole peut également être utilisé pour isoler avec succès COL1 de lapin et de la peau humaine.

Une. Préparer cutanée échantillon

1. Tous les réactifs s'équilibrer à 4 ° C avant utilisation.
2. Rincer échantillon cutanée (25-50 g) dans de la glace-froid dH ₂ O et retirez tout laine, fourrure, ou les cheveux avec de la crème dépilatoire.
3. Utilisez une lame de rasoir unique de pointe pour gratter l'échantillon de tissu propre et la graisse.
4. Rincer l'échantillon dans de la glace-froid dH ₂ O.
5. Couper l'échantillon de peau de 1 cm x 1 cm morceaux avec une lame de rasoir unique de bord.

2. Retirer collagènes solubilisés Matériel

1. Peser 5 g d'échantillon de 50 ml par tube conique et ajouter 30 ml de 0,5 M d'acétate de sodium par de la glace.
2. Mélanger les tubes pendant 1 min à la mise en m / s ou 6 à l'aide d'un adaptateur de tube de 50 ml dans l'homogénéisateur de paillasse.
3. Jeter supernatant et répéter pour un total de 7 acétate de sodium cycles de lavage.
4. Rincer l'échantillon dans de la glace-froid dH ₂ O et mélanger une fois pour éliminer l'acétate de sodium résiduel.
5. Utilisez une spatule pour comprimer l'échantillon contre le côté du tube pour enlever l'excès de liquide, puis les transférer à un 50 ml nouveau tube conique.

3. Collagène de type I Extraction

1. Laver deux fois dans l'échantillon de 2 ml / g 0,075 M de tampon citrate de sodium pendant 1 min à 6 m / sec dans la paillasse homogénéisateur comprimant l'échantillon et élimination du surnageant après chaque lavage.
2. Ajouter une 2 ml / g de portion aliquote fraîche du tampon citrate 0,075 M de sodium à l'échantillon.
3. Effectuez 6 séquentielle 1 min, 6 m / s paillasse homogénéisateur mélange cycles d'agitation sans enlever le tampon entre chaque cycle.
4. Transférer l'épaisse surnageant clair à un tube de collecte.
5. Ajouter un tampon de citrate de sodium 0,075 M supplémentaire de 1 ml / g de l'échantillon et effectuer une dernière paillasse homogénéisateur agitationcycle tion.
6. Ajouter cette surnageant final à un tube de collecte.
7. Centrifuger le tube de prélèvement à 3200 xg pendant 10 min à 4 ° C.
8. Transférer le surnageant dans le compartiment supérieur d'un poids moléculaire de 100.000 couper dispositif de filtre centrifuge.
9. Centrifuger à 3200 g pendant 30 min à 4 ° C.
10. Transférer la COL1 purifié à partir du compartiment supérieur à un tube conique et conserver à 4 ° C.

Résultats

Ce protocole d'isolement COL1 nécessite environ 2 heures et 15 minutes à compléter. La figure 1 montre un schéma décrivant les principales étapes de cette procédure. Préparation de l'échantillon et d'effectuer les 7 cycles de agitations à grande vitesse et se rince avec de l'acétate de sodium prend environ 35 min (figures 1A-C). Effectuer une agitation et le cycle de rinçage avec dH ₂ O prend environ 5 min (figures 1D et 1E). Ajoutant du citra...

Discussion

Un élément essentiel de cette méthode est la compression efficace répétée de l'échantillon cutané pour éliminer l'excès de liquide. Il est essentiel d'éliminer l'acétate de sodium, autant que possible à l'étape 2.5 en comprimant l'échantillon. On utilise une spatule pour compacter la peau contre le côté du tube, mais étamine pourrait également être utilisé, bien que cela nécessiterait le retrait de l'échantillon à partir du tube et augmenter le temps nécessaire pour effectuer ces étapes. De m...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
Centrifugeuse	Beckman	J6-MI	Rotor à godets pivotant pour accueillir des tubes coniques de 50 ml à 3 200 x g.