Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l'imagerie et immunohistochimie

Résumé

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Résumé

Travailler avec des tissus délicats peut être un facteur de complication lors de la réalisation d’une évaluation immunohistochimique. Ici, nous présentons une méthode qui utilise une membrane en PTFE hydrophile soutenue par un anneau pour fournir un soutien structurel aux tissus vivants et fixés pendant le traitement immunohistochimique, ce qui permet l’utilisation d’une variété de protocoles qui causeraient autrement des dommages au tissu. Tout d’abord, cela est démontré avec le chargement en bolus de marqueurs fluorescents dans le tissu rétinien vivant. Cette méthode permet une visualisation rapide des structures ciblées, tandis que le support de la membrane maintient l’intégrité du tissu pendant l’injection et permet un transfert facile de la préparation pour une imagerie ou un traitement ultérieur.

Deuxièmement, une procédure de coloration des anticorps dans les tissus fixés au carbodiimide est décrite. Bien que la fixation du paraformaldéhyde soit plus courante, la fixation du carbodiimide fournit un substrat supérieur pour la visualisation des protéines synaptiques. Une limitation du carbodiimide est que le tissu fixé qui en résulte est relativement fragile ; Cependant, ce problème est surmonté grâce à l’utilisation de la membrane de support. Le tissu rétinien est utilisé pour démontrer ces techniques, mais elles peuvent être appliquées à tout tissu fragile.

Introduction

La réalisation d’une immunohistochimie dans des tissus intacts délicats présente un risque d’endommagement lors de la manipulation et du transfert. Cela peut se produire soit dans des tranches de cerveau, soit dans d’autres tissus minces, tels que la rétine dégénérée. De plus, certaines méthodes de fixation tissulaire peuvent être avantageuses pour l’immunomarquage des structures neuronales, mais entraînent une stabilité structurelle compromise, empêchant leur utilisation. Un exemple particulier de cela est la fixation à base de carbodiimide, qui est supérieure pour colorer les récepteurs et les hormones^{1 à 7}, mais qui est généralement évitée en raison de l’instabilité du tissu fixé.

Ici, nous décrivons une procédure qui utilise une membrane PTFE hydrophile pour soutenir structurellement les tissus délicats, fixés ou non, pour une variété de techniques de coloration. La membrane de support permet de manipuler les tissus délicats avant et après la fixation, ce qui permet plusieurs étapes de traitement tout en minimisant le risque de lésions tissulaires. Dans l’ensemble, cette méthode simple pour préserver l’intégrité des tissus offre la possibilité d’utiliser des techniques qui pourraient autrement être évitées. En tant que telle, cette approche pourrait également être utilisée avec succès pour la préparation d’une grande variété de tissus tels que des tranches de cerveau qui deviennent fragiles à la suite de procédures de tranchage.

Protocole

Dans toutes les procédures expérimentales, les animaux ont été traités conformément aux réglementations de la déclaration ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et conformément aux protocoles approuvés par le Weill Cornell Medical College. Les animaux ont été euthanasiés par le dioxyde de carbone et ont ensuite subi une luxation du col de l’utérus.

1. Dissection de la rétine entière

1. Une fois la souris euthanasiée, énucléez ses yeux et placez-les dans une solution de Ringer oxygénée tamponnée à HEPES (Tableau 1).
2. Retirez la cornée en coupant dans un chemin circulaire le long de l’ora serrata avec de petits ciseaux, en tenant l’œil au niveau du limbe avec une pince. Retirez l’objectif avec une pince.
3. Retirez autant de vitré que possible à l’aide d’une pince à bord émoussé. Cette étape est importante pour les injections de bolus et les enregistrements électrophysiologiques ; Il n’est pas nécessaire pour effectuer l’immunohistochimie seule.
4. Détachez la rétine de l’œilleton en positionnant la pince entre la rétine et l’œilleton, en déplaçant lentement la pince sur la circonférence. Stabilisez l’œilleton en tenant fermement la sclérotique à l’aide d’une deuxième paire de pinces. Coupez le nerf optique à l’endroit entre la rétine et l’œilleton pour faciliter la séparation de la rétine de l’œilleton.
5. La rétine peut être disséquée en morceaux (par exemple, des quartiers) ou utilisée dans son ensemble. Pour couper en morceaux, utilisez des ciseaux pour faire des incisions de la périphérie de la rétine jusqu’au nerf optique. Alternativement, pour utiliser toute la rétine, faites des incisions de la périphérie à mi-chemin du nerf optique. Les incisions aideront à faire une préparation plate.

2. Montage sur un insert de membrane PTFE hydrophile

1. Préparez la membrane comme décrit ci-dessous. Lors d’enregistrements physiologiques ou d’expériences d’injection de colorant, raccourcissez le support à l’aide d’un tour ou d’une scie à main de sorte que l’anneau restant ait une hauteur de 1 mm.
   Remarque : Les inserts de la plaque de culture peuvent être non modifiés ou modifiés (Figure 1A). Le choix de la configuration est dicté par le but de l’expérience. Pour l’immunomarquage, un insert non modifié convient.
2. Polissez les surfaces rugueuses avec du papier de verre fin (grain 300 ou plus).
3. (Facultatif) Retirez les pieds sous l’anneau avec des ciseaux.
4. Pour éliminer les débris, rincez ou sonicez la membrane dans de l’eau distillée pendant 2 à 3 minutes.
5. Montez le tissu sur la membrane (Figure 1A). Placez le tissu avec un peu de solution sur la membrane à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Coupez l’extrémité étroite de la pipette si nécessaire, pour éviter que l’échantillon de tissu n’adhère à la pipette pendant le transfert.
6. Fixez la rétine avec les cellules ganglionnaires (GC) vers le haut : sur la membrane, retirez progressivement la solution tout en étalant la rétine et en dépliant les plis à l’aide d’une pince.
7. Sur le côté opposé de la membrane, placez une seringue vide (1 ml) directement sous le tissu. Appliquez l’aspiration en tirant sur le piston jusqu’à un volume de 0,2 à 0,3 ml. Augmentez la surface d’aspiration en coupant l’embout de maintien de la seringue avant l’utilisation. Le tissu ne nécessite pas de traitement supplémentaire pour l’adhérence, car il est physiquement enchevêtré dans la membrane.

3. Injection en bolus d’isolectine Alexa 488

1. Préparez des pipettes patch et une solution de coloration. Tirez des pipettes patch en verre capillaire borosilicaté avec un extracteur Flaming/Brown, avec une résistance de ~1 MΩ. Cassez doucement la pointe de la pipette.
2. Préparez la solution de coloration en ajoutant 0,3 μl de solution mère d'isolectine Alexa 488 à 10 μl de la solution de Ringer tamponnée HEPES décrite à l'étape 1.2.
3. Transférez l’échantillon vers la configuration de patch-clamp pour l’injection (Figure 1C). Placez la membrane avec le tissu attaché dans la chambre d'enregistrement imprégnée d'une solution de Ringer chauffée (37 °C) et oxygénée par HEPES.
4. Placez la pipette contenant le colorant contre la membrane limitante interne (ILM, Figure 2A). À l’aide d’un micromanipulateur, avancez davantage la pipette contre l’ILM jusqu’à ce qu’elle le pénètre. Injectez la solution de coloration avec une pression de 10-20 psi pendant 1 seconde à l’aide d’un picospritzer. Un ou plusieurs endroits peuvent être ciblés pour l’injection (figure 2B). Si un picospritzer n’est pas disponible, une seringue de 10 ml peut être utilisée pour délivrer une pression d’air positive pour l’injection.
5. Incuber le tissu injecté pendant 10 min. Pendant l’incubation, le tissu injecté peut être visualisé sous un éclairage d’épifluorescence.
6. Après l’étiquetage, la préparation peut être transmise à un microscope pour l’imagerie. Transférez l’insert dans une boîte de culture à fond de verre, en plaçant la rétine vers le bas (Figure 1C).
7. Ajoutez une goutte de solution HEPES pour garder l’échantillon humide.
8. Placez 2-3 points de graisse sous vide autour du périmètre de l’anneau en plastique pour fixer fermement l’insert au fond de la boîte de culture.
9. Transférez la parabole sur la platine du microscope.

4. Fixation du paraformaldéhyde et du carbodiimide

1. Fixez l’échantillon en transférant l’insert dans le fixateur pendant 15 min. Des temps de fixation plus longs ou plus courts peuvent être utilisés, en fonction de l’application. Les deux fixateurs peuvent être utilisés efficacement pour fixer la GFP, l’isolectine ou les hydrazides fluorescents Alexa (par exemple, utilisés pour remplir les cellules dans les enregistrements patch-clamp).
   Remarque : Pour la fixation, des solutions de carbodiimide à 4 % ou de paraformaldéhyde à 4 % peuvent être utilisées. Pour maintenir l’adhérence, la fixation doit être effectuée après que le tissu a déjà été attaché à la membrane. Le tissu peut être fixé immédiatement après le montage, ou après un enregistrement physiologique et/ou une injection en bolus.
2. Rincer le tissu dans un tampon phosphate (PB) pendant 30 min. Après cela, le tissu peut être traité soit en tant que montage entier (étape 5), soit coupé en sections verticales, puis traité (étapes 6 et 7).

5. Immunocoloration des Wholemounts rétiniens

1. Dans une boîte à 24 puits (Figure 1D), bloquez les morceaux rétiniens sur la membrane pendant 1 heure dans une solution de coloration.
2. Diluer les anticorps primaires anti-PSD-95 de souris à 1:300 dans la solution de coloration et appliquer pendant 48 heures à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter ~100-150 μl de solution d’anticorps dans chaque puits avec le tissu. Pour éviter le dessèchement, remplissez les puits inutilisés avec de l’eau distillée.
3. Rincer 20 min dans PB, 3x.
4. Incuber pendant 24 heures dans l’anticorps secondaire anti-souris Alexa 568 dissous 1:500 dans la solution de coloration.
5. Rincer 20 min dans PB, 3x.
6. Placez l’insert avec le tissu coloré dans une boîte de Pétri standard de 3 cm remplie de solution de PB. Avec de petits ciseaux, découpez la partie de la membrane contenant la rétine de l’anneau.
7. Transférez la rétine sur la membrane sur une lame de rétine vers le haut. Retirez le PB, ajoutez le support de montage. Placez de petits morceaux d’une vitre brisée entre la diapositive et les lunettes pour éviter une compression importante et des dommages à la rétine. Placez la lamelle.
8. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles. Conservez les diapositives dans l’obscurité, dans un réfrigérateur.

6. Section verticale de tissus montés sur membrane

1. Après la fixation, immergez le tissu sur la membrane dans les solutions de gradient de saccharose de 10 %, 20 % et 30 % de saccharose pendant 30 min, 1 heure et toute la nuit, respectivement. L’étape de nuit est effectuée à 4 °C au réfrigérateur, toutes les autres étapes à température ambiante.
2. À l’aide de ciseaux, retirez la membrane avec le tissu de l’anneau d’insertion en plastique.
3. Placez la membrane coupée sur Parafilm avec la rétine vers le haut et retirez autant de solution que possible avec des lingettes Kimwipes.
4. Placez le Parafilm avec le tissu dans la chambre du cryostat et ajoutez une goutte de milieu OCT. Utilisez le dispositif de congélation rapide pour accélérer la congélation.
5. Détachez l’échantillon congelé et retournez-le.
6. Laissez environ 2 mm autour de l’échantillon sur trois côtés et laissez 5 à 6 mm du côté qui sera fixé au support.
7. Couvrez le côté rétinien exposé (côté membrane) avec une goutte d’OCT. Laissez la zone d’attache libre.
8. Congelez la membrane avec du tissu rétinien. L’échantillon est maintenant prêt à être placé sur un support de coupe.
9. Placez une goutte d’OCT sur un anneau de support froid. Insérez immédiatement l’échantillon congelé dans la goutte.
10. Coupez des sections de 10 à 20 μm d’épaisseur, en réglant la température du cryostat à -19 °C. Utilisez des lames d’adhérence en polysinus chaudes (à température ambiante). Laissez les lames avec les sections attachées sur une plate-forme chauffante pendant ~2-3 min (41 °C) dans l’obscurité pour assurer une bonne adhérence des sections.
11. Mettez les lames dans une boîte de rangement et conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.

7. Immunocoloration des coupes rétiniennes

1. Sortez les lames avec les sections du congélateur. Laissez-les rester à température ambiante pendant 1 min pour éliminer le condensat.
2. Encerclez les sections avec un bloqueur de liquide pour créer une barrière pour une incubation ultérieure.
3. Placez les lames dans la boîte d’incubation. Couvrez le fond de la boîte avec de l’eau pour éviter l’évaporation de la solution d’anticorps.
4. Rincer avec du PB pendant 5 min.
5. Préparez les mêmes solutions de coloration et suivez les étapes de l’étape 5. L’incubation avec l’anticorps primaire dure la nuit et celle de l’anticorps secondaire 1 heure. N’utilisez pas de verre brisé entre la lamelle et la glissière.

Résultats

Deux expériences représentatives qui bénéficient de l’utilisation d’une membrane PTFE hydrophile pour soutenir l’ensemble de la rétine pendant les procédures de coloration. La première expérience illustre la méthode de caractérisation rapide et simple du système vasculaire rétinien, un réseau élaboré de vaisseaux sanguins qui s’étend sur plusieurs couches de la rétine (Figure 2). Cette approche combine le chargement en bolus d’isolectine avec le marquage par immersion avec SRH. Il s’agit d’une méthode e...

Discussion

La biocompatibilité élevée et la transparence des solutions de la membrane PTFE hydrophile sont avantageuses lorsqu'on travaille avec des tissus vivants. Cette préparation a été utilisée avec succès dans des travaux antérieurs pour l’enregistrement par patch-clamp des réponses lumineuses^8-10. Ici, nous montrons comment cette approche peut être adoptée pour l’analyse structurale de la rétine entière.

La technique de chargement en bolus peut être utilisée efficacement pour le marquage...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Insert de culture cellulaire Millicell, 12 mm, PTFE hydrophile (Biopore), 0,4 &mu ; m	Millipore	PICM01250
Seringue à insuline, 1 ml	Beckton Dickinson	309659
Ciseaux	Fine Science Tools	15003-08	dissection
Forceps, Dumont #55, inox	Fine Science Tools	11255-20	dissection
Cryostat	Leica	divers
Système de microscope confocal	Nikon	divers
Verre capillaire	World Precision Instruments	1B150F-4
P-97 Tire-pipette flamant/brun Sutter	Instrument Co.
Picospritzer III	Parker Hannifin
Plats de culture à fond de verre	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Boîte de Pétri	Falcon	1008
Pipettes de transfert graduées jetables	VWR	16001-180
Plaques multipuits, 24 puits	Beckton Dickinson	351147
Verre de couverture, #1	Microscopie électronique Sciences	72200-30
Lames d’adhérence polysinus	Microscopie électronique Sciences	63412-01
Lames de microscope	Globe	1301
Bloqueur de liquide	Microscopie électronique Sciences	71312
Support de montage VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000
OCT moyen	Sakura	4583
Parafilm film de laboratoire	Fisher	13-374-10
Dow Corning graisse sous vide poussé	Sigma-Aldrich	Z273554
Souris anti-PSD95	Millipore	MABN68	anticorps
Donkey anti-souris Alexa 568	Invitrogen	A10037
anticorps Isolectine Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sulforhodamine	Sigma-Aldrich	341738
Carbodiimide	Thermo Scientific	22980	EDC
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148