Par rapport à la chromatographie d’affinité traditionnelle utilisant des colonnes remplies de perles d’agarose de protéine A, les adsorbeurs membranaires de protéine A peuvent accélérer considérablement l’isolement à l’échelle du laboratoire des anticorps et d’autres protéines exprimant des fragments Fc. Des méthodes d’analyse et de quantification appropriées peuvent accélérer davantage le traitement des protéines, permettant d’isoler et de caractériser en une journée de travail, au lieu de plus de 20 heures de travail.
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Article de méthode
Isolation et caractérisation de protéines humaines chimériques exprimant fc à l’aide d’adsorbeurs membranaires de protéine a et d’un flux de travail rationalisé
Dans cet article
Résumé
Résumé
La purification à l’échelle du laboratoire à l’échelle industrielle des biomolécules des surnageants de culture cellulaire et des solutions cellulaires lysées peut être réalisée à l’aide de la chromatographie d’affinité. Bien que la chromatographie d’affinité utilisant des billes d’agarose A poreuses emballées dans des colonnes soit sans doute la méthode la plus courante d’isolement à l’échelle du laboratoire d’anticorps et de protéines recombinantes exprimant des fragments fc d’IgG, cela peut être un processus long et coûteux. Les contraintes de temps et financières sont particulièrement intimidantes dans les petits laboratoires de sciences fondamentales qui doivent récupérer des centaines de microgrammes à des quantités de milligrammes de protéines à partir de solutions diluées, mais qui n’ont pas accès à des systèmes d’administration de liquides à haute pression et / ou à du personnel spécialisé dans les bioséparations. De plus, la quantification et la caractérisation des produits peuvent également allonger excessivement le temps de traitement sur plusieurs jours de travail et gonfler les dépenses (consommables, salaires, etc.). Par conséquent, un protocole rapide, peu coûteux, mais efficace est nécessaire pour l’isolement à l’échelle de laboratoire et la caractérisation des anticorps et d’autres protéines possédant un fragment de Fc. À cette fin, nous avons conçu un protocole qui peut être complété par un personnel technique à expérience limitée en moins de 9 heures (environ une journée de travail) et aussi rapidement que 4 heures, par opposition aux méthodes traditionnelles qui exigent plus de 20 heures de travail. La plupart des équipements requis sont facilement disponibles dans les laboratoires standard de science biomédicale, de biochimie et de génie (bio)chimique, et tous les réactifs sont disponibles dans le commerce. Pour démontrer ce protocole, on présente des résultats représentatifs dans lesquels galectin-1 murin chimérique fusionné au Fc humain (Gal-1hFc) du surnageant de culture cellulaire utilisant un adsorbeur de membrane de la protéine A. Gal-1hFc purifié a été quantifié utilisant une procédure occidentale accélérée d’analyse buvarde et caractérisé utilisant la cytométrie d’écoulement. Le flux de travail rationalisé peut être modifié pour d’autres protéines exprimant fc, telles que les anticorps, et/ou modifié pour intégrer d’autres méthodes de quantification et de caractérisation.
Introduction
L’isolement des anticorps et des protéines recombinantes exprimant des fragments de l’immunoglobuline G (IgG) Fc à partir de surnageants de culture cellulaire et de solutions cellulaires lysées diluées peut être accompli en utilisant la chromatographie d’affinité de la protéine A. Dans les laboratoires de sciences fondamentales et d’ingénierie et l’industrie, les colonnes remplies d’agarose, de verre ou de perles polymères revêtues de protéines poreuses A sont les plus couramment utilisées pour la chromatographie d’affinité, malgré des coûts financiers élevés et de longs délais de traitement1-3. Il est bien connu que la chromatographie d’affinité représente....
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Protocole
1. Vérifiez l’affinité pour la protéine A
- Vérifier que la protéine exprimant Fc (protéine de fusion recombinante ou anticorps IgG, ci-après appelée « protéine ») a une affinité acceptable pour la protéine A14-17 avant d’utiliser l’adsorbeur membranaire de la protéine A, et tester la présence de la protéine dans la solution mère(p. ex. surnageant de culture cellulaire clarifié par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min aux cellules en suspension de granulés). Utilisez la cytométrie de flux, le western blotting, ELISA, etc. pour détecter la fonction protéique et/ou la présence de Fc, en fonction des préférences du laboratoire. Id....
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Résultats
Le protocole simplifié pour l’isolement et la caractérisation des protéines exprimant Fc est couramment utilisé pour traiter la galectine-1 murine chimérique fusionnée au Fc humain (Gal-1hFc) à partir de surnageants dilués de culture cellulaire. L’organigramme de la figure 2 illustre le flux de travail et l’heure de chaque étape du protocole. Pour un lot typique de 300 ml de surnageant, le temps de traitement total est d’environ 9 heures lorsque le test facultatif de cytométrie en flux des fractions d’él.......
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus a été développé pour isoler et caractériser rapidement une protéine de fusion chimérique exprimant fc humain (Gal-1hFc), sans compromettre de manière significative la récupération de produit ou gonfler le coût. Les composants clés du flux de travail rationalisé sont un adsorbeur à membrane de protéine A pour l’isolement, et le transfert semi-à-papier et l’immunoblotting assisté par vide pour la caractérisation par western blotting.
La diminution spectaculaire du t.......
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Déclarations de divulgation
Il n’y a rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier M. Luis F. Delgadillo (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio), M. Matthew H. Williams (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio) et M. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women’s Hospital et Harvard Medical School) pour leur assistance technique d’experts. Les auteurs souhaitent également remercier les étudiants che 404/BME 504 de l’hiver 2011 et de l’automne 2012 CHE 4830/BME 5830 (département de génie chimique et biomoléculaire et de génie biomédical, Université de l’Ohio) pour leurs conseils techniques et leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention d’instrumentation de rech....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Adsorbeur membranaire de protéine A (Sartobind Protein A 2 ml) ; | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Filtre centrifuge Amicon Ultra, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Utiliser un volume de 15 ml si nécessaire |
| Unité de filtre sous vide stérile, 0,22 & micro ; m, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Seringues de 10 ml avec embouts Luer Lock | BD | 301604 | |
| Seringues de 30 ml avec embouts Luer Lock | BD | 309650 | |
| Tubes de laboratoire Tygon (1/16 po x 1/8 po x 50 pi) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Appareils de dialyse (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Plateau de collecte d’anticorps Snap i.d. | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. support de transfert à puits unique | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Tampon à élution | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultra pur | Fisher Scientific | 819623 | |
| sodium | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS avec Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Human Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| Anti-human Fc-APC | Jackson Immunorecherche | 109136170 | |
| Anti-humain Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Substrat de phosphatase alcaline | Promega | S3841 | |
| Tubes de cytométrie en flux (5 ml de polystyrène ou de polypropylène) | BD | 352054 | |
| Pompe à seringue | Harvard Apparatus | 55-2226 | Une pompe péristaltique est également acceptable |
| Gel protéique système d’électrophorèse | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Tout système d’électrophorèse sur gel est acceptable, mais les systèmes de mini-gel fonctionnent plus rapidement |
| Buvard semi-sec | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Tout système de transfert est acceptable, mais les systèmes de transfert discontinuos effectuent le transfert électrophorétique le plus rapide |
| Système de détection de protéines assisté par vide SNAP i.d. | EMD Millipore | WBAVDBASE | Un modèle amélioré a remplacé cet instrument spécifique, mais l’un ou l’autre devrait fonctionner tout aussi bien |
Références
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Ba....
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Réimpressions et autorisations
