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Article de méthode

Isolation et caractérisation de protéines humaines chimériques exprimant fc à l’aide d’adsorbeurs membranaires de protéine a et d’un flux de travail rationalisé

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DOI :

10.3791/51023

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8 janvier 2014

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Par rapport à la chromatographie d’affinité traditionnelle utilisant des colonnes remplies de perles d’agarose de protéine A, les adsorbeurs membranaires de protéine A peuvent accélérer considérablement l’isolement à l’échelle du laboratoire des anticorps et d’autres protéines exprimant des fragments Fc. Des méthodes d’analyse et de quantification appropriées peuvent accélérer davantage le traitement des protéines, permettant d’isoler et de caractériser en une journée de travail, au lieu de plus de 20 heures de travail.

Résumé

La purification à l’échelle du laboratoire à l’échelle industrielle des biomolécules des surnageants de culture cellulaire et des solutions cellulaires lysées peut être réalisée à l’aide de la chromatographie d’affinité. Bien que la chromatographie d’affinité utilisant des billes d’agarose A poreuses emballées dans des colonnes soit sans doute la méthode la plus courante d’isolement à l’échelle du laboratoire d’anticorps et de protéines recombinantes exprimant des fragments fc d’IgG, cela peut être un processus long et coûteux. Les contraintes de temps et financières sont particulièrement intimidantes dans les petits laboratoires de sciences fondamentales qui doivent récupérer des centaines de microgrammes à des quantités de milligrammes de protéines à partir de solutions diluées, mais qui n’ont pas accès à des systèmes d’administration de liquides à haute pression et / ou à du personnel spécialisé dans les bioséparations. De plus, la quantification et la caractérisation des produits peuvent également allonger excessivement le temps de traitement sur plusieurs jours de travail et gonfler les dépenses (consommables, salaires, etc.). Par conséquent, un protocole rapide, peu coûteux, mais efficace est nécessaire pour l’isolement à l’échelle de laboratoire et la caractérisation des anticorps et d’autres protéines possédant un fragment de Fc. À cette fin, nous avons conçu un protocole qui peut être complété par un personnel technique à expérience limitée en moins de 9 heures (environ une journée de travail) et aussi rapidement que 4 heures, par opposition aux méthodes traditionnelles qui exigent plus de 20 heures de travail. La plupart des équipements requis sont facilement disponibles dans les laboratoires standard de science biomédicale, de biochimie et de génie (bio)chimique, et tous les réactifs sont disponibles dans le commerce. Pour démontrer ce protocole, on présente des résultats représentatifs dans lesquels galectin-1 murin chimérique fusionné au Fc humain (Gal-1hFc) du surnageant de culture cellulaire utilisant un adsorbeur de membrane de la protéine A. Gal-1hFc purifié a été quantifié utilisant une procédure occidentale accélérée d’analyse buvarde et caractérisé utilisant la cytométrie d’écoulement. Le flux de travail rationalisé peut être modifié pour d’autres protéines exprimant fc, telles que les anticorps, et/ou modifié pour intégrer d’autres méthodes de quantification et de caractérisation.

Introduction

L’isolement des anticorps et des protéines recombinantes exprimant des fragments de l’immunoglobuline G (IgG) Fc à partir de surnageants de culture cellulaire et de solutions cellulaires lysées diluées peut être accompli en utilisant la chromatographie d’affinité de la protéine A. Dans les laboratoires de sciences fondamentales et d’ingénierie et l’industrie, les colonnes remplies d’agarose, de verre ou de perles polymères revêtues de protéines poreuses A sont les plus couramment utilisées pour la chromatographie d’affinité, malgré des coûts financiers élevés et de longs délais de traitement1-3. Il est bien connu que la chromatographie d’affinité représente le plus grand goulot d’étranglement des dépenses et du traitement en laboratoire et en milieu industriel2,4. En conséquence, de nombreuses améliorations ont été développées pour réduire les coûts et le temps de traitement sans sacrifier la récupération globale du produit à partir du train de processus1,2,5-7. La chromatographie d’affinité utilisant une protéine membranaire de protéines2,5,7-10est particulièrement prometteuse pour l’isolement des anticorps et autres protéines exprimant fc. Alors que la capture fc en chromatographie sur colonne est limitée en diffusion(c’est-à-dire que la protéine exprimant Fc doit diffuser dans et à travers les pores internes pour atteindre la majorité de la protéine A) avec une chute de pression élevée à travers la colonne, le transport de masse dans les adsorbeurs membranaires est entraîné par la convection en vrac, ce qui permet d’éviter les limitations de diffusion8,9,11,12. De plus, la chute de pression à travers l’adsorbeur membranaire est faible, permettant ainsi des débits de perfusion plus rapides par rapport aux colonnes bourrées de perles8,9,11,12. Ainsi, pour l’isolement à l’échelle du laboratoire, la chromatographie sur membrane devrait réduire le temps d’isolement de plusieurs heures et augmenter la capture du produit par rapport à la chromatographie sur colonne. En outre, des modèles mathématiques pour l’adsorption d’IgG dans les adsorbeurs membranaires ont été proposés8,9,11,12, permettant ainsi aux utilisateurs finaux de prédire les performances en laboratoire.

Un autre goulot d’étranglement dans les laboratoires de sciences fondamentales et d’ingénierie est la caractérisation de la protéine exprimant Fc. Cependant, le choix de méthodes appropriées pour effectuer des essais de caractérisation, comme les western blots, peut réduire considérablement le temps consacré aux essais de produits. Par exemple, le transfert semi-dentaire dans un système tampon discontinu peut accomplir le transfert électrophorétique de protéines d’un gel SDS-PAGE vers une membrane de polyvinyl difluoridine (PVDF) en quelques minutes, par opposition à un transfert de 1 à 2 heures en réservoir (humide) dans un système tampon continu13.

Un protocole rapide, peu coûteux, et efficace pour isoler et caractériser une protéine de fusion chimérique exprimant un fragment de Fc d’IgG humain est décrit ci-dessus. La plupart des équipements sont facilement disponibles dans les laboratoires standard de sciences biomédicales fondamentales, de biologie, de chimie et de génie (bio)chimique, et tous les réactifs sont disponibles dans le commerce. Bien que des résultats représentatifs aient été générés à partir de l’isolement et de la caractérisation d’une protéine murine galectin-1/human Fc de fusion (Gal-1hFc), le protocole rationalisé peut être appliqué à l’isolement d’autres molécules qui possèdent un fragment de Fc, telles que des anticorps, des fragments de Fc eux-mêmes, ou d’autres protéines de fusion de Fc. Nos améliorations ont considérablement réduit le temps de traitement (aussi peu que 4 heures, mais plus généralement ~ 9 heures, par rapport à plus de 20 heures de travail) tout en obtenant une récupération de produit similaire ou améliorée par rapport aux méthodes standard.

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Protocole

1. Vérifiez l’affinité pour la protéine A

  1. Vérifier que la protéine exprimant Fc (protéine de fusion recombinante ou anticorps IgG, ci-après appelée « protéine ») a une affinité acceptable pour la protéine A14-17 avant d’utiliser l’adsorbeur membranaire de la protéine A, et tester la présence de la protéine dans la solution mère(p. ex. surnageant de culture cellulaire clarifié par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min aux cellules en suspension de granulés). Utilisez la cytométrie de flux, le western blotting, ELISA, etc. pour détecter la fonction protéique et/ou la présence de Fc, en fonction des préférences du laboratoire. Idéalement, quantifier la protéine dans le surnageant de culture cellulaire (étape 6) pour éviter de dépasser la capacité d’adsorbeur membranaire de la protéine A. Procéder si des protéines sont détectées.

2. Préparer l’adsorbeur membranaire de protéine A et le surnageant de culture cellulaire

  1. Suivez les instructions du fabricant pour préparer l’adsorbeur à membrane. Ne laissez jamais l’air entrer dans l’adsorbeur membranaire. Toutes les solutions perfusées à travers l’adsorbeur membranaire doivent être à température ambiante et préfiltrées à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Remplissez une seringue de 10 ml avec une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco filtrée de 0,22 μm ou un tampon de choix et déchargez des bulles d’air. Perfuser DPBS pour retirer la solution de stockage et équilibrer l’adsorbeur à membrane immédiatement avant utilisation.
  2. Filtrer le surnageant de culture cellulaire immédiatement avant la perfusion à travers l’adsorbeur membranaire, à l’aide d’une unité de filtration stérile de 0,22 μm entraînée par le vide.

3. Chargez l’adsorbeur de membrane de protéine A

  1. Aspirez le surnageant de culture cellulaire dans une seringue Luer Lock (30 ml ou plus) et déchargez toutes les bulles d’air.
  2. Assemblez les matériaux et l’équipement comme le montre la figure 1. Connectez la seringue à l’entrée de l’adsorbeur membranaire. Fixez un tube flexible à la sortie de l’adsorbeur membranaire. Si vous le souhaitez, placez un filtre à seringue de 0,22 μm entre la seringue et l’adsorbeur membranaire. Utilisez un ballon ou une bouteille pour capter le flux à travers (également connu sous le nom de filtrat), à partir de l’adsorbeur.
  3. Réglez la pompe de la seringue sur le débit volumétrique souhaité, mais ne dépassez pas le débit recommandé par le fabricant(par exemple 10 ml/min). Impréner le surnageant de culture cellulaire à travers l’adsorbeur membranaire, recueillant le flux à travers dans un bécher ou un autre récipient. Rechargez la seringue avec les surnageants nécessaires.
  4. Si vous le souhaitez, testez le flux à travers la présence de protéines en utilisant la cytométrie de flux, western blotting, ELISA, etc. en fonction des préférences du laboratoire. Il n’est généralement pas nécessaire de reperfuse le flux à travers.

4. Elute Protein de l’adsorbeur membranaire

  1. Laver l’adsorbeur membranaire avec 10 ml de DPBS pour éliminer toute protéine non liée.
  2. Protéine éluée de l’adsorbeur membranaire au débit souhaité(par exemple 1 ml/min) en utilisant 10 à 15 ml de tampon d’élution(par exemple, tampon d’élution à base d’amine (pH 2,8)). Attraper l’éluat dans un tube contenant un tampon neutralisant(par exemple 1 M Tris (pH 9,4)) à 10 % du volume d’élution (1,0-1,5 ml).
  3. Alternativement, la protéine éluée en un ml s’incrémente dans des tubes contenant 100 μl de tampon de neutralisation, en utilisant un volume total de tampon d’élution de 10-15 ml. Utilisez la méthode de caractérisation préférée pour tester la présence de protéines dans chaque fraction.
  4. Régénérer l’adsorbeur membranaire selon les instructions du fabricant. Perfuser 10 ml de DPBS filtré de 0,22 μm ou tampon de choix, puis 10 ml de NaOH filtré de 0,22 μm dans 1 N NaCl, et enfin 10 ml de DPBS filtré de 0,22 μm. Remplissez l’adsorbeur membranaire avec de l’éthanol à 20 % dans du DPBS pour un stockage à long terme à 4 ºC.

5. Concentrez et dialysez la protéine

  1. Déposer tout éluat (ou fractions d’élution contenant des protéines tel que déterminé à l’étape 4.3) dans une unité de filtre centrifuge de 10 kDa de coupure de poids moléculaire. Suivez les instructions du fabricant pour la centrifugation.
  2. Dialyser le rétentiment dans une unité de dialyse de petit volume (coupure de poids moléculaire de 10 kDa) contre le tampon de choix, en suivant les instructions du fabricant. Il peut être nécessaire d’ajouter un tampon au matériau dialysé si la précipitation des protéines est préoccupante. Si vous le souhaitez, le matériau dialysé peut être réfrigéré jusqu’à l’étape 6, mais le stockage à long terme sans conservateurs n’est pas recommandé.

6. Quantifier et caractériser le produit purifié dans une procédure de buvardage occidental accéléré

  1. Résoudre les étalons de protéines purifiées et fc sur le gel de choix par SDS-PAGE, dans des conditions réductrices ou non réductrices comme vous le souhaitez18-20. Utilisez un mini gel plutôt qu’un gel midi pour minimiser le temps d’exécution.
    1. Si ce n’est pas déjà fait, déterminer la plage d’étalons Fc sur laquelle le signal de bande varie linéairement par rapport à la quantité de signaux chargés(p. ex. 0,1-1 mg). Utilisez le même gel, les mêmes conditions de fonctionnement, les mêmes conditions de transfert et les mêmes réactifs qui seront utilisés pour quantifier et caractériser les protéines purifiées.
    2. Chargez plusieurs quantités d’échantillons de protéines purifiées, y compris des échantillons dilués avec du DPBS, pour vous assurer que les signaux de bande de protéines purifiées se situent dans la plage de signaux linéaires des étalons Fc dans l’analyse d’images.
  2. Transférer les protéines du gel vers une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans un système tampon discontinu à l’aide d’un buvardsemi-dentaire 13,en suivant les instructions du fabricant du buvard. Le temps de transfert est généralement de 5 à 10 minutes. Si vous le souhaitez, Coomassie tache le gel après transfert pour vérifier l’efficacité du transfert21.
  3. Effectuer un immunoblotting avec de l’anti-Fc ou de l’anti-IgG conjugué à la phosphatase alcaline (AP) ou à la peroxydase de radis de cheval (HRP), selon les préférences du laboratoire, à l’aide d’un système de détection de protéines assisté par vide. Le temps d’immunoblotting est généralement inférieur à 1 heure.
  4. Développer l’immunoblot en utilisant le substrat et la méthode de choix(p. ex. substrat AP et chimiluminescence améliorée).
  5. Quantifier les protéines purifiées par analyse d’image. Effectuez une régression linéaire sur les signaux de bande des étalons Fc. Si R2>0,90, utilisez l’équation de la ligne pour calculer la quantité de protéines à partir de son ou ses signaux de bande. Tenir compte de la dilution de l’échantillon si nécessaire. Étant donné que la quantification de la protéine est effectuée sur la base de Fc, ajustez la valeur des différences de poids moléculaire entre la protéine et Fc. SiR2<0,90, répétez l’étape 6 dans son intégralité.
  6. Valider les protéines à l’aide d’essais fonctionnels ou de méthodes pour détecter fc via la cytométrie de flux, western blotting, ELISA, etc. en fonction des préférences du laboratoire.
  7. Diluer les protéines à la concentration désirée et/ou ajouter les conservateurs ou stabilisants désirés à la solution de protéines purifiées avant de les aliquoter pour le stockage à long terme, congelé ou autre.

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Résultats

Le protocole simplifié pour l’isolement et la caractérisation des protéines exprimant Fc est couramment utilisé pour traiter la galectine-1 murine chimérique fusionnée au Fc humain (Gal-1hFc) à partir de surnageants dilués de culture cellulaire. L’organigramme de la figure 2 illustre le flux de travail et l’heure de chaque étape du protocole. Pour un lot typique de 300 ml de surnageant, le temps de traitement total est d’environ 9 heures lorsque le test facultatif de cytométrie en flux des fractions d’él...

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Discussion

Le protocole décrit ci-dessus a été développé pour isoler et caractériser rapidement une protéine de fusion chimérique exprimant fc humain (Gal-1hFc), sans compromettre de manière significative la récupération de produit ou gonfler le coût. Les composants clés du flux de travail rationalisé sont un adsorbeur à membrane de protéine A pour l’isolement, et le transfert semi-à-papier et l’immunoblotting assisté par vide pour la caractérisation par western blotting.

La diminution spectaculaire du t...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier M. Luis F. Delgadillo (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio), M. Matthew H. Williams (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio) et M. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women’s Hospital et Harvard Medical School) pour leur assistance technique d’experts. Les auteurs souhaitent également remercier les étudiants che 404/BME 504 de l’hiver 2011 et de l’automne 2012 CHE 4830/BME 5830 (département de génie chimique et biomoléculaire et de génie biomédical, Université de l’Ohio) pour leurs conseils techniques et leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention d’instrumentation de recherche majeure CBET-1039869 (MMB) de la National Science Foundation (NSF), la subvention de recherche CBET-1106118 (MMB), la subvention de recherche A050422 de la Fondation de la dermatologie (SRB), la subvention NCI des National Institutes of Health (NIH) 1R15CA161830-01 (MMB), la bourse postdoctorale NIH Kirschstein-NRSA F32CA144219-01A1 (SRB), la subvention NIH/NCI R01CA173610 (CJD) et la subvention R01AT004628 (CJD) des NIH NCCAM.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adsorbeur membranaire de protéine A (Sartobind Protein A 2 ml)  ;Sartorius-Stedim93PRAP06HB-12--A
Filtre centrifuge Amicon Ultra, 10 kDa, 4 mlMilliporeUFC801008Utiliser un volume de 15 ml si nécessaire
Unité de filtre sous vide stérile, 0,22 & micro ; m, 500 mlMilliporeSCGPU05RE
Seringues de 10 ml avec embouts Luer LockBD301604
Seringues de 30 ml avec embouts Luer LockBD309650
Tubes de laboratoire Tygon (1/16 po x 1/8 po x 50 pi)Cole ParmerWU-95903-16
Slide-A-Lyzer MINI Appareils de dialyse (10K MWCO)Thermo Scientific69576
Plateau de collecte d’anticorps Snap i.d.EMD MilliporeWBAVDABTR
Snap i.d. support de transfert à puits uniqueEMD MilliporeWBAVDBH01
Tampon à élutionThermo Scientific21004
Tris, ultra purFisher Scientific819623
sodiumFisher Scientific7647-14-5
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS avec Ca2+/Mg2+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
Human FcBethyl Research LaboratoriesP80-104
Anti-human Fc-APCJackson Immunorecherche109136170
Anti-humain Fc-APBio-Rad170-5018
Substrat de phosphatase alcalinePromegaS3841
Tubes de cytométrie en flux (5 ml de polystyrène ou de polypropylène)BD352054
Pompe à seringueHarvard Apparatus55-2226Une pompe péristaltique est également acceptable
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Système de détection de protéines assisté par vide SNAP i.d.EMD MilliporeWBAVDBASEUn modèle amélioré a remplacé cet instrument spécifique, mais l’un ou l’autre devrait fonctionner tout aussi bien
Chlorure de

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