Ingénierie tissulaire: Construction d'un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

Résumé

Pour créer des structures hautement organisées de tissus complexes, il faut assembler plusieurs types de matériaux et de cellules en un composite intégré. Cette conception combinatoire intègre des feuilles de cellules stratifiées spécifiques à un organe avec deux matériaux distincts d’origine biologique contenant une base de matrice fibreuse solide, et des cellules endothéliales pour améliorer la formation de nouveaux vaisseaux.

Résumé

Beaucoup de tissus, comme les adultes cœurs humains, sont incapables de se régénérer correctement après dommages. ^2,3 Stratégies en ingénierie tissulaire proposent des innovations pour aider le corps dans la récupération et la réparation. Par exemple, les approches TE peuvent être en mesure d'atténuer le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde (IM) et peut-être augmenter la fonction cardiaque totale à un niveau MI pré proche de la normale. ⁴ Comme avec n'importe quel tissu fonctionnel, réussite de la régénération du tissu cardiaque implique la bonne exécution de plusieurs types de cellules avec des signaux environnementaux qui favorisent l'intégration et la survie de la greffe de cellules / tissus implantés. Tissus d'ingénierie devraient aborder plusieurs paramètres dont: signaux solubles, les interactions cellule-cellule et matériaux de matrice évalués comme les véhicules de livraison, de leurs effets sur la survie de la cellule, la résistance des matériaux, et la facilitation de l'organisation de cellule à tissu. Des études utilisant l'injection directe de cellules du greffon seulement ignorer ces éléments essentiels. ^2,5,6Une conception de tissu combinant ces ingrédients n'a pas encore été développé. Ici, nous présentons un exemple de superposition à l'aide des dessins intégrés de feuilles de cellules à motifs avec deux types de matières biologiques contenant des dérivés du type cellulaire organes cibles et des cellules endothéliales pour l'amélioration de la formation de nouveaux vaisseaux dans le "tissu". Bien que ces études se concentrent sur la production de tissu cardiaque comme, cette conception de tissu peut être appliquée à de nombreux autres organes que le coeur de la conception et matérielles des changements minimes, et est censé être un produit hors-the-shelf pour les thérapies régénératrices. Le protocole contient cinq étapes détaillées. Une température Poly sensible (N de -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) est utilisé pour des boîtes de culture de tissus de la robe. Ensuite, les cellules sont mises en culture tissulaire spécifique sur la surface des plaques revêtues de motif fin / des surfaces pour former des feuilles de cellules avec de fortes adhérences latérales. En troisième lieu, une matrice de base est créé pour le tissu en combinant la matrice poreuse avec Permissi néovasculaireve hydrogels et les cellules endothéliales. Finalement, les feuilles de cellules sont soulevées à partir des boîtes revêtues PNIPAAm et transférées à l'élément de base, ce qui rend l'assemblage complet.

Introduction

L’injection de cellules et/ou de matériaux uniques seuls a montré un succès variable dans d’autres systèmes organiques et un succès limité dans la régénération cardiaque. ^5,7-12 À l’heure actuelle, les cellules dérivées de cellules souches sont administrées aux tissus endommagés à l’aide de diverses méthodes d’administration, notamment l’injection directe de cellules dans les tissus et la perfusion dans l’approvisionnement en sang. ^13-17 D’autres ont implanté des cellules seules, des matériaux seuls et/ou en combinaison avec des supports de matériaux pour aider à régénérer les organes endommagés. ^18-21 Cette conception combine plusieurs stratégies qui fournissent la résistance du matériau, la structuration de plusieurs matériaux et plusieurs types de cellules.

Plus précisément, la matrice fibreuse acellularisée basique fournit la force physique fondamentale à la construction, ce qui la rend apte à la suture chez le patient, si nécessaire. Les espaces vides dans la matrice de base sont remplis de cellules endothéliales dans un hydrogel permissif néovasculaire²² pour établir rapidement la vascularisation de la construction implantée. Ce composite est ensuite intégré à des feuilles de cellules pré-structurées qui permettent une meilleure communication de cellule à cellule, imitant plus étroitement le tissu natif. ^1,23-25 Le processus global de production du patch cellulaire en couches est décrit par l’organigramme de la figure 1.

Protocole

1 Création de plaques PNIPAAm revêtues

1. Dissoudre 2,6 g de PNIPAAm dans 2 ml d'une solution / 40% d'hexane à 60% dans le toluène.
2. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min sous agitation, jusqu'à ce que l'on dissout PNIPAAm.
3. Couper le papier filtre dans un cercle de 60 mm de diamètre et placez le papier dans l'entonnoir de Büchner.
4. Filtrer la solution à travers un entonnoir de Büchner dans le bécher pré-pesée verre (ne pas utiliser des matières plastiques, comme l'hexane fera fondre les plastiques).
5. Placer le bécher et contenu dans un vide de cloche (24 psi) O / N (16 h). Note: Jusqu'à ce que le résidu est traité avec isopropylique il s'oxyde alors assurez-vous qu'il n'entre pas en contact avec l'oxygène.
6. Peser le bécher pour déterminer la masse de la PNIPAAm.
7. Ajouter de l'alcool isopropylique à la PNIPAAm, la création d'un 50/50 p / p de la solution.
8. Placer 2 ml de la solution sur la surface de la plaque de culture de tissu, et le pelage pendant 5 min sous une lampe UV.
9. Laver la plaque avec 2 ml de PBS chaud deux foisavant de l'utiliser pour la culture cellulaire.

2 Création de feuilles cellulaires

Remarque: feuilles cellulaires de cellules primaires pour l'organe cible peuvent être créés en utilisant un certain nombre de méthodes différentes, ou par le revêtement de surfaces de culture de tissu de polymère thermo-sensible comme décrit ici. Plaques thermo-sensible pré-enrobées sont également offerts par un certain nombre de fournisseurs.

Remarque: Ce protocole est de culture en utilisant une boîte de 35 mm. Brièvement, les cellules sont d'abord mises en incubation à 37 ° C pendant un minimum de 24 h à confluence pour établir des connexions latérales entre les cellules adjacentes. Pour détacher les feuilles de cellules, les plaques sont soumises à des températures inférieures à 32 ° C. Le tapis cellulaire est ensuite transféré dans la matrice fibreuse de base forte contenant un hydrogel permissive néovasculaire avec des cellules endotheliales vasculaires.

1. Isoler la population de cellules. Remarque: cette méthode dépend des procédures de dérivation individuels et le type de cellules. Rat mu lisse aortiquedes cellules sub-aigu (RASMC) sont utilisés dans cet exemple. Ce sont des primaires de cellules musculaires lisses isolées de l'aorte abdominale d'un rat.
2. Laver les cellules avec 2 ml de PBS chaud.
3. Ajouter 3 ml de trypsine (ou autre / solution dissocier de clivage) sur les cellules pendant 5 min.
4. Inhibition de la trypsine par addition de 3 ml de milieu de culture, ou une solution tampon phosphate (PBS) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
5. Les cellules dans un tube conique et compter une aliquote.
6. Faites tourner les cellules à 1000 rpm (228 xg) pendant 5 min.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans leur milieu de croissance (milieu de culture SmGM2 plus kit balle est utilisé pour RASMC).
8. Placer le support contenant les cellules sur une plaque thermo-sensible 35 mm - PNIPAAm plaque revêtue à une concentration qui permettra d'atteindre 100% de confluence. Remarque: Pour CMLAR ce nombre a été déterminé que 100 000 cellules / cm ^2. Toutefois, en raison de la perte de cellules lors de la transmission, que 120% de VA lue est utilisée.
9. Placer dans un incubateur à 37 ° CO / N. Remarque: il est important de maintenir les cellules à 37 ° C pour maintenir l'adhérence cellulaire de la plaque.

3 Préparation de Matrix Foundational

Remarque: Plusieurs matrices fibreuses 3D peuvent être utilisés pour la couche solide matrice fibreuse entre les feuilles de cellules délicates. Voici quelques exemples: gelfoam, bioverre, matériaux naturels acellularized ²⁶ ou nanospun matériaux ^27,28 Le porc urinaire matrice de la vessie (UBM) utilisée dans ces études a été généreusement fourni par notre collaborateur, le Dr Badylak ^29.

1. Avant d'utiliser, de déterminer les caractéristiques de la matrice, y compris le manque de contenu cellulaire si matrice décellularisé est utilisée, ^27,28 viabilité cellulaire spécifique, et un espace vide. ²²
2. Couper la matrice de pré-stérilisé dans une taille et une forme souhaitées. Note: Ici, un poinçon est utilisé pour découper un cercle de 4 mm de diamètre.

ve_title "> 4. Cellules endothéliales ensemencement dans un néovasculaire permissive hydrogel

Remarque: Les cellules endotheliales peuvent être obtenus à partir d'une variété de sources, y compris la différenciation de cellules souches ou progénitrices. Ici, on utilise des cellules HUVEC.

1. Utilisation tout hydrogel permissive (de fibrine, des gels de collagène) aussi longtemps que le temps de reticulation est suffisamment courte pour que les cellules restent viables. Remarque: ici, un gel acide hyaluronique (HA) réticulé à base d'un pont disulfure est utilisé.
2. Préparer l'hydrogel HA en conformité avec le protocole de la société.
3. Recueillir les cellules endothéliales et les disperser dans une solution à une seule cellule à l'aide de la trypsine 1x. Remarque: Accutase ou tampon de dissociation cellulaire peuvent également être utilisés pour la dispersion de la cellule unique.
4. Désactiver l'enzyme de la trypsine en utilisant une quantité égale d'inhibiteur de trypsine de soja (si il est important que les cellules ne sont pas en contact avec le sérum) ou 10% de FBS dans du PBS, la collecte de la solution / cellules dans un tube conique de 15 ml.
5. Contant les cellules, et de calculer le volume nécessaire pour les dimensions de raccordement (auparavant quantifiés). Remarque: Pour un patch de 4 mm, ici de 2 millions de cellules endothéliales sont utilisés.
6. Extrait 2 millions de cellules, et la placer dans un nouveau tube de 15 ml conique.
7. Spin au (228 xg) pendant 5 min.
8. Aspirer le surnageant, ce qui laisse les cellules en culot dans un tube conique.
9. Mélangez les matières liquides de HA et de la gélatine dans un rapport 1: 1 ration. Ensuite, ajouter 80% du volume total dans le tube conique contenant le culot.
10. Remettre en suspension les cellules endothéliales dans le mélange 1: 1 HA / Gélatine
11. Mettre les cellules en suspension dans le mélange HA / gélatine dans la matrice fibreuse de base à partir de l'étape 2.
12. Ajouter cinquième (20 pour cent) du volume total souhaité de l'agent de réticulation
13. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.

5 Isolation de feuilles cellulaires

1. Retirez les plaques de 35 mm PNIPAAm traités contenant les cellules de l'incubateur et le placer dans une hotte de culture cellulaire àRT.
2. Aspirer rapidement les médias à partir des cellules, et ajouter 2 ml de 6% de gélatine normale qui a été chauffée à 37 ° C.
3. Bien que la gélatine est encore chaud, placer le treillis métallique dans la gélatine, la plongeant sous la surface de la gélatine normale (Film 1).
4. Placer la totalité de la plaque sur de la glace pendant 5 à 7 minutes, ce qui permet la gélatine à durcir.
5. Après 7 minutes, utiliser une spatule pour bien séparer les bords de gélatine sur le côté de la plaque, puis utilisez une pince pour soulever le treillis métallique de la plaque Remarque: Le 6% de gélatine, et la feuille de cellules devrait soulever avec le réseau.
6. Déplacer la feuille de cellules dans le plat et placer sur le dessus de la combinaison de matrice hydrogel base fibreuse, définissant avec soin le réseau au-dessus de la construction. Remarque: Le côté apical de la feuille de cellule sera toujours en position haute.
7. Ajouter 2 ml de milieu chaud (37 ° C).
8. Incuber O / N permettre à la feuille de cellules d'adhérer à la surface de l'hydrogel.
9. Retirer til treillis métallique après que la solution se réchauffe (environ 1 heure), ou le jour suivant.

Résultats

Le diagramme de flux (figure 1) illustre le procédé global de fabrication de la plaque à couches multiples. les feuilles de cellules sont détachées de la plaque traitée PNIPAAm en laissant tomber la température en dessous de 32 ° C. Ensuite, la feuille de cellules est placée au-dessus de l'hydrogel réticulé contenant des cellules endothéliales ensemencées sur la matrice fibreuse sous-jacente (figure 1). Les plaques thermo-sensible prétraitées peuvent également être utilisés pour la créa...

Discussion

Les étapes critiques du protocole comprennent: le revêtement des surfaces de la plaque avec le polymère thermosensible et la manipulation des feuilles de cellules après refroidissement des plaques. Parce que les cellules présentent différentes propriétés physiques différentes, comme l'adhésivité, le temps de levée doit être optimisée pour chaque type de cellule différent. La seconde, et la plus significative difficile composante de ce protocole, se concentre sur la manipulation de la feuille de cellule, un aspect cr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / colorant vivant
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluène	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Cellules musculaires lisses de l’aorte du rat
SmGM2	Lonza	CC-4149	Muscle lisse Média
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Cellules endothéliales veineuses humaines
HyStem	Glycosan/ Biotime
Alcool isopropylique	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071<
Papier filtre	Ahlstrom  ;	6310-0900  ;
Entonnoir Buchner  ;	Sigma Aldrich  ;	Z247308  ;
Plaques UpCell  ;	Nunc  ;	2014-11  ;
Lumière UV	Jelight Company  ;	Nettoyeur UVO Modèle n° 42