Simulation pancréatique neuroplasticité:<em&gt; In Vitro</em&gt; Double-neurone Plasticité Assay

Résumé

Plasticité neuronale est une caractéristique de plus en plus reconnue, mais mal compris de la gastro-intestinal (GI). Ici, dans l'exemple de troubles pancréatiques humaines, nous présentons un dosage in vitro de la plasticité synaptique pour l'étude de la plasticité neuronale dans le tractus gastro-intestinal à la fois au niveau morphologique et fonctionnelle.

Résumé

Neuroplasticité est une caractéristique inhérente du système et gastro-intestinal (GI) innervation nerveux entérique dans des conditions pathologiques. Cependant, le rôle physiopathologique de la neuroplasticité dans les troubles gastro-intestinaux reste inconnue. Modèles expérimentaux nouveaux qui permettent la simulation et la modulation de GI neuroplasticité peuvent permettre une meilleure appréciation de la contribution de la neuroplasticité en particulier les maladies gastro-intestinales telles que le cancer du pancréas (CaP) et pancréatite chronique (PC). Ici, nous présentons un protocole pour la simulation de la neuroplasticité du pancréas dans des conditions in vitro utilisant des nouveau-nés dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) et plexus myentérique (MP) neurones. Cette double approche permet non seulement neurone suivi de deux neuroplasticité organe intrinsèque et extrinsèque, mais représente également un outil précieux pour évaluer la morphologie des neurones et des cellules gliales et l'électrophysiologie. De plus, il permet la modulation fonctionnelle des matières microenvironnement fournis pour l'étude de leur impact sur la neuroplasticité. Une fois établi, le dosage de la neuroplasticité porte présente le potentiel d'être applicable à l'étude de la plasticité synaptique dans un organe digestif.

Introduction

Altérations de la gastro-intestinale (GI) morphologie de nerf et de la densité ont attiré l'attention des gastro-entérologues et les médecins depuis longtemps, mais leur pertinence pour la physiopathologie de maladies gastro-intestinales reste inconnue ^1-3. En effet, plusieurs troubles digestifs très courantes telles que la gastrite, oesophagite par reflux, la colite, la diverticulite, l'appendicite et sont associés à une augmentation de densité d'innervation dans les zones de tissu enflammés ^1. Cependant, aucune véritable attention a jusqu'ici été accordée aux mécanismes et la signification de la neuroplasticité dans le tractus gastro-intestinal. Ne nerfs GI morphologiquement modifiées diffèrent des nerfs GI normales, c'est à dire l'état normal du système nerveux entérique, en termes de leur fonction? Quelles sont les implications de contenu modifié neuropeptide / neurotransmetteur dans les nerfs entériques plastique? Est-ce que la neuroplasticité périphérique n'entraîne toujours signalisation modifié pour le système nerveux central? Et où sont les projections centrales de extri plastiqueNSIC voies gastro-neurones? Une longue série de ces questions clés peut être facilement généré lors de la recherche à la rareté de nos connaissances sur les aspects fonctionnels de la GI neuroplasticité.

L'étude de GI neuroplasticité au niveau fonctionnel nécessite des modèles expérimentaux valides, reproductibles et encore facilement applicables. Dans l'ère de la popularité et l'acceptation de modèles génétiquement modifiés de souris conditionnelles (GECoMM), comme dans les milieux in vivo portent le potentiel pour élucider facettes jusque-là inconnues de GI neuroplasticité dans un mode réaliste ^1. Cependant, la conception et la production de GECoMM reste coûteuse, main-d'œuvre et, surtout, beaucoup de temps. De plus, ils nécessitent la sélection a priori de la cible à condition modulée chez la souris génétiquement modifiée (par exemple, de la surexpression transgénique de facteur de croissance nerveuse / NGF dans les cellules épithéliales intestinales). Ainsi, pour le DESign d'un GECoMM succès, les chercheurs ont besoin de certains indicateurs (par exemple, les données expérimentales précédentes) d'une cible valable, à savoir que la molécule d'intérêt (ici NGF) peut au moins s'attendre à exercer certains effets biologiques pertinents sur les nerfs de GI.

De tels indicateurs peuvent facilement être obtenus à partir adéquate des modèles in vitro, dans lequel les sous-types de cellules isolées à partir du micro-environnement complexe d'un système in vivo peuvent être co-cultivées de façon sélective d'une manière hétérotypique ^7.4. La modulation de cibles moléculaires dans un tel contexte de culture hétérotypique est en moyenne techniquement moins lourde, plus rapide, et peut donc aider à la pré-filtrage des cibles intéressantes pour la vérification dans les études in vivo.

Récemment, nous avons présenté un test in vitro de la plasticité synaptique dans lequel a été conçu pour simuler la densité neuronale accrue et une hypertrophie de ne intrapancréatiquerves dans le cancer pancréatique humaine (cancer de la prostate) et pancréatite chronique (PC) tissus. Ici, les neurones dérivés de nouveau-né dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) ou plexus myentérique (MP) ont été exposées à des extraits de tissus de cancer de la prostate subi une résection chirurgicale ou CP tissus spécimens et comparées à celles cultivées dans du pancréas humain normal (NP) des extraits de tissu ^5. Au lieu d'extraits de tissus, on peut aussi utiliser surnageants de lignées cellulaires pour étudier l'impact de différents types de cellules sélectionnées sur la neuroplasticité. Lorsqu'il est combiné avec une mesure morphométrique normalisé, le dosage de la neuroplasticité présentée permet une évaluation valide et reproductible de la plasticité neuronale en réponse à différents micro-environnements du pancréas. En particulier, elle permet la simulation d'une) neuroplasticité morphologique, c'est à dire l'évolution de la croissance des neurites, motif de ramification et de la taille des neurones, et 2) la plasticité synaptique fonctionnelle, c'est à dire des altérations de l'excitabilité des neurones périphériques. En outre, non seulement périphérique (c.-à- Entérique), mais aussi central (par exemple la moelle DRG ou second ordre) des neurones peut être inclus dans le présent dosage pour évaluer leur réaction morphologique et fonctionnelle à des contenus différents de tissu gastro-intestinal. Dans le tutoriel vidéo présente, nous démontrons le protocole technique pour la réalisation de ce test et de discuter de ses avantages et ses faiblesses. En outre, nous attirons l'attention sur l'applicabilité de la notion de base de cette analyse à l'étude de la plasticité synaptique dans n'importe quel organe de GI.

Protocole

Tous les animaux des procédures expérimentales dans le protocole suivent les directives de protection des animaux de la Technische Universität München, Allemagne.

1. Médias / Préparation Extrait

1. homogénéisation tissulaire
   La qualité de l'homogénéisation du tissu est essentielle à la détection ultérieure d'altérations neuroplastiques dans les neurones en culture. Ici, il est recommandé un homogénéisateur qui permet la dissociation des tissus sans augmentation importante de la température du tissu.
   1. Transférer 5 mm x 5 mm x 5 mm cubes de tissu pancréatique directement à partir de -80 ° C à l'azote liquide et le placer dans une phase solide dans la homogenator tissulaire. Le homogenator idéal serait de dissocier le tissu assez vite, sans lui permettre de défiger.
   2. Immédiatement après la dissociation, de remettre en suspension le, homogénat de poudre solide analogue à de 300 à 500 pi de 0,1 x tampon phosphate salin (PBS). Ici, ne pas utiliser de tampon de lyse (comme RIPA) car cela peut lyser les neurones.
   3. Centrifuger les homogénats pendant au moins 15 min à la vitesse maximale du centrifugeuse de paillasse (par exemple de 21 130 xg). Recueillir le surnageant clair qui représente l'extrait de tissu.
2. Les surnageants de la lignée cellulaire
   1. Laisser les cellules d'intérêt atteignent au moins 70 à 80% de confluence dans du milieu de croissance normal.
   2. Habituellement, ces médias contiennent des composants sériques et peuvent exercer des effets incontrôlables sur la croissance neuronale. Par conséquent, après avoir atteint la densité cellulaire souhaitée, lavez-vous les cellules au moins 3x avec le grade de culture cellulaire PBS et les placer dans un milieu sans sérum (SFM) pour un maximum de 48 heures.
      Note: Ici, considèrent que certaines cellules (comme les cellules étoilées du pancréas) peuvent avoir besoin de sérum dans leur milieu de croissance afin de maintenir leur état ​​normal et la structure. Dans ce cas, effectuer des dilutions de sérum en série dans le milieu de la cellule d'intérêt afin de trouver le contenu de sérum plus bas possible nécessaire pour foncti cellulaire intacten.
   3. Mesurer la concentration en protéines de l'homogénat de tissu ou de surnageants de cellules par l'intermédiaire de dosage de protéine de Bradford. Bien que ces valeurs varient en fonction du type de tissu et de cellule, pour les extraits de tissus pancréatiques, on pourrait s'attendre à une plage de concentration comprise entre 5 à 12 pg / pl, et de surnageants de lignées cellulaires entre 8.3 ug / ul.

2. Aliquotes Extraits et surnageants cellulaires

En fonction de la concentration pour être utilisée dans le dosage, la concentration finale de l'extrait ou du surnageant dans le milieu neuronal devrait être de 100 pg / ml ^5,8.

Remarque: Pour un essai avec des neurones en croissance dans 500 ul de milieu dans chaque puits d'une plaque à 24 puits, on a besoin de 50 pg de protéine de l'extrait ou du surnageant par puits. A une concentration typique de l'extrait de l'ordre de 10 pg / pl, il faudrait 5 ul de l'extrait / surnageant de chaque puits. Dans tous les Réglagesg effectuée en trois exemplaires, cela correspondrait à 15 ul d'extrait / surnageant. Pour les types de tissus ou de cellules différentes, effectuer des dilutions successives de l'extrait final ou de la concentration de surnageant et de comparer les effets neurotrophiques observées entre les différentes concentrations d'extrait / surnageant.

3. Isolement des neurones

Une fois la collecte extrait / surnageant est terminée, continuer avec l'isolement des neurones.

1. Pour les neurones de DRG, de recueillir le col de l'utérus à lombaire DRG de rats nouveau-nés entre le jour postnatal (P) 2-12 après la décapitation et la dissection stéréomicroscopique de DRG (figure 1A). Afin d'avoir les neurones de DRG suffisantes pour une plaque de 24 puits, recueillir toutes cervicale lombaire DRG de rat nouveau-né un (égalant 52 DRG) par plaque.
   1. Coupez le périphérique (neurones) et les projections centrales (racines) de DRG au moyen d'microciseaux.
      Laissant les projections en place empêche trituration et augmente til risque de contamination de la culture par les fibroblastes.
2. Pour les neurones MP, couper le mésentère de l'intestin grêle et manuellement et avec précaution dépouiller la couche séromusculaire de l'intestin grêle (pour un protocole détaillé sur MP isolement, reportez-vous à Schäfer et al. ^9, figure 1B). Pour le député, recueillir le plexus de deux rats par 24 plaques à puits.
   Remarque: Essayez d'être aussi doux que possible afin d'éviter les déchirures dans la couche séromusculaire car ils entravent sa séparation réussie de l'intestin grêle.
3. Recueillir le DRG et séromusculaire couche dans un milieu essentiel minimal glacée (MEM) alimenté avec de la gentamicine (20 mg dans du milieu 500 ml) et de métronidazole (2,5 mg dans 500 ml de milieu).
4. Après la collecte de DRG, les incuber dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) alimentée avec de la collagénase de type II de 20 à 30 min. Pour le député isolement, incuber dans la collagénase de type entre 1-3 heures, en fonction de l'âgede l'animal (Figure 1C).
5. Pour le député, de recueillir les pièces en forme de filet MP sous binoculaire et transfert à l'glacée MEM.
6. Puis triturer le DRG et MP par seringues avec la diminution de diamètre.
   Remarque: la trituration excessive peut détruire les neurones, mais moins les cellules gliales.
7. Une fois le milieu contenant le DRG ou MP est devenu nuageux, centrifuger la suspension à 93,9 g pendant 5 min, jeter le milieu et remettre en suspension dans un milieu Neurobasal (complété avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,5 mM L-glutamine et 2% de B-27).
8. Compter le nombre total de cellules (à savoir les neurones et les cellules gliales) au moyen d'un hémocytomètre.
   Note: Le nombre de cellules nécessaires dépend du paramètre de mesure. Pour la quantification de la densité des neurites, on a besoin de cultures plus denses, et donc un plus grand nombre de cellules que pour la mesure de la croissance des neurites, la taille perikaryonalet patron de ramification des neurones individuels. Pour les mesures de densité de neurites, utiliser par exemple 10 000 cellules (neurones + gliales) / puits ou 1500 neurones / puits. Pour morphométrie sur les neurones individuels, bref (1 minute-long) trypsination des cellules et l'ensemencement de 2500 cellules / puits ou 400 neurones / bien est recommandée. Le rendement typique de cellules obtenues à partir d'un rat est d'environ 300,000-500,000 cellules.
9. Ensemencer les cellules sur des lamelles de 13 mm qui ont été revêtus de la nuit avant et le haut des puits avec un milieu Neurobasal (supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,5 mM de L-glutamine et 2% B-27) (Figure 1D).
   Note: L'utilisation de poly-D-lysine (40 mg / m ²⁾ ou de l'ornithine et la couverture des bordereaux de laminine (1 mg / ml chacun) enduit. Cellules attachent à la poly-D-lysine extrêmement rapide, ce qui rend approprié pour des expériences dans lesquelles de nombreuses cellules sont nécessaires (à savoir les mesures de densité de neurites). Attachement à la laminine est un généralce plus faible, mais la laminine est un ardent promoteur de la croissance des neurites. Par conséquent, pour les mesures sur ramification neuronale et la longueur des neurites, préférer ornithine / laminine-revêtement.
10. Autoriser les cellules attachent aux puits pendant la nuit. Le jour suivant, la préparation des milieux d'extrait supplémenté (à une concentration finale d'extrait / surnageant de 100 ug / ml).
11. Aspirer le milieu d'ensemencement, et d'effectuer un lavage en option, très doux avec du PBS, puis la pipette lentement le répertoire / media surnageant additionné extrait (figure 1E).
12. Laissez les cellules se développent pendant 48 heures. Aspirer les médias et fixer dans du paraformaldéhyde 4% pour immunomarquage (figure 1F).
13. Effectuer une double coloration par immunofluorescence en utilisant spécifiques des neurones (par exemple bêta-tubuline III) et les cellules gliales spécifiques (par exemple des cellules gliales fibriallary protéine acide / GFAP) marqueurs (figure 1G).
14. Pour morphométrie, utiliser un microscope optique inversé équipé d'une caméra CCD en combinaison with logiciel automatisé qui permet de mesurer la densité des neurites (voir le tableau).
15. La densité des neurites des cultures de neurones est mesurée sur 4-5 microphotographies représentatives à 200x grossissement de quatre régions différentes de la plus dense croissance sur chaque lamelle couvre-objet en superposant un 50 um x 50 grille um et en comptant la densité des fibres par mètre carré mesurée dans les fibres qui se croisent. La croissance des neurites, le nombre de branches par neurone signifie, la durée moyenne de la branche et de la taille perikaryonal peuvent être mesurées à partir choisis au hasard 30 neurones solitaires de chaque lamelle en marquant les neurites et péricaryons (figure 1H).

Résultats

Neuroplasticité morphologique

Dans l'intervalle indiqué par âge de rats nouveau-nés (P2-12) et les densités de semis, les neurones MP et DRG construisent déjà des réseaux neuronaux denses après 48 heures (figure 2A). Comparaison de la densité des neurites entre les neurones cultivés en PCa, CP, et des extraits NP révèle une plus grande densité des neurites des neurones DRG en PCa ou extraits de CP dans des extraits de NP (Figure 2A) ^5.

Discussion

Le présent protocole est destiné à illustrer la méthodologie derrière le dosage de la neuroplasticité du pancréas in vitro qui a été récemment développée par notre groupe pour étudier les mécanismes de la plasticité synaptique dans CaP et CP ^5. Le protocole implique une procédure de trois jours qui peut facilement être appliqué une fois l'artiste a acquis une expérience suffisante dans l'isolement et la culture de neurones DRG et MP. En outre, il représente un outil précieux pour l'étude ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bromhydrate de poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1149
Ornithine/laminine	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Lamelles	Merck		Pour une utilisation dans des plaques à 24 puits
Dismembranator S	Sartorius
Anticorps anti-bêta-III-tubuline	Millipore	MAB1637	1:200
Anticorps anti-GFAP	DAKO	M0761	Concentration 1:400
Tampon RIPA + inhibiteur			Tout fournisseur
Milieu neurobasal	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Supplément	Gibco/Life Sciences	17504044	La qualité de B-27 est connue pour dépendre du numéro de lot
Gentamicin/Metronidazol			N’importe quel fournisseur
Minimal essential medium	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133 Améliore l’activité	la collagénase lorsqu’elle contient de la
collagénase Ca/Mg de type II	Biochimique Worthington	CLS-2	Obtenir des lots avec une activité d’au moins 200 U/
mg Trypsine-EDTA 0,25 %	Gibco/Life Sciences	25200056
4 % Paraformaldéhyde			Tout fournisseur
analySIS docu logiciel	Olympus

concentration de protéase de