Article de méthode

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l'aide d'un In Vitro Respect de dosage

DOI :

10.3791/51069

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28 avril 2014

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1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les essais in vitro d'adhérence peuvent être utilisés pour étudier la fixation de Streptococcus pneumoniae à des monocouches de cellules épithéliales et d'enquêter sur les interventions possibles tels que l'utilisation des probiotiques pour inhiber la colonisation pneumococcique.

Résumé

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L'adhésion de Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) à la épithélium du nasopharynx peut entraîner la colonisation et est considéré comme une condition préalable pour les infections à pneumocoques, comme la pneumonie et l'otite moyenne. Tests in vitro d'adhérence peuvent être utilisées pour étudier l'attachement des pneumocoques à des cellules épithéliales monocouches et d'enquêter sur les interventions possibles, comme l'utilisation de probiotiques, d'inhiber la colonisation pneumococcique. Le protocole décrit ici est utilisé pour étudier les effets de la probiotique Streptococcus salivarius sur l'adhésion des pneumocoques à la lignée cellulaire epitheliale humaine CCL-23 (parfois dénommé cellules HEp-2). L'essai comporte trois étapes principales: 1) la préparation des cellules épithéliales et bactériennes, 2) plus de bactéries épithéliales des monocouches de cellules, et 3) la détection des pneumocoques adhérent par les numérations viables (dilution en série et placage) ou quantitative PCR en temps réel (qPCR ). Cette technique est relativement simple et ne nécessite pas d'équipement spécialisé autre qu'une installation de culture de tissu. Le test peut être utilisé pour tester d'autres espèces probiotiques et / ou des inhibiteurs potentiels de la colonisation pneumococcique et peut être facilement modifié pour répondre à d'autres questions scientifiques concernant le respect pneumocoque et l'invasion.

Introduction

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Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une bactérie à Gram positif qui peut causer des infections comme la pneumonie, l'otite moyenne et la méningite. Il est une cause majeure de maladie chez les enfants dans les pays à faible revenu et responsables d'environ 800 000 décès d'enfants de moins de cinq ans chaque année 1. Les pneumocoques sont souvent effectuée dans le nasopharynx de jeunes enfants. Bien que cette colonisation est généralement considéré comme asymptomatique, elle précède infection pneumococcique et sert de réservoir pour les bactéries dans les populations humaines 2. Vaccination antipneumococcique conjugué réduit efficacement le transport des sérotypes contenus dans le vaccin. Cependant, il ya plus de 90 sérotypes de pneumocoques, et la vaccination peuvent conduire au remplacement de sérotype, dans lequel l'élimination des sérotypes vaccinaux est suivie par une hausse dans le transport et les maladies causées par des sérotypes non vaccinaux 3. En outre, dans certaines populations à haut risque, le pneumocoquecolonisation se produit souvent très tôt dans la vie, avant l'administration de la première dose de vaccin de 4,5. Récemment, l'utilisation de probiotiques a été proposée comme une stratégie supplémentaire pour inhiber la colonisation pneumococcique 6,7. Tests in vitro d'adhérence ont été utilisées pour examiner l'adhésion à pneumocoques 8,9. Ces essais ont été adaptés pour étudier l'impact du probiotique Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sur l'adhésion à pneumocoques 10.

En plus de LGG et autres bactéries d'acide lactique, Streptococcus salivarius, un habitant courant de la cavité orale, a été étudiée en tant que probiotique potentiel pour les voies respiratoires en raison de son potentiel et aptitude à inhiber les pneumocoques et d'autres agents pathogènes respiratoires in vitro 11 colonisation - 13. Le protocole présenté ici décrit un essai d'adhérence utilisée pour étudier les effets de la S. salivarius K12 sur l'adhésion à pneumocoquespour la lignée de cellules épithéliales humaines CCL-23. Avant d'utiliser dans l'essai, isolats de pneumocoques ont été évalués pour les capacités d'adhérence, la croissance et les propriétés d'adhérence peuvent varier considérablement parmi les isolats 10,14. Courbes de croissance des pneumocoques et S. salivarius ont été réalisées afin de déterminer la phase semi-logarithmique et la concentration de l'estimation (unités formant des colonies ou CFU / ml) par la densité optique (DO, figure 1). Il est recommandé d'examiner la croissance en compte viable et OD pour chaque isolat avant l'utilisation dans le dosage. Ce test peut être effectué dans un laboratoire avec des équipements standard et de l'équipement de culture de tissus. Dans ce protocole, les effets de trois doses de S. salivarius administré 1 heure avant l'addition des pneumocoques sur l'adhérence de S. pneumoniae PMP843, un sérotype 19F transport isolat provenant d'un écouvillon nasopharyngé, sont examinés. Deux façons de quantifier les pneumocoques adhérent sont présentés: étalement sur gélose au sang pour dissuaderle mien comptes viables, et l'extraction de l'ADN et la détection du gène lytA pneumocoque par qPCR 15. Le protocole de l'essai d'adhérence de base peut être facilement modifié pour tester différentes doses ou le moment d'administration de probiotiques et peut également être utilisé avec d'autres souches de bactéries ou d'espèces.

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Protocole

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1. Préparation des cellules épithéliales et bactériennes

  1. Le dégel du CCL-23 cellules épithéliales
    1. Préchauffer milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant environ 30 min.
    2. Stériliser la culture de tissus approuvé enceinte de sécurité biologique à la lumière UV pendant au moins 10 min avant de l'utiliser, et essuyez la zone de travail avec 70% d'éthanol. Essuyer la bouteille de médias réchauffé avec 70% d'éthanol et le lieu dans le cabinet de biosécurité.
    3. L'utilisation d'un pipette de 25 ml, transférer 14 ml de milieu dans un flacon T-75. Placez ballon dans 37 ° C incubateur pendant cellules sont en train de fondre (section 1.1.4).
    4. Retirer un flacon de CCL-23 cellules de stockage d'azote liquide à l'aide de mesures de sécurité appropriées et chaud dans un bain d'eau à 37 ° C jusqu'à ce que ~ 80% décongelé.
    5. Retourner le flacon préparé à la section 1.1.3 de l'enceinte de sécurité biologique. Essuyez la surface extérieure du flacon de CCL-23 cellules avec 70% d'éthanol et le contenu de transfert (1 ml) dans le T-75 Ballon à l'aide d'une pipette P1000.
    6. Incuber le flacon de son côté dans un 37 ° C, 5% CO 2, 95% d'humidité relative incubateur de culture tissulaire pendant une nuit (16-20 h).
    7. Vérifiez les cellules sous un microscope pour confirmer une morphologie saine, retirer les supports, et les remplacer par 15 ml fraîches, préchauffé MEM + 10% FBS.
  2. Entretien de CCL-23 cellules épithéliales
    1. Une fois que les cellules sont confluentes à environ 80% (1 à 2 jours), le passage en supprimant média en utilisant une pipette de 25 ml et laver doucement les cellules deux fois avec 8-10 ml préchauffé saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une pipette de 10 ml.
    2. Retirer du PBS et ajouter 1 ml de solution stérile à 0,25% de trypsine-EDTA (0,25% (w / v) de trypsine, 0,1 mM d'EDTA). Tourner ballon sur son côté, pivoter pour assurer la trypsine recouvre la couche confluente de cellules et incuber la fiole pendant 2-3 min dans les 37 ° C, 5% CO 2 incubateur.
    3. Ballon revenir à l'enceinte de sécurité biologique, ajouter 9 ml préchauffé MEM + 10% de FBS, et pipette de haut en bas 6 -8x pour remettre en suspension les cellules, à éjecter un liquide sur le côté de la fiole pour déloger les cellules.
    4. cellules fractionnées 01:15 (1 ml + 14 ml de MEM + 10% de FBS) ou 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml de MEM + 10% de FBS), éliminer les cellules excédentaires, et renvoient le ballon à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur.
    5. Passage des cellules d'au moins deux fois avant de l'utiliser dans l'essai d'adhérence. Typiquement cellules sont divisées tous les 3-4 jours.
  3. Semis de CCL-23 cellules épithéliales (un jour avant à l'adhésion dosage, protocole n ° 2)
    1. Fractionner les cellules confluentes, comme décrit dans les sections 1.2.1-1.2.3, remise en suspension dans du MEM + préchauffé FBS à 5% (FBS concentration est abaissée pour réduire la probabilité des composants du sérum qui interfèrent dans le dosage). Retirer 20 pi de cellules et de compter en utilisant une coloration au bleu trypan et un hémocytomètre.
    2. Diluer les cellules dans préchauffé MEM + 5% FBS à une concentration de 1,5 x 10 5 cellules / ml dans un tube stérile de 50 ml.
    3. Graine 1 ml de cellules / puits dans un tissuCulture traitée plaque de 24 puits.
  4. Préparation de bactéries
    Cette procédure peut être suivie pour la préparation des pneumocoques et S. salivarius. Médias de la croissance bactérienne est généralement conservé dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour préchauffer et essai de stérilité (généralement paraître trouble en cas de contamination).
    1. Deux jours avant l'adhésion analyse, les bactéries à balayage à cheval sang agar (HBA) plaques et incuber à 35-37 ° C et 5% de CO 2 pendant 18-24 h. gélose au sang de mouton peut être utilisé comme une alternative.
    2. Le jour suivant, préparer une culture d'une nuit de chaque espèce bactérienne à la pipette 10 ml du bouillon Todd-Hewitt avec 0,5% d'extrait de levure (THB + YE) de milieu dans un tube de 30 ml stérile. En utilisant une boucle de 10 pi, inoculer environ 10-12 colonies bien séparées. Brièvement vortex et incuber à 35-37 ° C et 5% de CO2 pendant 14 à 16 h. Notez que les pneumocoques se autolyze si elle reste trop longtemps dans un bouillon de culture.

2 Respect dosage:. Ajout de bactéries à des monocouches de cellules épithéliales

  1. Préparation de la mi-log cultures bactériennes de pneumocoques et S. salivarius
    1. Ajouter 10 ml d'préchauffé THB + YE dans chacun des deux tubes de 30 ml stériles, un pneumocoques marqué et l'autre S. salivarius.
    2. Pour atteindre la phase semi-logarithmique, les pneumocoques nécessite ~ 3 heures et S. salivarius nécessite ~ 2 heures d'incubation (voir la figure 1). Démarrer les deux cultures en même temps. Vortex (3-5 sec) des cultures bactériennes au jour le jour et ajouter 100 pneumocoques pi et 100 pi S. salivarius dans des tubes correspondants.
    3. En bref vortex et incuber les cultures à 37 ° C pendant environ 2 heures pour S. salivarius et 3 heures pour les pneumocoques.
  2. Préparation de CCL-23 cellules pour le dosage de l'adhésion
    1. En utilisant un microscope inversé, consultez la plaque de 24 puits pour confluent monocouches avec la morphologie des cellules saines. Monocouches doivent être> 80% de confluence, sans preuve d'agglutination des cellules ou des effets cytopathiques tels que l'arrondissement des cellules ou perte d'adhérence (voir la figure 2).
    2. Retirez le support dans chaque puits en utilisant une pipette de transfert, en inclinant légèrement la plaque pour éviter de perturber la monocouche cellulaire.
    3. Pour laver en douceur les cellules, ajouter ~ 500 ul de PBS préchauffé dans chaque puits à l'aide d'une pipette sérologique et l'enlever avec une pipette de transfert, en inclinant légèrement la plaque. Rejeter le PBS. Répétez l'étape de lavage une fois.
    4. Ajouter 500 ul de MEM préchauffé + FBS à 5% dans chaque puits. Retour de la plaque de 24 puits à l'incubateur à CO 2 pendant la préparation des cultures bactériennes.
      Remarque: Pour déterminer le nombre exact de cellules CCL-23 pour la multiplicité d'infection (MOI), deux puits peuvent être traitées à la trypsine et comptées le jour de l'infection.

3. Respect Assay

  1. Ajouter à pneumocoquesles CCL-23 cellules à une MOI ~ 10h01. Testez les conditions énumérées dans le tableau 1 dans les puits en double.
    1. Mesurer la densité optique à 600 A (OD) de 1 ml de S. culture salivarius. OD doit être comprise entre 0,3-0,6.
    2. Transférer 5 ml de S. salivarius culture dans un tube de 10 ml et centrifuger à 1870 g pendant 4 min.
    3. Jeter le surnageant et basé sur la lecture de DO dans la section 3.1.1, remettre en suspension S. salivarius dans 200-1000 ul de NaCl à 0,85% (concentration finale d'environ 1,5 x 10 9 CFU / ml). En règle générale, une DO de 0,375 sera remis en suspension dans 260 ul. Préparer 1:10 et 1:100 dilutions de S. salivarius en utilisant 0,85% de NaCl.
      Note: Au total, trois concentrations (représentant haute, moyenne et faible dose) de S. salivarius sera testé dans le dosage. La dose élevée est un rapport de ~ 10 S. salivarius: 1 pneumocoques, le milieu est ~ 1 S. salivarius: 1 pneumocoques, et le bas est ~ 1 S. salivarius: 10 pneumocoques.
    4. Sortez la plaque de 24 puits de l'incubateur.
    5. Des puits de contrôle de l'héparine, retirez 40 pi de milieu et ajouter 50 ul d'héparine (1000 U / ml de concentration d'actions) pour une concentration finale de 100 U / ml.
    6. Ajouter 10 ul de NaCl à 0,85% pour les puits contenant CCL-23 cellules seulement et puits contenant CCL-23 cellules et les pneumocoques (pas S. salivarius).
    7. Ajouter 10 ul de non dilué, 1:10 et 1:100 de S. salivarius aux puits respectifs.
      Remarque: S. salivarius peut également être ajouté en même temps que les pneumocoques (coaddition) ou 1 heure après les pneumocoques (post-addition) d'examiner l'effet du temps de l'administration de probiotiques.
    8. Centrifuger la plaque à 24 puits à 114 x g pendant 3 min pour favoriser le contact des bactéries avec la couche de cellules et incuber pendant 1 heure à 37 ° C, 5% CO 2.
    9. Effectuer une dilution en série de la S. salivarius stock en NaCl à 0,85% et la plaque sur double HBAplaques pour les numérations viables. Tout d'abord, ajouter 50 ul d'actions à 450 pi de NaCl à 0,85% pour faire une dilution 10 -1, alors impulsion vortex (5 sec), le changement de conseil, et ajouter 50 ul de la dilution 10 -1 à 450 pi de NaCl à 0,85% de faire une dilution 10 -2 et ainsi de suite jusqu'à 10 -7.
    10. Plaque 100 pi de la 10 -5, 10 -6 et 10 -7 dilutions en double sur des plaques HBA et répartis avec une spatule stérile. Incuber les plaques HBA inversées nuit à 37 ° C, 5% de CO 2.
    11. Vers la fin de l'incubation de 1 heure, répétez les sections 3.1.1-3.1.3 pour les pneumocoques. DO devrait être comprise entre 0,2-0,7. Centrifuger 1 ml de la culture à pneumocoques et remettre en suspension le culot dans 300-2,000 ul de NaCl à 0,85% (sur la base de la lecture de DO) à une concentration de 1,5 x 10 ~ 8 CFU / ml. En règle générale, une DO de 0,3 sera remis en suspension dans 500 ul.
    12. Après 1 heure d'incubation avec S. salivarius, ajouter 10 μ; L pneumocoques non diluée dans tous les puits sauf les puits témoins négatifs (cellules contenant seulement).
    13. Centrifuger la plaque à 24 puits à 114 x g pendant 3 min et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 heures. Effectuer une dilution en série de la pneumocoques stock en NaCl à 0,85% comme décrit dans la section 3.1.9 et des dilutions de plaque 10 -4, 10 -5 et 10 -6 sur des plaques HBA double pour les numérations viables.
  2. Après 3 heures, vérifier les cellules sous un microscope afin de s'assurer que les monocouches air en bonne santé (voir la figure 2). Retirez le support de chaque puits et laver délicatement les cellules 3x comme décrit dans la section 2.2.3. à l'aide d'une pipette différente pour chaque condition. Cette étape est essentielle pour éliminer les pneumocoques non adhérente. Les monocouches ne doivent pas se séparer pendant le processus de lavage; ce peut être confirmée en vérifiant à nouveau sous un microscope.

Remarque: Les médias enlevés au cours de cette étape peut être conservé à -20 ° C pour des analyses supplémentaires ( par exemple la mesure des niveaux de cytokines).

  1. Ajouter 200 ul de 0,1% de digitonine (un détergent doux) à chaque puits et incuber pendant 7 minutes à 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Ajouter 800 pi de THB médias à chaque puits. Lyse des cellules par aspiration et refoulement, et, si nécessaire, gratter les puits 3-4x avec la pointe de la pipette pour s'assurer que la monocouche cellulaire est complètement enlevé. Changer de conseils entre les puits.
  3. Enlevez le contenu de chaque puits en utilisant une pipette P1000 et transférer dans des tubes à centrifuger marqués.

4. Quantification des adhérentes pneumocoques

Pneumocoques adhérente peut être quantifiée en déterminant les numérations viables (dilution en série et étalement sur gélose au sang), soit par PCR quantitative en temps réel.

  1. Méthode de comptage viable
    Cette méthode doit être effectué immédiatement après l'étape 3.5 de l'essai d'adhérence.
    1. Pour chaque puits d'essai, préparer des dilutions en série d'échantillons prélevés dansl'étape 3.5 de l'essai d'adhérence en ajoutant 50 ul d'échantillons de 450 ul de NaCl à 0,85%, le pouls vortex, et dilution en série comme décrit dans la section 3.1.9 à la dilution 10 -6.
    2. Plate 100 pi de la 10 -3, 10 -4, -5 10, et 10 -6 dilutions en double sur gélose au sang, réparties avec une spatule stérile et incuber les plaques inversées nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. Notez que les puits contenant CCL-23 cellules seules ne doivent pas contenir de bactéries et peuvent être plaqué pur (non dilué 100 ul) en tant que contrôle de stérilité.
    3. Le jour suivant, déterminer les inoculums pneumococcique par comptage des colonies sur les plaques de dilution appropriés (contenant de 30 à 300 colonies) préparés dans la section 1.3.13 de l'essai d'adhérence. Calculer la CFU / ml de l'inoculum en utilisant la valeur moyenne à partir de deux plaques. De même, déterminer la S. salivarius inocula par comptage des colonies sur les plaques préparéesà la section 3.1.10.
      Remarque: Les plaques doivent contenir des pneumocoques seulement; la présence d'autres espèces indique que l'essai a été contaminé et les résultats ne sont pas valides.
    4. Pour déterminer les niveaux d'adhérence à pneumocoque, compter la plaque de dilution appropriée (contenant 30-300 colonies pneumocoque) pour chaque échantillon préparé dans la section 4.1.1. A noter que S. colonies salivarius seront petits et blanc, tandis que les pneumocoques seront dus plat et verdâtre à α-hémolyse, comme le montre la figure 3. Pour calculer l'adhésion à pneumocoques, normaliser le nombre de pneumocoques adhérent de la condition b. CCL-23 cellules + pneumocoques à 100%, et de comparer les pneumocoques adhérent d'autres conditions à cette condition.
  2. méthode qPCR
    Les échantillons prélevés en respect Essai étape 3.5 peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN. extraction de l'ADN est effectuée en utilisant un kit commercial et décrit dans les sections 4.2.1-4.2.9 et la qPCR commedire dans les sections 4.2.10-4.2.20.
    1. Préparer un tampon de lyse enzymatique (50 mM de tampon phosphate pH 6,7 contenant 1 mg / ml de lysozyme, 0,075 mg / ml mutanolysine, et 2 mg / ml de protéinase K). La recette suivante peut être utilisée faire 10 ml (suffisamment pour 50 extractions). Tampon de lyse enzymatique doit être fraîchement préparée avant utilisation.

      7,25 ml de solution tampon phosphate 50 mM (pH 6,7)
      1,00 ml de 10 mg / ml de lysozyme actions pour une finale [1 mg / ml]
      0,75 ml de 1 mg / ml mutanolysine stock pour une finale [0,075 mg / ml]
      1,00 ml de 20 mg / ml protéinase K stock pour une finale [2 mg / ml]
    2. Décongeler les échantillons sur la glace ou à 4 ° C. Vortex et le transfert de 100 aliquotes de chaque échantillon dans des tubes à centrifuger marqués. Remettre les échantillons originaux de nouveau dans le congélateur à -20 ° C.
    3. Centrifuger les échantillons à 6700 g pendant 10 min.
    4. Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 200 ul de tampon de lyse enzymatique de la pastille et vortex pour remettre en suspension. Incubmangé les échantillons à 56 ° C pendant 30 min. Centrifuger brièvement (5 sec) à 6700 x g pour recueillir le liquide au fond du tube.
    5. Ajouter 10 pl de SDS à 20% pour terminer la lyse des cellules et mélanger doucement à la température ambiante pendant 2 min.
    6. Ajouter 4 pi de RNase A (100 mg / stock ml) et mélanger doucement (sur une bascule ou en inversant les tubes) à la température ambiante pendant 2 min.
    7. Ajouter 200 pi de tampon AL (dans le kit) et vortex pendant 15 secondes. Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min. Centrifuger brièvement (5 sec) à 6700 x g pour recueillir le liquide au fond du tube.
    8. Ajouter 200 pi d'EtOH à 100% et vortex pendant 15 s. Centrifuger brièvement pour collecter le liquide au fond du tube, puis transférer le mélange (y compris tout précipité) à la colonne de rotation (dans un tube de collecte de 2 ml) sans mouiller le bord. Suivez les étapes de lavage selon de protocole du fabricant (non représenté ici).
    9. Pour éluer l'ADN, transférer la colonne dans un tube de micro marqué, ajouter 50 ul de tampon AE (frKit om), et incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 4300 g pendant 1 min. Répéter une fois pour un volume d'élution final de 100 pi. L'ADN peut être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    10. Pour effectuer qPCR, stériliser les hottes avec la lumière UV pendant 15 min avant de commencer. Préparer une plaque de 96 puits carte feuille de calcul pour enregistrer les emplacements de puits pour chaque échantillon est recommandé.
    11. Préparer la courbe standard en utilisant un 10 ng / stock pl de l'ADN génomique à pneumocoque (extrait de la souche de référence ATCC 6305).
      1. Décongeler l'ADN d'actions contre le pneumocoque et centrifuger brièvement (5 sec) dans une centrifugeuse de table.
      2. Effectuer 01:10 dilutions en série en 6 microtubes de préalablement marquées par l'ajout d'ADN 3 pi à 27 pi sans nucléase H 2 O, en changeant des conseils et des vortex entre chaque dilution. Les séries de dilution finale est constituée de six tubes: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 et 0,00001 ng / ul.
        Note: Ceux-ci peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.
    12. Prepare lytA mastermix comme suit dans un tube conique de 15 ml stérile dans une hotte stérile PCR. Décongeler les composants sur la glace et vortex immédiatement avant l'utilisation.
      composant par réaction x 102 (plaque pleine)
      lytA F 0,25 ul de 10 uM actions 25,5 pi
      lytA R 0,25 ul de 10 uM actions 25,5 pi
      sonde lytA 0,5 pi de 10 uM actions 51 pi
      H 2 O 9,5 pl 969 pi
      Master Mix 12,5 pi 1275 pi
      Le volume final 23 pi 2346 pi
      Remarque: Certaines machines PCR en temps réel nécessitent l'utilisation d'un colorant de référence, qui est contenue dans certains mastermix commerciaux ou peuvent être ajoutés séparément. Ce protocole est conçu pour l'exécution de réactions de 25 pi dans une plaque à 96 puits, mais peut être ajustée pour s'adapter à différentes machines de PCR en temps réel. Les amorces et les séquences de sondes ont été initialement publiés par Carvalho et al. 15 et sont affichés dans la liste des matériaux.
    13. Vortex et charge 23 pl / puits de la lytA mélangent dans les puits appropriés. Reportez-vous à la plaque carte.
    14. plaque de transport pour modèle la zone de plus (de préférence une armoire stérile dans une pièce séparée) pour le chargement des échantillons.
    15. Utiliser une pipette de P2 pour charger des échantillons, la modification des conseils pour chaque puits. Tous les échantillons sont analysés en double. Reportez-vous à la plaque de carte pour l'emplacement.
    16. Pour des puits de courbes standard, ajouter 1 pl / puits d'une dilution appropriée de l'ADN de la courbe de référence plus une pl / puits de H 2 O pour amener le volume final à 25 pi.Pour aucun puits de contrôle de modèle, ajoutez 2 pl H 2 O.
    17. Ajouter 2 ul / puits d'ADN de l'échantillon dans les puits appropriés.
    18. Cap tous les puits en service. Assurez-vous que les bouchons sont fermés parfaitement. Tourner rapidement la plaque PCR (5 sec) avant de charger la plaque dans une machine PCR en temps réel.
    19. plaque de charge dans la machine et PCR terme qPCR selon les instructions fournies par le fabricant de la machine. Les sondes des conditions de cycle d'hydrolyse suivantes sont recommandées:
      Étape 1 (1x): 3 min à 95 ° C
      Étape 2 (40x): 20 sec à 95 ° C
      20 sec à 60 ° C
    20. Recueillir des données et de quantifier l'ADN pneumococcique en utilisant la courbe standard. Charges bactériennes sont calculés comme décrit précédemment 17, estimant que 1 pg d'ADN génomique est équivalent à 447,4 cellules, et rapporté comme UFC / ml (en supposant one génome par UFC, et une copie de lytA par génome; voir figure 4). Pour un essai réussi, la valeur de R 2 doit être ≥ 0,98 et tous les résultats positifs au sein de la gamme de la courbe standard (CT valeurs inférieure à celle obtenue pour le ng de 0,00001 / ul point de courbe standard sont considérés comme fond / lytA négatif).
      Remarque: Certains systèmes de PCR en temps réel sont livrés avec un logiciel d'analyse qui peut être utilisé pour construire des courbes standard et calculer inconnues. Sinon, ces calculs peuvent être effectués dans Excel ou des programmes similaires. Une courbe standard d'exemple est représenté sur la figure 4.
    21. Pour calculer l'adhésion à pneumocoques, normaliser le nombre de pneumocoques adhérent de la condition b. CCL-23 cellules + pneumocoques à 100%, et de comparer les pneumocoques adhérent d'autres conditions à cette condition.

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Résultats

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Les résultats d'une expérience représentative dans laquelle les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae PMP843, un isolat coloniser 19F) ont été ajoutés à CCL-23 cellules 1 h après l'addition de S. salivarius, et l'adhésion pneumococcique a été quantifiée par comptage à la fois viable et lytA qPCR sont montrés dans le tableau 2. résultats étaient en accord entre les deux procédés à la fois pour le nombre absolu de bactéries (comme présenté UFC / ml) et le% d'adhésion, normalisé...

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Discussion

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Une partie essentielle de ce test est d'ajouter les concentrations appropriées de S. salivarius et les pneumocoques dans les sections 3.1.7 et 3.1.12. Les concentrations sont estimées en utilisant les lectures de DO mais l'inoculum exacte ne sont pas déterminés jusqu'à plaques sont comptés le jour suivant. Pour cette raison, nous recommandons d'effectuer des courbes de croissance pour mesurer OD et les numérations viables (UFC / ml) au fil du temps pour toutes les souches bactériennes utilisées ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par un financement du Programme opérationnel de soutien de l'infrastructure du gouvernement victorien Institut de recherche et enfants Murdoch.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Média essentiel minimum (MEM)Thermo Fisher ScientificSH30244.01  ;
Sérum fœtal bovin (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30084.03  ;
T-75 FlaconNunc156472  ;
Cellules CCL-23ATCCCCL-23  ;
TrypsinLife Technologies15090046
Plaque de culture cellulaire 24 puitsNunc142475  ;
Plaques de gélose au sang de cheval (HBA)OxoidPP2001Les plaques de gélose au sang de mouton sont également acceptables
Bouillon Todd-HewittOxoidCM0189  ;
Extrait de levureBeckton Dickinson212750  ;
DigitoninSigma-AldrichD141-100MG²² ;
Cuvettes jetablesKartell1938  ;
L’héparinePfizer2112105se présente sous forme d’ampoules stériles à 5 000 UI/5 m/5 m/bbsp.
Épandeur stérileTechnoplasS10805050alternativement, un épandeur de verre peut être trempé dans de l’éthanol à 96 % et stérilisé à la flamme avant chaque utilisation
LysozymeSigma-AldrichL6876  ;
MutanolysinSigma-AldrichM9901²�
Protéinase KQiagen19133  ;
FDS 20 % solutionAmbionAM9820  ;
RNase AQiagen19101  ;
QIAamp DNA mini-kit (250)Qiagen51306  ;
LytA F primerSigma-AldrichCustom made5' -> 3' séquence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primerSigma-AldrichCustom made5' -> 3' sequence  ; TCGTGCGTTTTTTAATTCCAGCT
LytA sondeEurogentecSur mesure5' -> 3' séquence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, des fluorophores alternatifs peuvent être utilisés
Eau sans nucléaseAmbionAM9906  ;
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermixAgilent Technologies600880  ;
Thermo-Fast 96 Plaque de détection  ;Thermo Fisher ScientificAB-1100²� ;
Bandelettes de capuchon qPCR ultra-transparentesThermo Fisher ScientificAB-0866  ;
Mx3005 Système QPCRAgilent Technologies401449  ;
*d’autres sources sont disponibles pour la plupart/tous les produits répertoriés  ;

Références

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  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

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Mots-clés

Adh rence pneumococciqueinhibition probiotiqueessai in vitromonocouche de cellules pith lialesStreptococcus salivariusm thode de num ration des viablesd tection par qPCRinstallation de culture tissulairedilution en s riecellules CCL 23

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