Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.
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Article de méthode
Manipulation génétique des neurones du cervelet granules
Dans cet article
Résumé
Résumé
Événements de développement du cerveau, y compris la morphogenèse neuronale et la migration sont des processus très orchestrés. In vitro et in vivo analyses permettre une caractérisation approfondie pour identifier les voies de signalisation impliquées dans ces événements. Neurones granulaires du cervelet (CGN) qui sont dérivées à partir de cervelet de développement sont un système de modèle idéal qui permet des analyses morphologiques. Ici, nous décrivons une méthode de comment manipuler génétiquement CGN et comment étudier axono et dendritogénèse des neurones individuels. Avec cette méthode, les effets de l'interférence de l'ARN, la surexpression ou de petites molécules peuvent être comparées pour contrôler les neurones. En outre, le cortex cérébelleux de rongeur est un endroit facilement accessible dans le système in vivo en raison de son développement postnatal prédominant. Nous présentons également une technique in vivo dans d'électroporation à manipuler génétiquement le cervelet en développement et décrire cérébelleuse analyses ultérieures pour évaluer la morphologie neuronale unee migration.
Introduction
Le cervelet est un excellent système pour étudier les mécanismes de la croissance axonale et la migration. Le cervelet a été l'objet d'études anatomiques depuis l'aube des neurosciences 1. Microscopie moderne et des techniques d'immunohistochimie ont considérablement élargi et affiné les premières découvertes de Santiago, Ramon, et Cajal 2-4. la génétique des souris et des études moléculaires ont découvert des facteurs de croissance et de transcription essentiels dans le contrôle du développement du cervelet, qui a conduit à une meilleure compréhension des événements cruciaux nécessaires au bon câblage des différents types de neu....
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Protocole
CGN peuvent être préparés soit à partir du jour post-natal (P) 5 souriceaux ou P6 de rat pups. Nous suivons un protocole, décrit par Bilimoria et ses collègues, qui utilise un inhibiteur mitotique pour sélectionner les CGN postmitotiques 13.
Déclaration d'éthique:
Toutes les expériences impliquant des animaux vivants ont été menées selon le protocole des animaux approuvée par le "Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit" de Basse-Saxe, Allemagne.
Test in vitro:
Une. Préparation de l'ADN plasmidique, des médias, et des tampons pour le phosphate de c....
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Résultats
Pour analyser la morphologie de CGN en réponse à différentes conditions de culture, nous avons transfecté des neurones sur DIV 0 comme décrit ci-dessus. Après transfection, nous avons placé une série de neurones dans du milieu complet (BME, 10% de sérum de veau, 2 mM de PSG, 25 mM de KCl) et un autre ensemble dans un milieu contenant de l'insuline minimal (BME, 25 mM de glucose, mM PSG 2, 10 ug / ml d'insuline). Nous avons soumis les neurones à immunocytochimie en utilisant l'anticorps de la GFP au DIV 1, 2,.......
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Discussion
Avantages et limites de l'décrite in vitro et des méthodes in vivo:
CGN culture de la souris et les rats sont également bien adaptés pour les analyses morphologiques. En raison de la plus grande taille d'un cervelet de rat, le rendement en CNGS de bébés rats est supérieure à celle des souriceaux 3-4x. Mis à part CGN, les neurones corticaux et hippocampiques peuvent être utilisés comme système de culture. La méthode au phosphate de calcium se traduit par une faible (.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Nous remercions N. Schwedhelm-Domeyer pour une excellente assistance technique, C. et S. Marteau Papiol l'aide d'analyses statistiques. Notre travail est financé par la Société Max Planck, la Deutsche Forschungsgemeinschaft, le Center for Nanoscale Microscopie et physiologie moléculaire du cerveau (CNMPB), Göttingen, en Allemagne et par la GGNB junior Groupe Allocation de l'Université de Göttingen.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isoflurane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT, | Sakura, | ||
| ECM 830 et pince à épiler, | Harvard | ||
| microscope et caméra à épifluorescence | |||
| SP2 | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Astuce de chargement 1-200 µ ; l | Costar | 4853 | |
| Pointe de pipette 200 & micro ; l | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 aiguille, 30 G | BD | 302200 | |
| 50 µ ; l seringue étanche au gaz 1705 | Hamilton | ||
| Verre couvre-slips ; | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Références
- Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R.,....
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Réimpressions et autorisations
