Ablation d&#39;une cellule unique de huit cellules d&#39;embryons de crustacés amphipodes les<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Résumé

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un organisme modèle prometteur pour l'étude de l'embryologie crustacé et le développement des arthropodes et l'évolution comparatives. Ce protocole décrit une méthode de suppression manuelle de blastomères simples à partir d'embryons à un stade préliminaire de clivage de Parhyale.

Résumé

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un petit crustacé trouvé dans les habitats marins intertidaux à travers le monde. Au cours de la dernière décennie, Parhyale a émergé comme un organisme modèle prometteur pour les études de laboratoire de développement, fournissant une comparaison de outgroup utile pour le modèle d'arthropodes bien étudié organisme Drosophila melanogaster. Contrairement aux clivages syncytial de drosophile, les premiers clivages sont des Parhyale holoblastique. cartographie destin utilisant des colorants traceurs injectés dans blastomères précoces ont montré que les trois feuillets embryonnaires et la lignée germinale sont établis par le stade de huit cellules. A ce stade, trois blastomères sont condamnées à donner naissance à l'ectoderme, trois sont condamnés à donner lieu à l'mésoderme, et les deux blastomères restants sont les précurseurs de la ligne de l'endoderme et le germe respectivement. Cependant, les expériences d'ablation blastomères ont montré que les embryons Parhyale possèdent également capabiliti réglementaire importantees, de sorte que les sorts de blastomères ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants. Blastomere ablation a été précédemment décrit par l'une des deux méthodes: l'injection et l'activation subséquente de colorants phototoxiques ou ablation manuel. Cependant, photoablation tue blastomères mais ne supprime pas le corps de cellules mortes de l'embryon. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d'ablation pour certaines applications. Nous présentons ici un protocole pour l'enlèvement manuel de blastomères simples de la scène à huit cellules d'embryons Parhyale, illustrant les instruments et les procédures manuelles nécessaires à la suppression complète du corps de la cellule tout en gardant les blastomères restants vivant et intact. Ce protocole peut être appliqué à n'importe quelle cellule Parhyale au stade huit cellules, ou à d'autres stades de blastomères de clivage précoce. De plus, en principe, ce protocole pourrait être applicable à CLEA tôtembryons au stade Våge d'autres invertébrés marins clivage holoblastically.

Introduction

Le Parhyale hawaiensis amphipode crustacé a émergé au cours de la dernière décennie comme un organisme modèle prometteur avec un grand potentiel pour une utilisation dans la recherche en biologie évolutive du développement ^1. Parmi les arthropodes, la plupart des systèmes modèles sont des insectes, et la plus étudiée de ces derniers est la mouche Drosophila melanogaster. D. melanogaster est un membre de l'ordre des insectes diptères, et que ces affiche de nombreuses caractéristiques embryologiques qui sont dérivées par rapport à ceux des insectes ramification basale ^2. En outre, les insectes sont imbriqués dans le sous-embr....

Protocole

Les commentaires qui pourraient être utiles dans l'exécution de certaines mesures sont indiquées en italique.

Une. Jour 1: Préparation des matériaux

1. Préparer les documents suivants (voir le tableau des matériaux et de l'équipement):
   • 15 cm et 22 cm de pipettes Pasteur
   • Diamant scribe
   • eau de mer artificielle filtrée (salinité entre 0,0018 à 0,0020) contenant 1 mg / ml d'amphotéricine B (1:100 d'une solution stock de 100 mg / ml), 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine (1h50 d'une solution mère contenant 5000 unités / ml de pénicilline et 5,000 mg / ml de streptomycine) <....

Résultats

Après ablation réussie de seul troisième clivage P. micromères de hawaiensis comme décrit dans ce protocole, les micromères restants passent progressivement leurs positions légèrement de manière à occuper partiellement l'espace précédemment occupé par le blastomère ablation. Par exemple, lorsque g est retiré, le voisin blastomères MR et ML décaler légèrement et venez partager les bordures de cellules latérales qui étaient auparavant en contact direct avec g.......

Discussion

Nous décrivons un protocole pour l'ablation d'emploi et l'élimination physique complète de blastomères simples à partir des stades de clivage début de l'amphipode P. hawaiensis. Nous démontrons l'utilisation de ce protocole en supprimant la seule ligne de cellules germinales précurseur g à partir d'un embryon au stade de huit cellules, et montrons que l'ablation a été un succès en confirmant l'absence de cellules filles de g dans l'embryogenè.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipette Pasteur 15 cm	Wheaton	53499-630 VWR	Pour le transfert d’embryons intacts et ablatés au blastomère d’une boîte à l’autre.
Pipette Pasteur 22 cm	Wheaton	53499-632 VWR	Pour la fabrication d’embouts de pipette buccale.
Boîtes de Pétri de 3 cm	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Utilisez-en une partie non altérée pour collecter et stocker les embryons ; enduisez-en une couche de Sylgard (voir ci-dessous) pour créer une surface de travail pour les ablations de blastomères.
Plaques 48 puits	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	Pour la culture d’embryons après ablation.
Filtres pour bouteilles 0.2 & micro ; m	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	Pour la création de FASW (Voir ci-dessous).
Bec Bunsen	VWR	89038-530 VWR	Pour la création d’un outil en fil de tungstène et d’une pipette à pointe fine.
Scribe diamant	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	Pour la création de pipettes Pasteur à large ouverture pour collecter des couples.
Pince	Outils pour les sciences fines	11050-10 Outils pour les sciences fines	Pour maintenir les femelles anesthésiées lors du retrait des embryons de la poche à couvain. Il n’est pas nécessaire qu’il s’agisse de pinces Dumont à pointe fine - les pointes peuvent être au moins aussi émoussées que celles des pinces dont le numéro de catalogue est indiqué ici.
Fungizone-Amphotéricine B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Ajouter à FASW jusqu’à une concentration finale de 1 mg/ml, et utiliser cette solution pour cultiver des embryons ablatés au blastomere.
Capillaires en verre de 4 po de long, 1/0,58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	Pour la fabrication d’aiguilles pour percer le blastomère à ablater.
Verre de montre en verre de 300 mm de diamètre	Microscopie électronique Sciences	70543-30 Microscopie électronique Sciences	À utiliser pour prélever des embryons de la poche de couvain de femelles anesthésiées.
Eau de mer artificielle Instant Ocean (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Make ASW en dissolvant le sel dans de l’eau désionisée à une salinité de 1,022-1,024.
Eau de mer artificielle filtrée Instant Ocean (FASW)	Écosystèmes	aquatiques Instant Ocean IS160	Utilisation 0.2 µ ; m filtres pour stériliser ASW. Préparer en petites quantités (< 250 ml) au besoin.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	Pour casser en toute sécurité l’extrémité fine des pipettes Pasteur modifiées pour recueillir des couples.
Adaptateur de pipette buccale	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Insérez la pointe de pipette Pasteur finement tirée à cette extrémité, à utiliser pour éliminer le contenu des cellules extrudées pendant la procédure d’ablation.
Tube de pipette buccale	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Coupez-le pour qu’il soit suffisamment long pour être confortablement suspendu autour de votre cou pendant la procédure d’ablation.
Extracteur d’aiguille	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	Pour la fabrication d’aiguilles à partir de capillaires en verre pour perforer le blastomère à ablater.
Pénicilline-streptomycine	Solution Mediatech	45000-650 VWR	Ajouter à FASW à une concentration finale de 100 unités/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine, et utiliser cette solution pour cultiver des embryons ablatés au blastomere.
Poire en caoutchouc	Microscopie électronique Sciences	100488-418 VWR	Pour l’utilisation de pipettes Pasteur pour le transfert d’embryons d’une boîte à l’autre.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Maquiller selon les instructions du fabricant. Versez une couche de 2 à 5 mm d’épaisseur dans une boîte de Pétri de 3 cm pour créer une surface de travail pour les ablations de blastomères.
Fil de tungstène 0,004 pouces de diamètre	A-M Systems	719000 A-M Systems	Utilisez-le pour fabriquer un outil permettant de retirer des embryons de la poche à couvain des femelles anesthésiées.