Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d'analyse de fluctuation k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants.
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Article de méthode
Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l'espace spectroscopie de corrélation
Dans cet article
Résumé
Résumé
Diffusion latérale et la compartimentation des protéines de la membrane plasmique sont strictement réglementées dans les cellules et donc, l'étude de ces processus va révéler de nouvelles perspectives à plasma fonction de la protéine de la membrane et de la réglementation. Récemment, k-image de l'espace spectroscopie par corrélation (CCI) 1 a été développé pour permettre des mesures de routine de coefficients de diffusion directement à partir des images des protéines de la membrane plasmique marquées par fluorescence, qui ont évité les biais systématiques introduites par photophysique de la sonde. Bien que la base théorique pour l'analyse est complexe, le procédé peut être mis en oeuvre par des non experts en utilisant un code librement disponible pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines. CIEk calcule une fonction de corrélation temporelle d'une image de microscopie à fluorescence pile après transformation de Fourier de chaque image pour réciproque (k-) espace. Par la suite, une moyenne circulaire, logarithme naturel transformée linéaire et correspond à la fonction de corrélation donne le coefficient de diffusion. Cedocument fournit un guide étape par étape pour l'analyse d'image et la mesure des coefficients de diffusion via CIEk.
D'abord, une image d'une séquence de protéines de membrane de plasma marqué par fluorescence de cadence élevée est acquise en utilisant un microscope à fluorescence. Puis, une région d'intérêt (ROI) en évitant organites intracellulaires, les vésicules se déplaçant ou en saillie régions de la membrane est sélectionné. La pile de retour sur investissement est importé dans un code librement disponible et plusieurs paramètres définis (voir la section Méthode) sont définis pour l'analyse des CCI. Le programme génère alors une «pente des pentes« complot des fonctions de corrélation de temps k-espace, et le coefficient de diffusion est calculée à partir de la pente de la courbe. Voici une procédure étape par étape CIEk pour mesurer le coefficient de diffusion d'une protéine de membrane à l'aide du rénale canal d'eau aquaporine-3 marqués avec EGFP comme un exemple canonique.
Introduction
L'organisation spatio-temporelle quatre dimensions et la mobilité latérale des protéines membranaires plasmatiques sont strictement réglementées et peuvent jouer un rôle dans la fonction de la protéine, l'activité et les interactions protéine-protéine. Diffusion latérale des protéines de la membrane de plasma, a traditionnellement été étudiée en calculant les coefficients de diffusion pour les particules individuelles à partir de l'imagerie time-lapse de point quantique ou un colorant des protéines marquées de la membrane plasmique 2-4. Cette approche nécessite l'insertion d'une étiquette extracellulaire dans le plasma protéine membranaire de point quantique ou un marquage par un colorant, qui peut compromettre le pliage et la fonction des protéines et, par conséquent, ne peut être réalisé pour certaines protéines. Le volume stérique d'un point quantique a été montré pour ralentir la diffusion de la protéine 5 et plus, seule une infime fraction des protéines de la population sont étiquetés avec des points quantiques, et on ne sait pas si cette fraction est représentatif pour l'ensemble de un groupe de protéines de membrane de plasma. Tra de particules simplescking (SPT) des mesures de coefficients de diffusion de la série d'image de protéines marquées de points quantiques consiste à cartographier les positions des pics de représentation des particules avec deux dimensions gaussien Convient suivis par de vastes algorithmes d'analyse. L'analyse est de calcul très intense, ce qui nécessite de courbe non linéaire étendu raccord à chaque trame d'image d'une séquence time-lapse à des approximations de la fonction microscope d'étalement de point (typiquement deux dimensions gaussiennes spatiale) et la liaison subséquente des positions des particules dans les trajectoires des particules décrivant l' mouvement des molécules simples 6,7.
Une technique de corrélation d'images récemment mis au point, k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) permet des mesures relativement simples de coefficients de diffusion de fluorescence protéines marquées de la membrane plasmique. La possibilité de calculer systématiquement les coefficients de diffusion des protéines membranaires avec des protéines fluorescentes marquées par CIEk est un outil unique qui maintientplusieurs avantages par rapport quantique traditionnelle dot analyse SPT: Aucune insertion de balises et temps extracellulaires consommateurs étiquetage extracellulaire est nécessaire (lignées de cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent être utilisés); les coefficients de diffusion sont extraites à partir du pool total de protéines fluorescentes par rapport à un sous-ensemble marqué avec des points quantiques; analyse est simple, sans la nécessité de suivre certaines protéines et l'analyse peut être effectuée en utilisant un code existant sans nécessiter de programmation supplémentaire de l'utilisateur. La méthode est rapide car il s'agit d'une technique de calcul de moyenne, qui permet un calcul rapide et le calcul des coefficients de diffusion. Ces mesures de diffusion rapide de la population en protéines complètent l'information de transport moléculaire plus détaillée obtenue pour un sous-ensemble de la population par les méthodes SPT laborieux.
temps CIEk corrélation microscopie de fluorescence des séquences d'images qui ont d'abord été transformées à l'espace de Fourier, et ainsi sépare flfluctuations uorescence raison de photophysique de celles dues au transport moléculaire 1. En conséquence, les CCI peuvent déterminer la densité en nombre, de la vitesse d'écoulement, et la diffusion des molécules marquées par fluorescence tout en étant biaisée par photoblanchiment complexe ou le clignotement des fluorophores. Cela rend CIEk un outil utile pour déterminer rapidement la dynamique de diffusion de protéines membranaires de cellules marquées par fluorescence, sans la nécessité d'algorithmes d'écriture personnalisées. En plus des protéines marquées par fluorescence, CIEk peuvent également être appliquées à des protéines de membrane quantiques point marqué 8.
Cet article fournit une introduction étape par étape comment utiliser CIEk pour extraire les coefficients de diffusion des protéines de la membrane plasmique EGFP-marqués en démontrant comment placer la culture, comment utiliser le code et comment évaluer les tracés générés, dont la diffusion les coefficients sont extraits. A titre d'exemple, les données obtenues par filage ensemble disque-microscopie en réflexion totale interne semi-fluorescenceMode nce (FRBR), d'une protéine canal rénale de l'eau aquaporine-3 (AQP3) étiqueté avec EGFP est présenté.
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Protocole
Acquisition des protéines EGFP-marqué dans la membrane du plasma pour l'analyse des CIEk peut être fait sur un microscope à épifluorescence, une configuration de TIRF ou sur un microscope à disque rotatif fixé à acquérir des images de la membrane d'intérêt. La taille de pixel caméra ainsi que le temps entre les trames d'image sont nécessaires pour l'analyse. Les séquences d'images de 100-1,200 images à un taux de 4-30 Hz cadre peuvent être utilisés pour l'analyse. Au cours de l'acquisition, il est important de maintenir la membrane à l'orientation tout au long de la durée de l'imagerie et de se concentrer sur une fraction de la membrane à plat dans laquelle la fluorescence est uniformément répartie. Déménagement vésicules, dépassant les régions membranaires et des organites cellulaires peut être cultivé plus tard dans le processus d'analyse. Le temps d'acquisition doit être choisi de sorte qu'il n'y ait pas de dérive ou du mouvement de la cellule.
Pour obtenir les scripts de code CCI pour MATLAB, communiquez avec Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La première fois que le code est utilisé CIEk, MAT ouvertLAB et cliquez sur le fichier, puis définissez le chemin, puis cliquez sur ajouter des sous-dossiers et trouver le dossier sur l'ordinateur dans lequel le code CIEk se trouve. Puis cliquez sur OK, enregistrer et fermer. Maintenant, continuez avec l'analyse des cultures décrites dans les points suivants.
1. Importer la séquence d'images d'intérêts dans un programme d'analyse d'imagerie comme une pile TIFF
Enregistrez le fichier avec le nom: stack1.tif.
- Sélectionnez une région rectangulaire d'intérêt (ROI) à la partie plate de la membrane à l'exclusion des organites cellulaires mobiles et dépassant les régions de la membrane. La taille de la récolte est choisi de telle sorte que suffisamment de statistiques sont générées pour bien k 2 parcelles.
- Recadrage de la région et de sauver la récolte en tant que fichier TIFF dans un dossier approprié. S'il ya plusieurs cultures par le même film, utiliser un incrément de nombre, par exemple «stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
- Placez le dossier contenant les cultures localementsur l'ordinateur, pas sur un serveur, tout en faisant l'analyse des CCI.
2. Importez les cultures dans le logiciel d'analyse de One by One pour effectuer l'analyse
- Ouvrir MATLAB et le type "icsgui" dans la fenêtre de commande et appuyez sur ENTRÉE. ICS GUI est le nom de l'exécutable pour le programme d'interface graphique utilisateur de spectroscopie de corrélation de l'image.
- Dans l'interface graphique de ICS cliquez sur l'onglet "CIEk". Une capture d'écran de la fenêtre d'analyse est représenté sur la figure 1.
- Trouver le dossier avec le nom du dossier "code MATLAB" et sélectionnez le fichier avec le nom de fichier "Scripts" et l'ouvrir en double-cliquant dessus. Sinon, cliquez droit sur le fichier et sélectionnez "ouvrir avec MATLAB" ou allez dans Fichier, ouvert dans MATLAB et ouvrez le fichier son. Ce fichier est appelé Editor.
- Dans le livre de l'éditeur de "données CCI de charge ensembles", puis copier ou nom de fichier de type et l'emplacement du dossier dans la ligne de commande qui commenceavec img = par exemple "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". Dans la ligne de commande ci-dessous l'emplacement du dossier définir le nombre d'images à analyser - par exemple [1:500]. Utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données. S'il ya dérive accent dans des cadres plus tard, ceux-ci devraient être exclus de l'analyse.
- Dans l'éditeur cliquez sur "enregistrer" puis cliquez sur "évaluer cellule". L'ensemble de données est maintenant chargé dans dans le logiciel d'analyse.
- Dans la fenêtre Analyse CIEk dans l'interface graphique, entrez les paramètres de l'analyse:
- Décochez boîtes "de cellules T".
- Entrez le nombre de décalages dans le temps à analyser. Le nombre de retards de temps (τ) aura un effet sur la parcelle de diffusion et doit être choisi de telle sorte que l'intrigue de diffusion est linéaire. Commencez par entrer 25, puis diminuer à l'endroit où le tracé de diffusion est linéaire. τ est le nombre de décalages dans le temps de l'analyse des CIEk compare et un décalage dans le temps est le temps bntre une trame et la suivante. La plus petite valeur qui donne un tracé linéaire doit être sélectionné. Le nombre maximum de décalages dans le temps est choisi de telle sorte que d'un ajustement linéaire est obtenue, en choisissant une valeur plus élevée de produire des données qui ne peuvent pas être montés en ligne.
- Entrez la valeur maximale k 2 (voir cercle 1 dans la figure 1), il est habituellement de 20-50. Un bon k 2 intrigue est un complot dans lequel il ya de nombreux points qui sont répartis le long d'une ligne de données. Commencez par entrer 70, puis diminuer après avoir évalué les k 2 et de diffusion des parcelles et sélectionnez la valeur la plus faible de la grappe de points de données autour d'une ligne droite. La valeur de 2 k est l'amplitude au carré de la k-vecteur spatial dans l'espace de Fourier.
Initialement, l'analyse doit être répétée jusqu'à ce que les meilleures valeurs sont déterminées, puis utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données, mais toujours vérifier que les réglages sélectionnés donnent un bon ajustement aux données: bien k 2 parcelleset un terrain de diffusion linéaire. - Cliquez sur "paramètres de magasins et de procéder".
- Cliquez sur "oui" pour afficher tous les graphiques.
- Cliquez sur "série d'images de charge" (voir cercle 2 de la figure 1), puis cliquez sur "espace de travail".
- Sélectionnez "imgSerCrop", puis cliquez sur "Importer à partir d'espace de travail".
- Entrez les paramètres de collecte du système d'imagerie. Dans la "taille de pixel" boîte entrer la taille du pixel projeté pour le système de formation d'image à laquelle les piles d'images sont acquises. Pour AQP3-EGFP, 0.111 ont été utilisés. Dans la zone "Entrer l'heure (s) entre les images", 0,1150 a été utilisé pour AQP3-EGFP.
- Cliquez sur "sélectionner ROI", entrer "1", cliquez sur OK et "utiliser l'image entière".
- Cliquez sur "analyse Do CIEk" et cliquez sur Oui pour faire "filtrage immobile". Résultats s'ouvriront automatiquement comme des images.
- Réduire la fenêtre des paramètres, de minimiser les informations de cellule window, et minimiser la fenêtre de photophysique. Dans la fenêtre dynamique, vérifiez que l'intrigue de la dynamique montre un ajustement linéaire des données à une ligne avec une pente négative ce qui signifie que les points de données en corrélation et la diffusion libre peuvent être assumées. Enregistrer le coefficient de diffusion pour le laps de temps spécifique et k 2 paramètres (il n'est pas nécessaire de noter l'écart-type de l'ajustement). Les points de données dans les k 2 parcelles doivent être regroupés autour de la ligne pour le moment donné traîne.
- Cochez la case "Enregistrer figures ouvertes que des images", puis cliquez sur "Sauvegarder figures ouvertes que les images" pour enregistrer des fichiers en résultant. Enregistrer dans un nouveau dossier sous C: Users Documents AQP3diffusion. Cliquez sur "données actuelles clair" et continuer avec l'analyse de la prochaine récolte.
3. Moyen du coefficient de diffusion calculé est calculée pour obtenir une vue d'ensemble des données analysées
- Entrez les coefficients de diffusion individuels de chaque ROI dans un spreadsheet (assurez-vous de noter le τ et k 2 valeurs), utilisez les noms des cultures que fixé ci-dessus.
- Calculer le coefficient de diffusion moyenne et écart-type à l'aide d'un tableur.
- Effectuez un test de Kolmogorov-Smirnov ou étudiants t-test pour évaluer les différences statistiques en utilisant un niveau de signification de 5%. Quantitave comparaisons entre les cellules (par exemple traitées vs non traitées) peuvent être faites.
- Ouvrez la version de feuille de calcul des parcelles de diffusion qui a été généré par le logiciel d'analyse pour chaque culture, et la moyenne des données pour chaque condition pour chaque décalage. Générer un nouveau terrain de diffusion moyenne pour présenter dans des documents ou des présentations.
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Résultats
Pour acquérir des piles d'images convenant pour être analysés à l'aide CIEk, des microscopes différents peuvent être utilisés. Il est possible d'analyser des séquences d'images à partir d'un microscope à épifluorescence, ainsi que d'une configuration de disque TIRF ou filage. La membrane doit être plat, sans grandes organites cellulaires mobile ou le déplacement des vésicules / objets. Cet article présente une séquence d'images de laps de temps de AQP3 étiqueté avec EGFP dans des cellules MDC...
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Discussion
Ce document présente un aperçu détaillé étape par étape de la façon d'appliquer la méthode d'analyse des CIEk pour déterminer les coefficients de diffusion à partir d'images de microscopie de protéines marquées avec des protéines fluorescentes. L'analyse est indépendant du choix de la sonde avec une très large gamme dynamique de la densité de marquage et peut donc également être appliquée à des protéines marquées avec des points quantiques ainsi que des colorants et des protéines fluorescentes telles que...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une Lundbeck Junior Group Leader Bourse de LNN. PWW reconnaît le soutien financier de la subvention du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et. Nous remercions également le danois moléculaire Bioimaging Centre à l'Université du Danemark du Sud pour l'accès à la filature microscopie disque.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Péniciline ; ; | Sigma | 13752 | |
| Kanamycin | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycine | Gibco | 11860038 | |
| Phenol red free medium | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Appareil | |||
| Microscope à disque rotatif | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Appareil photo | Andor | Ixon+ |
Références
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- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
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- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
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Réimpressions et autorisations
