Inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères Nuclear Receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes

Hao Li; Wei Dou; Emil Padikkala; Sridhar Mani

doi:10.3791/51085

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Article de méthode

Inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères Nuclear Receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes

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DOI :

10.3791/51085

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15 novembre 2013

Hao Li^*¹ , Wei Dou^*² , Emil Padikkala¹ , Sridhar Mani¹

¹Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , ²Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Kétoconazole se lie à et antagonise Pregnane X Receptor (RPX) activation. Levure haute écrans de débit de mutants PXR définissent une région unique pour la liaison kétoconazole. Cette méthode génétique à base de levure découvre interactions avec les récepteurs nucléaires de nouveaux avec des ligands qui s'associent avec les sites de liaison surface.

Résumé

En tant que régulateur essentiel du métabolisme des médicaments et de l'inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), joue un rôle important dans la physiopathologie de la maladie reliant le métabolisme et l'inflammation (par exemple, de la stéatose hépatique) ^1,2. Il a eu beaucoup de progrès dans l'identification des ligands agonistes pour PXR, cependant, il ya des descriptions limitées des antagonistes de la drogue comme et leurs sites de liaison sur PXR ^3,4,5. Un obstacle majeur a été l'incapacité à purifier efficacement la protéine de longueur totale pour des études structurales avec des antagonistes malgré le fait que PXR a été clonée et caractérisée en 1998. Notre laboratoire a développé une nouvelle levure à haut débit à base de dosage à deux hybrides de définir un antagoniste, le kétoconazole de résidus de liaison sur PXR ^6. Notre méthode consiste à créer des bibliothèques de mutation qui sauver l'effet des mutations simples sur la surface AF-2 de PXR prévu pour interagir avec le kétoconazole. Sauvetage ou «gain de fonction» second mutations peuvent être effectuées de telle sorte que des conclusions en ce qui concerne l'interaction génétique du kétoconazole et le résidu (s) de surface sur PXR sont réalisables. Ainsi, nous avons développé un haut débit écran de deux hybrides de levure de mutants PXR interagissant avec son coactivateur SRC-1. En utilisant cette approche, dans laquelle la levure a été modifié pour tenir compte de l'étude de la drogue antifongique, le kétoconazole, nous avons pu démontrer mutations spécifiques sur PXR enrichies en clones incapables de se lier au kétoconazole. Par la logique inverse, nous concluons que les résidus d'origine sont des résidus d'interaction directe avec le kétoconazole. Ce test représente un roman, essai génétique docile à l'écran pour les sites de liaison antagonistes sur les surfaces des récepteurs nucléaires. Cet essai peut être appliqué à n'importe quel médicament, indépendamment de son potentiel cytotoxique de la levure ainsi que de la protéine cellulaire (s) qui ne peut être étudiée en utilisant la biologie structurale standard ou les méthodes à base de protéomiques. Pièges potentiels incluent l'interprétation de données (méthodes complémentaires utiles), reliment sur la méthode unique de Y2H, expertise dans le traitement de levure ou d'effectuer des essais levure à deux hybrides, et l'optimisation des essais.

Introduction

La levure double hybride (Y2H) test est largement utilisé pour découvrir des interactions protéine-protéine et, plus récemment, à la découverte de nouvelles petites molécules qui perturbent les complexes protéine-protéine interaction ^{7, 8, 9, 10, 11.} Cependant, les approches conventionnelles de ce test, utilisé pour la découverte de médicaments ou "hits", ne permettent pas la détection de résidus d'interaction allostériques de composés chimiques dans les surfaces protéine-protéine, que s'il est modifié encore interagir et de permettre l'interrogatoire des résidus modifiés ¹¹ . En effet, un tel procédé (s), si possible de développer, ....