Optimisé coloration négative: un protocole à haut débit pour examen petites et asymétrique structure des protéines par microscopie électronique

Summary

Plus de la moitié des protéines sont de petites protéines (masse moléculaire <200 kDa) qui sont difficiles pour les deux électrons imagerie de microscope et des reconstructions tridimensionnelles. Coloration négative optimisé est un protocole robuste et à haut débit pour obtenir un contraste élevé et des images de petites protéines ou des complexes asymétriques dans différentes conditions physiologiques résolution relativement élevée (~ 1 nm).

Abstract

Détermination de la structure des protéines est plutôt difficile pour les protéines de masse moléculaire entre 40 - 200 kDa. Étant donné que plus de la moitié des protéines naturelles ont une masse moléculaire comprise entre 40 - 200 kDa ^1,2, une méthode robuste et à haut débit d'une capacité de résolution nanométrique est nécessaire. Coloration négative (NS) microscopie électronique (EM) est une approche facile, rapide et qualitative qui a souvent été utilisé dans les laboratoires de recherche d'examiner les interactions de structures de protéines et protéines-protéines. Malheureusement, les protocoles de NS conventionnels génèrent souvent des artefacts structurelles sur les protéines, en particulier avec les lipoprotéines qui se forment habituellement exposer des artefacts Rouleaux. En utilisant des images de lipoprotéines de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) en tant que norme, les paramètres clés de NS conditions de préparation de l'échantillon ont été récemment examinés et présentés comme le protocole optimisé NS (OPN), un protocole NS classique modifié ^3. Artefacts comme rouleaux peut être fortement limitée par NPO, fournissant en outre un contraste élevé avec assez haute résolution (près de 1 nm) des images de petites et asymétriques protéines. Ces images à haute résolution et un contraste élevé sont même favorables à une protéine individuelle (un seul objet, pas de moyenne) reconstruction 3D, tel qu'un anticorps 160 kDa, par la méthode de tomographie électronique ^4,5. En outre, OPNS peuvent être un outil à haut débit à examiner des centaines d'échantillons de petites protéines. Par exemple, le mécanisme précédemment publiée de 53 kDa de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) impliqué l'examen d'imagerie et de centaines d'échantillons ^6. Considérant cryo-EM rarement avec succès images protéines inférieure à 200 kDa n'a pas encore publié une étude portant sur le dépistage plus d'une centaine conditions de l'échantillon, il est juste d'appeler OPNS une méthode à haut débit pour l'étude de petites protéines. Espérons que le protocole OPNS présenté ici peut être un outil utile pour repousser les limites de EM et d'accélérer les études électromagnétiques dans petite structure de la protéine, la dynamique et les mécanismes.

Introduction

La compréhension de la fonction des protéines nécessite la connaissance de la structure des protéines. Détermination de la structure est difficile pour des protéines dont les masses moléculaires sont à 40 - 200 kDa. Cristallographie aux rayons X est limitée par la cristallisation des protéines; résonance magnétique nucléaire (RMN) est limitée à des masses moléculaires inférieures à 40 kDa, alors que cryo-microscopie électronique (cryo-EM) a des difficultés à la fois l'acquisition de l'image et en trois dimensions (3D) des reconstitutions de petites protéines, dont les masses moléculaires sont inférieures à 200 kDa. Notamment, plus de 50% de protéines ont une masse moléculaire dans la gamme de 40 - 200 kDa ^1,2, comme les méthodes actuelles sont difficiles à étudier des protéines de cette taille, une nouvelle méthode est nécessaire.

Bien que la plupart des microscopes électroniques à transmission (TEM) sont capables de la résolution atomique, c'est à dire, mieux que 3 Å de résolution, la réalisation même une structure proche de résolution nanométrique à partir d'un des échantillons biologiques est assez défging ^7. dégâts d'irradiation, faible contraste, les écarts structurels ainsi que des artefacts tels que la déshydratation nuisent tous à haute résolution TEM imagerie ^3,8.

Parmi les diverses approches de TEM, cryo-EM est une méthode d'arête de coupe de pointe et de réaliser des structures de résolution atomique de grandes macromolécules hautement symétriques dans des conditions physiologiques proches de ^9-12. L'échantillon cryo-EM est préparé éclair congélation de la solution d'échantillon, l'intégration dans les macromolécules glace vitreuse, qui est ensuite imagé à des températures cryogéniques, tels que la température du liquide de l'azote ou de l'hélium ^13. Cryo-EM est avantageux en ce que les échantillons ne présentent aucun des artefacts et sont presque natif dans la structure ^8-12. Cryo-EM a ses inconvénients: i) des dispositifs supplémentaires sont nécessaires pour être installé ou acheté pour mettre à jour un instrument de TEM standard pour une capacité cryo-EM. Les dispositifs comprennent: anti-contaminateur, porte-cryo, logiciels en mode à faible dose et sensi faible dosecaméra CCD tive, bien que les prix de ces appareils sont beaucoup plus bas que le prix de l'instrument de TEM elle-même; ii) le fonctionnement cryo-EM a besoin plus de temps que l'opération NS. Examen d'un échantillon cryo-EM nécessite souvent plus de temps pour préparer des échantillons et faire fonctionner l'appareil de TEM que celle de NS parce cryo-EM, il faut traiter des difficultés supplémentaires, y compris: liquide opération de température de l'azote, l'échantillon de charge, la dérive de l'imagerie, des gradients de température, à faible dose opération de modèle, l'échantillon sensibilités de rayonnement et les limites de dosage. Ces mesures supplémentaires vont ralentir la vitesse d'acquisition des données utiles par rapport à l'acquisition de données NS, bien que quelques images cryo-EM peuvent certainement être obtenus en 1 heure ou moins par des experts cryo-EM avec l'instrument préparé avec un gradient de température équilibrée; iii) les utilisateurs ont besoin de formation supplémentaire, comme la manipulation de l'azote liquide, gel grilles cryo-EM, un fonctionnement à faible dose, la mesure de la dose, la manipulation de la charge, à la dérive et de la connaissance dans l'imagerie processer; iv) l'absence d'imagerie reproductible pour les mêmes cryo-échantillon au cours des différentes séances de TEM. Spécimens Cryo-EM sont facilement endommagées par la contamination de la glace pendant spécimen chargement et le déchargement de / vers l'instrument TEM. Ce dommage est particulièrement préoccupant lorsque les échantillons sont difficiles à être isolé / purifié ^14; v) de petites protéines (<200 kDa de masse moléculaire) sont difficiles à imager en raison du faible contraste; vi) le faible contraste et de bruit élevé des images cryo-EM réduit la valeur de corrélation croisée entre les images, par conséquent, diminuer la précision globale de la détermination des orientations de protéine, les conformations et les classifications, en particulier pour des protéines qui sont structurellement souple et varient naturellement en solution ^4,5.

Coloration négative (NS) est relativement "ancienne" et méthode historique de tout laboratoire, avec n'importe quel type EM, peut utiliser pour examiner la structure de la protéine. Brenner et Horne d'abord développé le concept of de coloration, il ya un demi-siècle négatif pour l'examen de virus ^15. NS est réalisé par enduction de l'échantillon avec des sels de métaux lourds chargées. Ce concept originaire d'microscopie optique et la pratique de l'intégration des bactéries dans une solution de tache fournir obscurité autour des spécimens, ce qui permet plus contraste de l'image lors de la visualisation de l'image négative ^16. Etant donné que les ions de métaux lourds ont une plus grande capacité de dispersion des électrons par rapport aux atomes moins denses dans les protéines ^{de 17 à 20,} et aux taches revêtement de métal lourd permet une limitation de la dose la plus élevée avec un contraste amélioré. Spécimen NS peuvent fournir des images à contraste élevé ⁸ pour faciliter la détermination de l'orientation des particules et de la reconstruction 3D que les images de cryo-EM.

NS traditionnels, malheureusement, peuvent produire des artefacts induits par les interactions protéines-tache, comme l'agrégation général, la dissociation moléculaire, d'aplatissement et d'empilage ^8,21,22. Pour lipides liés proteins, comme les lipoprotéines ^16,23-30, un des résultats de l'artefact commun dans les particules qui sont empilés et emballés ensemble dans un rouleaux (Figure 1) ^31-36. De nombreuses études de lipoprotéines, comme l'électrophorèse sur gel non dénaturant de polyacrylamide gradient, cryo-EM étudie ^{13,29,37-40, 39,41} spectrométrie de masse, et les données de diffraction de petits angles de rayons X ⁴² montrent toutes les particules sont des particules de lipoprotéines isolées au lieu d'empiler naturellement un ensemble formant rouleaux ^{21,29,30,35,42-45.} L'observation de la formation de rouleaux par NS classiques est peut-être causée par des interactions dynamiques entre les lipoprotéines composées des apolipoprotéines (apo) et des phospholipides qui sont structurellement souple en solution ^{13,29,30,46-49} et la sensibilité au protocole NS standard. Pour identifier cet artefact, l'apolipoprotéine E4 (ApoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) lipoprotéines de haute densité (HDL) échantillon ont été utilisés comme un échantillon de test et la cryogénieImages EM pour une norme sans artefacts ^29, le dépistage des spécimens NS préparés sous une série de conditions. En comparant les tailles de particules et de formes obtenues à partir de NS et cryo-EM, le type de réactif de coloration et de la concentration en sel se sont révélés être de deux paramètres essentiels provoquant les phénomènes Rouleaux bien connus. Ainsi, un protocole coloration négative optimisé (NPO) a été signalé.

Par OPNS, le phénomène bien connu de rouleaux de apoE4 HDL a été éliminé par OPNS (figure 2A). L'analyse statistique a démontré OPNS rendements des images très semblables (moins de 5% d'écart) de taille et de forme par rapport à ceux de cryo-EM, mais le contraste a été éliminé. Les validations des OPNS ont été réalisées par l'examen de l'élimination de l'artefact de rouleaux de la quasi-totalité des classes ou sous-classes de lipoprotéines échantillons de ^{6,29,30,50,51,} notamment l'apoA-I de 7,8 nm (figure 2B), de 8,4 nm (figure 2C) , 9,6 nm discoidal reconstitué HDL (rHDL) (figure 2D), 9,3 nm sphérique rHDL (figure 2E), HDL humaine plasmatique (figure 2F), le lipide libre apoA-I (figure 2G), le HDL plasmatique (figure 2H), lipoprotéines de basse densité (LDL ) (figure 2I), une lipoprotéine de densité intermédiaire (IDL) (Figure 2J), lipoprotéines de très basse densité (VLDL) (figure 2K), et des liposomes POPC (figure 2L) ^30. Validations supplémentaires ont été réalisées par l'imagerie des petits et asymétriques protéines, y compris la 53 kDa protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) (Figure 3A - C) ^6,29, et très flexible 160 kDa anticorps IgG (figure 4A et B) ^{4,5,29 , 52,} et deux protéines de structure bien connue, et GroEL protéasome (figure 2 M et N). Pour nécessiter de validation supplémentaire de colleagues, nous sommes ouverts à toutes tests à l'aveugle sur cette méthode OPNS.

OPNS comme un protocole à haut débit a également été utilisée pour étudier le mécanisme de la protéine par l'intermédiaire de l'examen des centaines d'échantillons de petites protéines, telles que la CETP qui a été lient à diverses protéines de moins d'une des conditions de la série (y compris la CETP interaction à quatre classes de lipoprotéines, recombiné HDL, plasma HDL, LDL et VLDL, avec / sans 2 anticorps, H300 et N13, sous 9 fois d'incubation, y compris 3 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h et 72 h, moins de quatre rapports molaires, à savoir 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, et les trois dilutions, à savoir 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml et 0,001 mg / ml, ainsi que des échantillons de contrôle additionnels, y compris CETP seul, LDL seul, et VLDL seul, avec triples tests d'expériences ci-dessus par des personnes différentes) ^6,29. OPNS images de la CETP fourni des images à contraste élevé avec assez petits détails structurels; nous permettant de reconstruire une carte de densité 3D de 53 kDa sma succèsprotéine CETP II (Figure 3D - F) par la reconstruction de particules unique. En outre, les images à fort contraste OPNS nous fournissent un signal suffisant d'une protéine individuelle (figure 4A - C), qui nous a permis d'atteindre la résolution intermédiaire (~ 1,5 nm) d'un seul (un objet, pas de moyenne) la structure d'anticorps IgG 3D via la méthode (Figure 4E - J) tomographie électronique individu de particules (IPET) ^5. La description détaillée de la stratégie IPET de reconstruction, de la méthodologie, processus étape par étape et l'analyse de la variation structurelle ont été précédemment rapporté ^4. Un film sur les procédures de reconstruction d'anticorps IPET, y compris les images brutes et les résultats intermédiaires, carte de densité 3D et accueil structurelle était aussi la disposition du public par ligne sur YouTube ^5. Comparaison des reconstructions 3D à partir de différentes particules anticorps individuels pourrait révéler la dynamique de protéines et conformational changements au cours des réactions chimiques ^4,5.

Considérant que plus de 50% de protéines ont une masse moléculaire allant de 40 à 200 kDa ^1,2, le succès dans l'imagerie de ces petites protéines en témoigne cette méthode OPNS est un outil utile pour pousser les frontières de EM classique vers les petites et asymétriques déterminations structurelles et découvertes mécanisme . Ainsi, le protocole détaillé est fourni ci-dessous.

Protocol

1 Préparation de la solution de coloration fraîche négatif à 1% (p / v)

1. Mettez 1 mg Uranyle formate (UF) de poudre dans une bouteille en verre contenant 100 ml d'eau déminéralisée dans une pièce sombre ou boîte.
2. Agiter la solution O / N à la température ambiante dans une chambre / boîte sombre. Envelopper la bouteille de solution avec du papier d'aluminium pour empêcher la lumière de frapper la solution.
3. Filtrer la solution à travers doucement 0,2 pm (taille des pores) filtre monté sur une seringue de 5 ml. La solution filtrée a été recueilli dans des tubes Falcon plusieurs couverts d'une feuille d'aluminium. La seringue de filtre doit être enveloppée d'un papier d'aluminium pour empêcher l'exposition de la lumière.
4. Filtrer la solution à travers de nouveau 0,02 pm (taille des pores) monté sur filtre seringue de 1 ml. La solution filtrée a été recueilli et aliquote dans des flacons de 2 ml. Les seringues et des flacons étant recouvertes d'une feuille d'aluminium avant de les utiliser.
5. Geler immédiatement les flacons aliquotes en utilisant une pince à long manche, submergeant les flacons dans un récipient rempli d'azote liquideaprès que la solution a été filtrée.
6. Transférer les flacons congelés dans un congélateur à -80 ° C pour le stockage et l'utilisation future.

2 Préparation du poste de travail négatif de coloration et d'incubation Workstation

1. Décongelez un flacon de solution UF 1% dans un bain-marie réglé à la température ambiante. Assurez-vous que la feuille d'aluminium reste enroulé autour du flacon pour éviter l'exposition à la lumière.
2. Filtrer la solution après qu'elle soit complètement décongelé à l'aide d'une feuille d'aluminium enroulée seringue de 1 ml monté avec un filtre 0,02 pm. Recueillir la solution filtrée dans une nouvelle feuille d'aluminium flacon enveloppé, et l'a placé sur la glace dans une boîte de glace de chapeau couvert d'attente pour l'utilisation.
3. Faire plaques de solution par un doigt de poussée longue feuille de Parafilm ~ 8 de pouce sur la surface d'une plaque de cristallisation de protéines vide. Il va générer des rangées de plaques circulaires avec un diamètre d'environ 5 mm. Faire 6 assiettes à chaque endroit de la ligne les plaques Parafilm sur une surface de glace aplati à l'intérieur d'une glace contiennentcouvercle er, comme un poste de travail de coloration.
4. Pipette ~ 35 ul d'eau désionisée sur chacune des trois plaques de gauche dans chaque rangée, et pipettes ~ 35 ul filtrés solution UF à droite, trois plaques dans chaque rangée. Couvrir le poste de travail de coloration avec un couvercle pour éviter toute exposition à la lumière avant la coloration des protéines.
5. Préparer une station d'incubation de la grille EM par remplissage d'une boîte vide à mi-chemin avec de la glace, et ensuite collé à un élément de suspension qui peut être monté sur une base de support. Placez la pince à épiler de l'échantillon dans le hangar, dans lequel les conseils des pinces sont proches de la surface de la glace. La moitié couvre les conseils des pincettes par la hauteur boîte de lèvre. Une boîte de glace idéal pour faire une station d'incubation utilise une embouts de pipette contenant vide.

3. OPNS opération

1. Décharge luminescente du film mince de carbone recouvert de 300 mailles des grilles EM de cuivre pendant 10 sec.
2. Procurez-vous un réseau avec des pincettes et accrocher la pince à épiler dans le cintre en gardant la grille à 45 ° d'inclinaison et 1 pouce au-dessus de la glacesurface à l'intérieur de la station d'incubation.
3. Diluer l'échantillon de protéines avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) à une concentration finale en protéine de 0,01 ~ à ~ 0,005 mg / ml. 4 pi ~ fort dilué l'échantillon immédiatement après la dilution du côté de la grille EM du carbone. (DPBS peuvent être modifiés à un autre tampon si la protéine est sensible à DPBS)
4. Incuber l'échantillon sur les grilles EM ~ 1 min à l'intérieur de la station d'incubation.
5. Enlever l'excès de solution par l'intermédiaire de toucher rapidement le bord de la grille avec un papier filtre.
6. Appuyez sur la grille rapidement à la première goutte (~ 35 pi) de la surface de l'eau pure au sommet de la feuille Parafilm juste après l'excès de solution a été retiré sur la grille de EM. Et puis enlever l'excès d'eau rapidement avec un papier filtre.
7. Répétez l'étape 3.6 pour encore deux fois par lavage de la grille EM sur les deux gouttes d'eau restantes sur le parafilm (étape 3.6 et 3.7 peuvent être ignorées si l'échantillon est très sensible à l'eau).
8. Faire flotter le gri EMD immédiatement sur la surface de la première goutte de UF solution juste après l'excès d'eau sur la grille EM a été retiré. Et puis incuber pendant 10 sec. Assurez-vous de terminer les procédures de lavage de l'eau à moins de 3 secondes avant la grille flottante sur la surface de la solution UF. Plus le temps de lavage, meilleure est la qualité sera.
9. Nettoyer la pince à épiler en pénétrant dans les conseils dans un papier filtre pour ~ 2 - 3 fois.
10. Retirer l'excès de solution sur la grille par contact avec le bord de la grille avec le papier filtre, puis flotter la grille de la deuxième baisse de l'UF.
11. Continuer étape ci-dessus 3.10 sur la deuxième goutte.
12. Flotter la grille sur le troisième gouttelette de solution UF et couvrir le poste de coloration pour ~ 1 min.
13. Etape facultative: laver la grille rapidement sur une surface de l'eau comme décrit au paragraphe 3.6. Cette étape supplémentaire bénéficiera échantillons contenant plus de particules d'or libres chargés ou tache de fond.
14. Enlever l'excès de solution en contact avec le papier-filtre de the ensemble de grille arrière (opposée à la face de carbone). Séchez la grille sous un léger courant d'azote gazeux à température ambiante juste après l'observation d'absorption sur le papier filtre la solution.
15. Placez la grille sur une feuille de papier filtre dans une boîte de Pétri, et couvrir le plat partiellement avec un capuchon à sécher pendant au moins 30 min sous RT. Pour certains échantillons, placer la grille dans un incubateur à 40 ° de la cuisson pendant une heure.
16. Rangez la grille dans une case de la grille de EM pour l'avenir EM examen.

4. EM examen

1. Alignez le TEM correctement avant EM examen des petites protéines sur la grille.
   1. Vérifiez la résolution de la plus haute Thon-anneau visible qui est le spectre d'un film de carbone amorphe de puissance pour déterminer si le TEM a été aligné correctement. Depuis le TEM est partagée par de nombreux utilisateurs différents, le MET a souvent pas correctement aligné.
   2. Vérifiez soigneusement le spectre de puissance sur la zone de film de carbone de l'échantillon pour ajuster la conditio d'alignementn de la machine. Les plus fortes Thon anneaux visibles sont mieux que la résolution ciblée.
      NOTE: À titre d'exemple d'un bon alignement d'un TEM LaB6 à incandescence dont moins de 120 kV haute tension, plus de 20 Thon-anneaux peuvent être visualisées, dans lequel, la résolution correspondante peut être mieux que 5,0 Å. Cette Thon torique a été obtenue par transfert de Fourier d'un film de carbone amorphe sous une défocalisation imagée de ~ 1,6 um et une dose de 20,4 e / A2 (figure 5).
      REMARQUE: Observation de la haute résolution Thon-anneau est une condition nécessaire, mais pas une condition suffisante pour un bon alignement. Pour réaliser effectivement les images à haute résolution, de nombreux autres paramètres sont également importants, tels que la qualité de l'échantillon, dégâts d'irradiation, de charge et de la dérive ainsi que le débit de dose d'éclairage.
2. Apportez la défocalisation revenir à près de Scherzer mise au point pour l'imagerie des petites protéines sur une zone idéalement teinté.
3. Recherche pour la zone "trouble" à image. Une zone idéalement coloré est habituellement situé à proximité du bord de la surface de la tache plus épais, ce qui ressemble à un domaine "trouble" sur la grille depuis l'épaisseur de la tache n'est généralement pas répartie uniformément sur ​​la grille recouverte de carbone (Figure 6). Généralement, un faible grossissement (<100x) était d'aider à trouver ces zones nuageuses avant de zoom pour l'imagerie.

Results

Les mises en œuvre de OPNS comprennent les examens morphologiques et structurales des diverses espèces telles que les lipoprotéines: HDL naissante recombinant (rHDL), HDL recombinant sphérique, HDL plasmatique, LDL, IDL et VLDL (figure 2) ^30; ainsi que les petites protéines telles que 53 kDa CETP (parmi les plus petites protéines imagées avec succès par EM) (Figure 3) ⁶ et des anticorps IgG (160kDa une des protéines les plus dynamiques et hétérogènes) (Figure 4) ^4,5,29,52 , même de 28 kDa libre lipide apolipoprotéine A-1 (figure 2L), et GroEL et protéasomes (Figure 2 M et N).

D'autres exemples de OPNS comme une méthode à haut débit examinent les interactions protéine-protéine pour découvrir les mécanismes de protéines, comme 53 kDa CETP. Comme décrit dans l'introduction, la façon dont la CETP interagit avec les différentes sous-classes de lipoprotéines sont InvestigaTed via l'examen de plus de 400 spécimens EM ⁶ Pour autant que nous savons, il n'y avait pas un cas d'étude cryo-EM qui consiste à dépister près d'une centaine des conditions différentes.

OPNS peuvent repousser les limites EM pour étudier la structure asymétrique et petite protéine 3D et même s'étendre à obtenir la structure 3D former une protéine unique et individuel (sans en moyenne). Par exemple, l'anticorps IgG est de 160 kDa molécule ayant une structure très souple, dans lequel la reconstruction 3D à résolution intermédiaire est difficile à atteindre. le procédé OPNS a été utilisé pour l'image d'un anticorps IgG à partir d'un individu série d'angles de basculement (figure 4E et H). Les raisonnablement haute résolution et de protéines de contraste élevé des images de OPNS autorisées pour le succès de la reconstruction d'une protéine unique par individu tomographie électronique de particules (IPET) (Figure 4E - J) ^4,5. En reconstruction IPET 3D ^{(Figure 4F et G) 4. Par la même approche, un seul complexe anticorps-peptide a été reconstruite, et le peptide induit le changement de conformation domaine interne d'une seule particule d'anticorps a été découvert (Figure 4E et J, la résolution ~ 16,6 Å) 4,5. En comparant les reconstructions 3D à partir de différentes particules individuelles, l'analyse structurelle peut nous permettre de révéler protéines fluctuations thermodynamiques, et même «instantané» les étapes intermédiaires d'une réaction chimique 4,5,29,53,54.}

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Discussion

Par rapport aux techniques conventionnelles NS, OPNS peuvent éviter des artefacts Rouleaux (Figure 1 et 9), offrant haute résolution fiable et raisonnable (~ 1 nm) des détails structurels de petites protéines (Figure 2). Par rapport à la cryo-EM, OPNS fournit un procédé à haut débit et peut examiner une grande variété de protéines et d'interactions protéine-protéine ^6. Cependant, OPNS a toujours ses inconvénients. Par rapport à NS classiques, OPNS implique: i) les mesures plus complexes dans la préparation des échantillons; ii) à l'aide d'une substance radioactive, UF; iii) le maintien de la tache fraîche en raison de la puissance de la tache inférieure UF raison de sa sensibilité à la lumière; iv) pour empêcher la précipitation de la solution UF doit être stocké dans -80 ° C et nécessite décongélation avant utilisation; v) et enfin tout UF doit être traité comme déchet dangereux. Par rapport à la cryo-EM, OPNS fournit relativement plus faibles des images de résolution et aucune garantie pour tout artefact pas encore découvertà l'avenir.

Effets procéduraux de fonctionnement NS sur la formation des lipoprotéines de rouleaux

NS protocoles pour la préparation de protéines pour examen ^16,29-36,55 peuvent être classées en trois grands groupes de méthodes ^50: mélange ^55, goutte-à-goutte ^16, et les procédures de lavage ^29. i) Le protocole de mélange nécessite le mélange préliminaire de la coloration et de la protéine échantillon à un rapport spécifique, et ensuite l'application de la solution mélangée sur un film de carbone déposé sur une grille, enfin enlever l'excès de solution avec du papier filtre avant séchage à l'air pour EM examen ^55. ii) Le protocole goutte-à-goutte comporte l'application (~ 4 ul) goutte de l'échantillon directement à une grille EM revêtue de sit permettant de carbone pendant environ 1 min, retirer ensuite la solution de l'échantillon en excès avant l'application d'une goutte (~ 4 pi) de la tache solution sur le même côté de la grille. Après ~ 1 min d'incubation, retirer les excess tache par contact avec du papier filtre propre, enfin soumettre à séchage à l'air ^16,56-58. iii) Le protocole de lavage (Figure 7) nécessitant l'application de la solution échantillon à une grille EM revêtue de carbone pendant 1 min, puis lavage avec de l'eau désionisée trois fois à droite après avoir enlevé l'excès de solution à chaque fois par un papier filtre ^3,29,30. OPNS protocole a été modifié à partir de cette procédure de lavage.

Types et les effets sur la formation des lipoprotéines de rouleaux taches NS

En Nouvelle-Écosse, la diffusion des électrons plus forte en raison de taches de métaux lourds fournir contraste des protéines ^17-20,59. Échantillons NS peuvent en outre subir des doses plus élevées de rayonnement, et améliorer les caractéristiques de protéines par un contraste plus net négatif ^8,9,60. Les taches de métaux lourds peuvent être classés comme suit: les tensioactifs anioniques, y compris l'acide phosphotungstique (PTA) ^{16, 14} et de la méthylamine tungstate tungstate de silicium ^61; cation etic, tel que l'acétate d'uranyle (UC) ^62, UF ^3,29,30, et nitrate d'uranyle (ONU) ^63. Une des taches NS anioniques qui est le plus couramment utilisé est le PTA ^33,64-67. PTA est un hétéropolyacide, qui est généralement utilisé dans un pH de 7,0 à 7,5. PTA peut également être utilisé pour une coloration positive ^3,16,68. Les charges négatives des PTA peuvent médiation des interactions électrostatiques avec des lipides insaturés chargés positivement groupes de tête, comme POPC, sur les deux surfaces de lipoprotéines et liposomes. PTA peut provoquer une formation de rouleaux à travers cette interaction ^{29,30 29,30} régulier même dans la salinité de la mémoire tampon (figure 1). taches d'uranyle, comme d'UC, UF et l'ONU sont des choix alternatifs pour cationiques métaux taches et UC lourds en particulier est fréquemment utilisé pour NS d'une variété de spécimens biologiques ^62,69,70. Des expériences ont trouvé UF ne provoque pas de rouleaux de lipoprotéines contenant des lipides insaturés d'acides gras, comme les POPC. Cependant, UF peut encore induire rouleaux lipoprotéines de formation qui contient des lipides saturés d'acides gras, tels que la phosphatidylcholine de dimyristoyl (DMPC) et de 1-hexadécanoyl-2-octadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (PSPC). Le mécanisme détaillé de cette interaction n'est pas connue. UA / UF / ONU peut tous les travaux à des valeurs de pH inférieures allant de 3,5 à 4.6. De telles valeurs de pH plus faibles ne peuvent pas convenir à certaines macromolécules biologiques qui sont sensibles à un pH de ^14,71. Fait intéressant, l'UA / UF peut fixer la structure des protéines en quelques millisecondes par un mécanisme inconnu ^72. Contrairement PTA, UA / UF est plus semblable à un sel qu'un acide.

UF aurait peut donner de meilleurs résultats que ⁷³ UA, dans lequel, les taches UF et de l'ONU ont des tailles de grains plus petits que d'UC (UF: 0,3 nm, de l'ONU: ~ 0,5 nm) ^3,74. Un exemple intéressant, la structure-comme des détails secondaires d'une petite protéine (53 kDa CETP) peut être directement visualisé des micrographies premières quand UF a été utilisé comme réactif coloration négative par suite de latôt cryo-positif-coloration (cryo-PS) méthode (Figure 8) ⁶ rapporté. Dans cryo-PS, l'échantillon coloré était surgelé en suivant cryo-EM procédure de préparation des échantillons à la place de la procédure de séchage dans le protocole OPNS, ce qui peut provoquer l'effondrement de la structure secondaire. La cryo-PS est une méthode de contraste élevé et des images haute résolution des petites protéines ^75. Depuis les images cryo-PS ont inversé contraste par rapport à ceux du protocole cryo-NS ²² signalé, mais ont cohérente contraste de l'image à celles des images cryo-EM classiques, donc il a été nommé la méthode cryo-PS. Les images cryo-PS montrent que le réactif de coloration, Uranyle formate, pénètre dans la surface moléculaire, contestant la vision conventionnelle que la coloration peut visualiser que la structure de surface extérieure. Le mécanisme de la manière dont le formiate d'uranyle pénètre dans la surface moléculaire est inconnue. Une possibilité est que le cation uranyle protéine se lie disponibles groupes carboxyle, et donc laentourant glace vitreuse est de densité inférieure à la coloration de la protéine et des groupes uranyle, agissant ainsi comme une tache positive. La méthode cryo-PS est similaire à la méthode remplacement isomorphe multiple (MIR), qui était une approche commune pour résoudre le problème de la phase de cristallographie aux rayons X ^76-78. Dans MIR, des échantillons de cristal sont trempés avec une solution atome lourd, y compris l'uranium, pour obtenir une forme isomorphe à sa forme native. L'ajout de l'atome lourd parfois n'affecte pas les dimensions de la cellule de formation de cristaux ou unitaires, mais fournit des informations supplémentaires de la structure cristalline détermination ^76-78. En bénéficiant du petit grain de UF, cryo-PS pourrait fournir un contraste élevé et une image haute résolution d'une seule protéine, ce qui est important pour les études de structures de protéines, surtout quand on considère que presque toutes les protéines sont naturellement dynamique et hétérogène en solution. Pour la validation de cette méthode cryo-PS, nous ouvrons à toute épreuve aveugle du champ EM.

Sel effets de la concentration sur la formation de rouleaux dans les lipoprotéines

Utilisation de la ZEP traditionnelle réactif de coloration négative, la formation de rouleaux observée est plus probablement liée à des interactions lipides au lieu d'interaction des protéines. L'imagerie des échantillons de POPC vésicules de liposomes préparés selon la salinité considérable (0,5 M NaCl), la salinité moyenne (0,25 M NaCl), relativement faible salinité (NaCl 0,1 M), et de l'eau pure (Figure 9), les micrographies électroniques montrent la formation de rouleaux était corrélée à la concentration en sel (Figure 9A - D). Utilisation UF réactif de coloration négative, aucun des rouleaux a été observée dans POPC vésicule liposome échantillon ³⁰ (figure 2L), ce qui suggère la procédure de lavage afin de réduire rapidement la concentration en sel juste avant la coloration est une condition nécessaire mais non pas indépendamment suffisante pour empêcher rouleaux dans POPC connexe échantillons.

imagerie TEM petite protéine nécessite un état ​​de focalisation quasi-Scherzer.

Imagerie TEM réussie de petites protéines à plus haute résolution nécessite deux conditions critiques, un alignement correct du faisceau et un état d'acquisition de focalisation proche Scherzer. i) Un alignement correct du faisceau peut être évaluée en fonction du nombre de cycles (Thon visibles du spectre de puissance) sur le transfert de Fourier d'une image d'un film de carbone au titre d'un relativement haut défocalisation. La meilleure est la condition d'alignement de la poutre, les anneaux plus Thon peut être visualisé et mesurable l'image .. ii) L'acquisition en vertu d'un Scherzer près-focus est une autre condition critique. Une stratégie de norme traditionnelle pour imager des échantillons biologiques utilise généralement élevés défocalisation (1 - 2 pm et même plus), ce qui peut améliorer le contraste de l'image échantillon biologique ^79. Cette stratégie est significatif différent de la stratégie classique pour imager la structure de résolution atomique de matériaux durs, qui souventutilise un accent Scherzer près (~ 50 nm de défocalisation). Bien que, d'une défocalisation plus élevé pourrait renforcer biologique contraste de l'échantillon, les signaux haute résolution seraient en partie éliminés. En conséquence, la complicité de signal à haute résolution serait inférieur à un état supérieur d'imagerie de défocalisation. La raison en est que, l'image de TEM est la convolution de la structure de l'échantillon et l'instrument de FCE. Le FCT est une courbe oscillant contre la fréquence, dans lequel la courbe souvent oscillé traversant amplitude zéro à haute fréquence. Chaque fois que la FCE à travers zéro, le signal de structure échantillon à cette fréquence spécifique sera éliminé (zéro fois un nombre est égal à zéro). Le signal à cette fréquence éliminée ne peut jamais être récupéré par n'importe quel algorithme de correction d'FCT (un zéro divisé par zéro peut être n'importe quel nombre aléatoire à la place du signal de structure d'origine). Sous supérieur imagerie de défocalisation, le FCT osciller beaucoup plus agressive, donc le FCT traverse amplitude zéro plus fréquemment, par conséquent,les signaux de structure à un plus grand nombre de fréquences spécifiques seront éliminés. Les plusieurs signaux qui sont éliminés, le moins la complicité de l'image auront. Notamment, la complicité de l'image ne peut pas être récupéré ou corrigée par une correction de la FCE. Cependant, un certain nombre d'images acquises sous différentes inachevées défocalise peut être utilisé pour remplir les lacunes à l'autre pour obtenir un signal de structure complet de la structure de l'échantillon au moyen d'un procédé de calcul de moyenne, dans lequel une même résolution atomique ^{de 9 à 12} peut être obtenue.

La méthode de calcul de la moyenne est une approche puissante pour parvenir à la structure de certaines protéines hautement symétriques et des protéines structurellement apparentées rigides. Cependant, il reste encore difficile dans l'étude structurale des petites et asymétriques protéines, en particulier pour la dynamique des structures et des protéines flexibles, tels que des anticorps et HDL. Calcul de la moyenne est basée sur l'hypothèse que les particules de protéines sont identiques à la structure et la conformation mais différent dans les orientations, mais beaucoup de protéines sont connues pour subir fluctuation thermodynamique en solution. En appliquant la méthode de la moyenne sans connaître préalablement les protéines thermodynamiques fluctuations de fluctuation, la structure moyenne peut souvent provoquer des domaines ou ^10,80 variation locale dans la résolution ⁸¹ dans les reconstructions cryo-EM manquant.

Le succès dans la réalisation de la reconstruction 3D de petites protéines, telles que 53 kDa de la CETP et de la structure 3D d'une protéine unique, tel que 160 anticorps kDa IgG1, les avantages de l'utilisation de la condition de formation d'image de mise au point proche Scherzer dans une condition d'alignement. Bien que le contraste de l'image semble faible dans les quasi-Scherzer images floues, le contraste peut être facilement améliorée en appliquant simplement un filtrage passe-bas pour réduire le bruit à haute fréquence dans le fond. Nous croyons, la quasi-Scherzer concentrer images véhiculent les signaux structurelles maximales, et peut augmenter la précision de l'alignement de particules et de renforcer l'efficacité dans la reconstruction 3D à une particule et particule individuelle reconstruction de la tomographie électronique.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colorant : Formiate d’uranyle	La division SPI fournit Structure Probe, Inc.	02545-AA
http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml Seringue : 1 ml NORM-JECT	VWR	89174-491	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Filtre pour seringue : 0,2 &mu ; m  ;	VWR	28145-487	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Filtre seringue : 0,02 &mu ; m filter (Anotop 10)	Whatman	6809-1002	http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate	SIGMA-Aldrich	D8537	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US
Parafilm : 4 po x 125 pi	VWR	470152-246	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Grille TEM recouverte d’un film carbone : 300 mesh	Pacific Grid-Tech	Cu-300CN	http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Grille TEM recouverte d’un film carbone : 200 mesh	EMS (Electro Microscopy Sciences)	CF200-Cu	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Pince à épiler : Pince à épiler Dumont L5	EMS (Electro Microscopy Sciences)	72882-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Système de purification d’eau ultrapure	EMD Millipore	Milli-Q Advantage A10	http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Papier filtre : Cercles de grade 1	Whatman	1001-090	http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
		d’aluminium	Tout type
d’embouts filtrants : Embouts de filtre aérosol à faible rétention pour 10 et micro ; L Pipettors	VWR	89174-520	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[en-tête]
Unité de décharge incendiaire	Ted Pella	91000	http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
pointes de filtre : pointes de filtre aérosol à faible rétention pour 40µ ; L Pipettors	VWR	89174-524	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filtres : VWR Signature 200 & micro ; L Pointes de Pipette	VWR	37001-528	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
	Pipet Pipetman	F161201 et F167300	http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx