Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Résumé

Ici, nous montrons le protocole pour l'imagerie par deux couleurs STED nanoscopie la synapse immunitaire cytotoxique des cellules NK récapitulés sur le verre. En utilisant cette méthode, on obtient la résolution nm sous-100 de protéines synaptiques et le cytosquelette.

Résumé

Cellules tueuses naturelles constituent strictement réglementés, les synapses immunologiques finement réglé (IS) afin de lyser les cellules infectées par des virus ou tumorigènes. Réorganisation dynamique de l'actine est essentielle pour la fonction des cellules NK et la formation de l'IS. Imagerie de la F-actine à la synapse est traditionnellement utilisé la microscopie confocale, mais la limite de diffraction de la lumière limite la résolution de la microscopie à fluorescence, confocal, y compris, à environ 200 nm. Les progrès récents dans la technologie d'imagerie ont permis le développement de subdiffraction limitée super-resolution imaging. Afin de visualiser l'architecture F-actine à l'IS, nous récapitulons le NK cytotoxique des cellules synapse en respectant les cellules NK à l'activation du récepteur sur le verre. Nous avons ensuite l'image protéines d'intérêt en utilisant deux couleurs épuisement de l'émission stimulée microscopie (STED). Il en résulte <80 nm de résolution à la synapse. Nous décrivons ici les étapes de préparation des échantillons et l'acquisition d'images à l'aide de la double colou STED nanoscopie de visualiser la F-actine au NK EST. Nous illustrons également une optimisation de l'acquisition de l'échantillon en utilisant le logiciel Leica SP8 et temps-dépendants STED. Enfin, nous utilisons le logiciel Huygens pour le post-traitement déconvolution des images.

Introduction

La synapse immunologique est un milieu complexe de protéines du cytosquelette et des éléments de signalisation. La synapse cytolytique a été décrit comme ayant un «œil de bœuf» comme la structure d'un anneau de filaments d'actine et molécules d'adhésion autour d'un domaine sécrétoire central ^1-4. Cependant, nous savons maintenant qu'il est constitué de domaines microscopiques de signalisation actif qui nécessitent une réorganisation du cytosquelette dynamique continue de la fonction ^5-11. La plupart des informations que nous avons maintenant sur la synapse est dérivé de la microscopie, et immunologistes ont été les premiers à adopter la technologie d'imagerie de pointe.

Une telle nouvelle technologie est super-résolution microscopie. La microscopie optique conventionnelle est spatialement limitée par la barrière de la diffraction de la lumière, qui définit la limite inférieure de résolution pour toute la microscopie par fluorescence, confocal, y compris, à environ 200 nm. Au cours des dernières années, plusieurs techniques ont été developed qui permettent la résolution ci-dessous la barrière de diffraction. Il s'agit notamment de la stimulation émission épuisement microscopie (STED), la microscopie illumination structurée (SIM), la microscopie stochastique résolu (STORM) et la microscopie optique photo-activable (PALM). Ces techniques ont été examinés en détail par ailleurs ^12-15, mais sont décrites ci-dessous. résolution limitée de Subdiffraction est généré de façon unique dans chaque système. Le choix d'une technique de super-résolution, par conséquent, doit être dicté par l'expérience et le système expérimental d'intérêt.

Super-résolution STED est réalisé en utilisant une haute intensité toroïdal faisceau de déplétion sélective que "silences" de fluorescence autour de chaque fluorophore d'intérêt après excitation, ce qui subdiffraction microscopie de fluorescence limitée ^16-18. Un avantage de STED est que l'acquisition de l'image est rapide et nécessite relativement peu de post-traitement. Bien que la sélection de colorant est dictée par les spécificationstral de la position de faisceau d'appauvrissement, qui, dans le système disponible dans le commerce est situé à 592 nm, à plusieurs colorants disponibles dans le commerce sont disponibles que faire des combinaisons de deux fluorophores possible. En outre, les reporters fluorescents couramment utilisés tels que la GFP peuvent être imagées, ce qui rend expériences sur des cellules vivantes ^19,20 possible.

Nous avons déjà utilisé STED pour identifier et quantifier les régions du hypodensité F-actine qui sont utilisés par les cellules NK pour la dégranulation ^21,22. Nous proposons que STED est un bon choix pour l'imagerie de la synapse immunologique en raison de sa disponibilité relativement souple de fluorophores et une amélioration supérieure dans la résolution dans l'axe xy. En outre, sur le système STED disponibles dans le commerce utilisés pour ces expériences, l'utilisation d'un scanner à résonance à haute vitesse (12 000 Hz) permet une acquisition rapide des images avec des dommages minimes pour les échantillons. Une flexibilité limitée dans la sélection de colorant est considéré comme un inconvénient de STED ^12,Toutefois double couleur STED est relativement simple avec plusieurs fluorophores disponibles dans le commerce. L'intégration de la STED avec un microscope confocal à balayage laser permet également d'imagerie confocale supplémentaire en combinaison avec STED, donc pendant STED est limité à deux canaux, des structures supplémentaires peuvent être imagés dans confocal avec une résolution d'environ 200 nm (E. Mace, observations non publiées ). Bien que nous décrivons l'utilisation de STED pour imager des cellules immunitaires, cette technologie est appliquée à une variété de types de cellules, y compris les cellules neurales, et pour la visualisation d'une variété de structures de cellules ^23-26.

SIM utilise une approche différente pour générer des images de subdiffraction limitée. En visualisant les modèles d'excitation périodique connus, l'information peut alors être obtenue sur la structure inconnue est étudiée après transformation mathématique ^27. Cela donne une augmentation de la résolution à ~ 100 nm latéralement ^28,29. L'avantage de la carte SIM est qu'il is compatible avec tous les colorants et les sondes confocaux classiques, cependant l'inconvénient est qu'il est beaucoup plus lente pour acquérir des images et ceux-ci nécessitent une longue post-traitement ^12. Cela limite également son utilisation pour l'imagerie des cellules vivantes.

Enfin, des images de super-résolution peuvent être générés par stochastique photo-commutation de fluorophores. Cette approche est exploitée dans la localisation microscopie photo-activé (PALM) et la microscopie optique reconstruction stochastique (STORM). Par la numérisation de plusieurs cadres de l'appareil photo et la localisation de molécules activées de façon aléatoire qui sont activés "sur" et "off" au fil du temps, des images avec la résolution 20-30 nm sont générées à partir d'images accumulées ^30-32. Le compromis de cette résolution est le temps nécessaire pour acquérir des images.

Ici, nous montrons, en détail, le protocole de préparation et l'imagerie des échantillons de couleurs en double STED. Dans ce système, avec une excitation est puisé, accordable, un laser à lumière blanche. En raison de la naturedu faisceau d'excitation pulsée, ouverture de porte de temps de détection est rendue possible et en outre la résolution augmente. En outre, le système est équipé de gadolinium hybride (HYD) des détecteurs, qui sont plus sensibles que les tubes photomultiplicateurs classiques, permettant ainsi à des exigences de puissance de laser inférieure. Le faisceau d'épuisement pour STED est appliqué en continu et est accordé sur 592 nm, ce qui va dicter le choix des colorants disponibles, aux deux couleurs STED. Combinaisons de colorants couramment utilisés comprennent généralement un excitable par 488 nm (comme Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights verts, ou Chromeo 488) et un excitable par 458 nm (comme Pacifique Orange ou Horizon V500). Ainsi, alors que la détection des deux colorants sera dans une gamme similaire (et les deux sont accessibles par le laser à appauvrissement), l'excitation se produit avec différentes longueurs d'onde. Avec un accordables blanches laser de lumière et accordables détecteurs, maximiser le signal tout en éliminant le chevauchement spectral est fait assez facile. En tant que tel, nous avons eu un bon succès avec combinations de colorants disponibles dans le commerce, telles que le Pacifique Orange et Alexa Fluor 488 (utilisé ici). Notre protocole est adapté vers et décrit l'évaluation des cellules NK humaines que représente le foyer historique de notre laboratoire. Nous sommes précisément en utilisant la lignée cellulaire NK92 dans cet exemple car c'est celui que nous avons régulièrement appliquée dans notre expérimental ^21,33 de travail.

Protocole

Une. Les lamelles couvre-Manteau avec anticorps

1. Préchauffer (à 37 ° C) de 30 ml de RPMI 10% des médias FCS et 1 ml de BD Cytofix / Cytoperm.
2. Préparer une solution de 5 pg / ml d'anticorps purifié dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Pour l'activation de la lignée de cellules NK92, l'utilisation d'anti-CD18 et anti-NKp30 est recommandée.
   1. Cochez une pièce de dix cents environ cercle de taille pour chaque condition sur une lamelle # 1.5 en utilisant un stylo de PAP. Pour une expérience de double couleur, il devrait y avoir quatre conditions: sans tache, double colorées, et les deux conditions colorées simples. Distribuer 200 pl de solution d'anticorps dans chaque région et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
   2. Laver les lamelles couvre-objet en immergeant doucement chacun dans 50 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml à la température ambiante. Le lavage doit se faire immédiatement avant l'ajout de cellules et de soins doivent être prises pour éviter le dessèchement des anticorps sur la lamelle.

2. Activer les cellules NK sur la couverturefeuillets; réparer et perméabiliser

1. Isoler 5 x 10 ⁵ cellules par NK92 état. Centrifugeuse et surnageant décanter. Laver une fois avec 10 ml de médias préchauffé à partir de l'étape 1.1. Centrifugeuse et surnageant décanter.
   1. Resuspendre les cellules dans des milieux préchauffés à partir de l'étape 1.1, à une concentration de 2,5 x 10 ⁶ / ml.
   2. Décanter doucement 200 pi au centre de la région créée dans la section 1.2.1. Incuber à 37 ° C pendant 20 min à 5% de CO _2. (Remarque: cette durée peut être prolongée ou diminuée en fonction de la fonction biologique d'intérêt pour NK granule cellulaire polarisation, 20 min est suffisante.).
2. Suite à l'incubation des cellules, de lavage des lamelles en immergeant doucement chacune dans 50 ml de PBS température ambiante dans un tube conique de 50 ml.
3. Ajouter 1 pi de Triton X-100 à 1 ml de solution préchauffée Fix / Perm à partir de l'étape 1.1 et en profondeur vortex. Fixer et perméabiliser par addition de 200 ul de tampon Fix / Perm (étape 2.3) aux cellules. Incuber pendant 10 mdans dans l'obscurité à température ambiante.

3. Les cellules de taches

1. Préparer le tampon de coloration: tampon phosphate salin (PBS), 1% de BSA, 0,1% de saponine.
   1. Préparer une solution d'anticorps primaire dans 200 pl tampon de coloration (voir l'étape 3.1). (Remarque: anticorps doit être titré avant l'utilisation). Éviter l'utilisation de l'anticorps primaire qui se pose dans les mêmes espèces utilisées pour enrober la lamelle (étape 1.2). Evitez également les liens Strepatividin-biotine pour l'imagerie STED.
   2. Après la section 2.3.1, laver délicatement les lamelles dans 50 ml de tampon de coloration. Tamponnez les bords de la région de PAP-stylo avec coton-tige pour enlever l'excès de tampon. Appliquer la solution d'anticorps créé dans la section 3.1.1. Incuber 30 min à l'obscurité à température ambiante. (Recommandé: incuber des lamelles dans la boîte de diapositives avec une serviette en papier humide pour maintenir l'humidité).
2. Préparer la solution d'anticorps secondaire dans 200 pl colorationtampon. Fluorophores sont recommandées Alexa Fluor 488, Pacifique Orange, et V500. Généralement, une dilution 1:200 est adapté pour l'imagerie STED.
   1. Lavez délicatement les lamelles dans 50 ml de tampon de coloration. Tamponnez les bords de la région de PAP-stylo avec un coton-tige pour enlever l'excès de tampon. Appliquer la solution d'anticorps secondaire. Incuber 30 min à l'obscurité à température ambiante.
3. Répétez le lavage et la coloration pour les protéines d'intérêt supplémentaires. Si la détection de la F-actine avec phalloïdine, cela peut être inclus avec l'anticorps secondaire, généralement à une dilution de 1:200.

4. Mont lamelles couvre-sur Diapositives

1. Préparer le milieu de montage. Remarque: Prolonger ou prolonger or sont préférables. Vectashield doit être évitée, car elle n'est pas compatible avec STED. 2,2-thiodioethanol doit être évitée si phalloïdine est utilisé. Mowiol est acceptable.
2. Placez environ 10-20 pi de milieu de montage sur une diapositive. Inverser lamelle (cellule vers le bas) et lamelle monter doucement, en prenant soin deéviter l'introduction de bulles d'air. Incuber les lames pendant 24 heures (lamelle up) avant l'imagerie.
3. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles.

5. Expérimental

1. Initier les lasers et les logiciels requis. Initier STED laser d'épuisement à 100% de la puissance. Aligner laser STED, qui dans le cas de systèmes commerciaux est souvent une procédure automatisée.
2. Concentrer l'échantillon, en commençant par le contrôle teinté unique, sur le microscope à l'aide oculaires.

6. Optimisation des Paramètres

1. Scannez le premier canal et d'optimiser la puissance du laser, la position faisceau d'excitation et la gamme de détection. Si possible, éviter un gain de> 100. Capturez l'image dans confocale pour optimiser les réglages. Ligne et / ou un cadre moyenne augmentera résolution. Vérifiez la saturation de pixels. Remarque: il est acceptable dans la saturation confocal en tant que demande de STED réduira l'intensité d'émission. Pour STED, une taille optimale de pixel sera inférieure à 30 nm commentjamais une meilleure résolution sera obtenue avec des tailles de pixels plus petits. La taille de la région d'intérêt étant imagé dictera la limite inférieure de la taille des pixels. La taille des pixels plus petits peuvent augmenter photoblanchiment.
   1. Appliquer STED faisceau d'appauvrissement et de capture d'image, en commençant avec 50% de l'appauvrissement puissance du laser. Si une amélioration de la résolution est vu, plus la puissance du laser d'appauvrissement peut être appliquée. A ce stade, il peut être nécessaire d'ajuster la puissance d'excitation laser, de la ligne moyenne, et / ou le gain.
   2. Appliquer déclenchement de temps pour réduire le fond (minimum 0,3 ns). Réglez les paramètres jusqu'à une amélioration de la résolution sur confocale peut être vu. La résolution peut être approchée par l'estimation à mi-hauteur de la largeur (FWHM). Cela représente la distance à la moitié de l'intensité maximale d'un pic gaussien créé en dessinant un profil de ligne en travers de la structure d'intérêt, et est une méthode largement utilisée pour estimer la résolution.
   3. Une fois que le premier canal est satisfaisante, initier une deuxième séquence de soiINDIRECTS balayage. En général, il est préférable de balayer la longueur d'onde premier fluorophore. Répétez l'étape 6.1 de la deuxième chaîne.
2. Confirmer l'absence de chevauchement spectral par imagerie contrôles colorées simples avec les deux séquences de balayage. Chevauchement spectral légère peut être corrigée à l'aide des fonctionnalités de l'ONU-mélange spectrales dans le logiciel, mais devrait être évité autant que possible.

7. Acquisition de l'image

1. Acquérir des images. Pour l'imagerie quantitative, il est recommandé d'obtenir au moins 20 images / état. Le nombre exact, cependant, doit être défini en fonction de la question expérimentale de concert avec une approche statistique comme le calcul de la taille de l'échantillon. Enregistrer expérience.

8. Déconvolution

1. Ouvrir le fichier avec le logiciel de déconvolution ou traitement par lots. Vérifier les paramètres pour chaque canal en utilisant le logiciel. Confirmez excitation et d'émission de spectres de chaque canal, STED épuisement émission, et l'imagerie directiontion (haut ou bas, si l'image est en 3 dimensions) en particulier.
2. Déconvolutionner aide de l'assistant de déconvolution. Les réglages par défaut sont généralement suffisantes, mais le rapport signal sur bruit (SNTR) varie de fluorophore à fluorophore et devra être déterminé pour chaque canal et chaque expérience individuelle.

Résultats

De toute évidence, l'objectif premier des super-résolution imagerie sera une amélioration par rapport à la microscopie confocale classique. Cependant, il ya certains pièges courants qui peuvent conduire à la résolution optimale. Ceux-ci exigent que chaque expérience est optimisé individuellement. Dans notre expérience représentative, nous sommes imagerie du réseau F-actine dans une des cellules NK activées par l'anticorps lié au verre. Les causes courantes de (et corrections) un manque de résolution améliorée de STED sur confocale sont les suivantes:

1. Sous-échantillonnage (figure 1a). Cela peut conduire à la granulation et la perte d'informations de pixels, comme le montre une faible résolution de filaments F-actine. Ligne a augmenté ou châssis moyenne peuvent souvent corriger cela.
2. Blanchiment et / ou sur-échantillonnage (figure 1b). Cela peut être causé par pixel longue durée de temporisation par suite d'étalement excessif de la ligne. Alternativement, il peut être le résultat de la numérisation sur-de l'image avant l'acquisition, y compris sur l'utilisation dele laser à appauvrissement. Il en résulte souvent des images floues ou brouillées. Ceci peut être corrigé par balayage de la zone d'intérêt que très peu avant l'acquisition et, si possible, augmentation de la vitesse de balayage du laser. Si le problème persiste, la puissance du laser d'appauvrissement peut être réduite.

En atteignant le bon équilibre du temps de séjour de pixels, l'excitation puissance du laser, et l'épuisement puissance du laser, une image avec une meilleure résolution et des informations suffisantes peuvent être générés (figure 1c). La résolution peut être encore améliorée par l'utilisation de déconvolution (figure 1d). Lorsque l'acquisition est optimisée, déconvolution permettra d'améliorer la résolution à la fois qualitativement et quantitativement et sous-résolution de 100 nm devrait être systématiquement réalisable.

Figure 1. Optimisation de l'acquisition et les pièges courants de l'imagerie STED. NK92 cellules ont été activées sur l'anti-CD18 et-NKp30 verre revêtu pendant 20 min puis fixe, perméabilisées et colorées pour la F-actine avec phalloïdine Alexa Fluor 488. A) Un exemple de perte d'informations d'image en raison de sous-échantillonnage. b) Un exemple de perte de résolution due au blanchissement / sur-échantillonnage c) les conditions de d optimisé) des conditions optimisées conduisent à une plus grande amélioration de la résolution de déconvolution. Barre d'échelle = 5 um.

Discussion

L'amélioration de la résolution sur confocale sera un peu dépend de facteurs qui ne peuvent être contrôlées. Ces facteurs comprennent les aberrations mineures d'épaisseur et les incohérences dans les médias montage glissement couverture. Il est important de maintenir la température et l'humidité dans la salle d'imagerie aussi cohérente que possible, et le faisceau STED doit être réaligné environ toutes les 60 min. Comme mentionné dans les procédures, l'utilisation de Vectashield milieu de montage doit être évitée, car ce n'est pas compatible avec STED. En plus de ce qui, il faut toujours utiliser # 1.5 lamelles, et, si possible, utiliser ceux qui ont été vérifiées pour une épaisseur spécifique.

Une modification de l'approche décrite ici est à l'image des canaux supplémentaires en confocale, en utilisant des fluorophores qui émettent à une longueur d'onde que le faisceau STED. De cette manière, une image de boîte jusqu'à quatre canaux (deux en confocale, deux dans STED). Si cette approche, cependant, les canaux avec des fluorophores emitting au-dessus du laser à appauvrissement STED devra être imagée d'abord, comme l'application du faisceau STED se videra photons dans ces canaux. Un avantage de cette technique est la demande de déclenchement de temps, ce qui permettra également d'améliorer la résolution en éliminant confocale par émission de photons de courte durée de vie ^34. En particulier, l'utilisation de déclenchement de temps, le temps de détecteurs d'émissions de correspondre avec excitation pulsée STED, diminue la fluorescence de fond de la réflexion sur le verre de la lamelle lors de l'imagerie proche. Même dans une expérience ne convient pas pour STED, si vous utilisez une source d'excitation pulsé, ouverture de porte de temps peut être un outil utile pour améliorer la résolution dans confocale.

Il existe différentes modifications qui peuvent être utilisés pour améliorer la résolution dans STED. La première consiste à diminuer la taille du trou d'épingle de la une unité d'Airy standard, bien que cela va également diminuer la quantité de lumière atteignant l'échantillon. Ceci peut être compensé en augmentant laspuissance er ou de gain. Une autre est d'augmenter la moyenne de la ligne, ce qui augmentera la quantité de renseignements recueillis pour chaque photon, amélioration de la résolution. Encore une fois, cependant, cela peut se faire au détriment de photoblanchiment de l'échantillon, de sorte qu'un équilibre devra être trouvé entre la résolution et le blanchiment. De même, l'utilisation de protéines fluorescentes comme la GFP, il faudra veiller à éviter l'optimisation blanchiment. Ceci peut être réalisé en diminuant la puissance laser STED si nécessaire. Points de plus longues seront également permettre une plus grande récupération de photons et de réduire blanchiment. Correction pour photoblanchiment doit être comptabilisé lors de l'analyse en direct STED.

Bien entendu, l'imagerie en trois dimensions dans STED est également possible, et donnera également une amélioration par rapport à l'imagerie confocale classiques. Cela est particulièrement vrai si elle est faite en combinaison avec une déconvolution, bien que des précautions doivent être prises pour corriger la dérive qui se produit au cours de l'imagerie des plans multiples dans l'axe z. Si vous utilisez un logiciel Huygensà déconvolutionner, cette correction est obtenu en utilisant la fonction «stabiliser l'image". En utilisant cette approche, la résolution dans l'axe z sera améliorée. C'est une grande amélioration par rapport à l'imagerie confocale classique, qui a une résolution axiale pauvres, et même plus simplement se STED, qui a aussi résolution relativement faible de l'axe z. Bien que l'acquisition de plusieurs piles en STED, il faut prendre soin d'éviter le blanchiment de l'échantillon, et, si nécessaire, on peut réduire la moyenne de la ligne ou de l'intensité de puissance laser afin de le faire. Là encore, il convient de noter que si l'imagerie d'autres fluorophores qui ne conviennent pas pour STED, l'application du faisceau d'appauvrissement dans le premier balayage séquentiel permettrait d'éviter l'émission à partir de ces canaux. Par conséquent, une approche mixte STED / confocale (en utilisant confocale à balayage dans les canaux qui émettent à une longueur d'onde supérieure à 592 nm) ne sera malheureusement pas adapté pour la 3D.

Pour résumer, nous avons choisi STED comme une approche en raison de sa relative facilité d'applicationblication et amélioration de la résolution sur l'imagerie confocale standard. Pour l'imagerie de la synapse immunologique, il s'est avéré une technique efficace et précieux qui nous permet de voir les détails de l'architecture n'est pas possible F-actine à une résolution de plus de 200 nm. Alors que beaucoup de ces détails semblent subtile, ils peuvent avoir un effet profond sur la fonction des cellules NK. Ainsi, nous appliquons la dernière technologie d'imagerie nanoscopique à dériver des informations qui est essentiel pour le maintien de la santé humaine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#1.5 lamelles	VWR	48393-172
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554722
Albumine sérique bovine	Sigma	A2153
Applicateur à embout en coton	Fisher Scientific	S450941
Tubes à centrifuger Falcon (50 ml)	VWR	352070
Sérum de veau fœtal (FCS) (500 ml)	Atlantic Biologicals	S11050
Chèvre anti-lapin Pacific Orange	Life Technologies	P31584
Essuie-glaces de laboratoire	VWR	82003-820
Vernis à ongles	VWR	100491-940
cellules NK-92	ATCC	CRL-2407
Phalloïdine Alexa Fluor 488	Life Technologies	A12379
Solution saline tamponnée au phosphate	Life Technologies	14190250
Réactif anti-décoloration Prolong	Life Technologies	P7481
Anti-CD18 purifié	Biolegend	301202
Anti-NKp30 purifié	Biolegend	325202
Anti-perforine purifié	Biolegend	308102
milieu RPMI 1640 ( 500 ml)	Life Technologies	11875-093
Saponine de l’écorce de Quillaja	Sigma	S4521
Stylo Super PAP Life	Technologies	008899
Triton X-100	Microscopie électronique Sciences	22142
Logiciel de déconvolution Huygens	SVI	Contacter l’entreprise
Leica SP8 TCS STED microscope	Leica Microsystèmes	contacter l’entreprise