Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

Résumé

Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.

Résumé

La crête neurale (NC) est une population de cellules du tube neural dorsal transitoire qui subit une transition épithélium-à-mésenchyme (EMT) à la fin de la neurulation, migre beaucoup vers divers organes, et se différencie en de nombreux types de produits dérivés (neurones, cellules gliales, cartilage et l'os, les cellules pigmentées et endocriniens). Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer la prémigratoire crânienne NC de Xenopus laevis embryons, afin d'étudier le développement NC in vivo et in vitro. Le modèle de grenouille offre de nombreux avantages pour étudier le développement précoce; lots abondantes sont disponibles, les embryons se développent rapidement, le gain in vivo et la perte de stratégies de fonctions permettent la manipulation de l'expression des gènes avant NC dissection chez le donneur et / ou embryons hôtes. Les explants CN peuvent être plaqués sur la fibronectine et utilisés pour des études in vitro. Elles peuvent être mises en culture pendant plusieurs jours dans un milieu défini sans sérum. Nous décrivons également comment greffer NC explants de retourdans des embryons d'accueil pour l'étude de la migration et la différenciation NC in vivo.

Introduction

La crête neurale (NC) est une population de cellules embryonnaires transitoires qui se dégage du tube neural à la fin de la neurulation dans des embryons de vertébrés. Les événements de signalisation et génétiques qui contrôlent la spécification NC commencent dès la gastrulation. Le NC est spécifié à la frontière entre le neural et ectoderme non-neural par des signaux provenant de tissus dorsaux environnantes. A la fin de la neurulation, les cellules subissent une transition NC épithélium-mésenchyme à-(EMT) et migrent en détail dans la suite de l'embryon routes stéréotypés en répondant à des signaux de guidage entourant. Une fois qu'ils ont atteint leur destination finale, ils se différencient en une vaste gamme de produits dérivés, par exemple les neurones, les cellules gliales, les os, le cartilage et les cellules pigmentées ^1-5. En raison de leur contribution à de nombreux types de cellules et de tissus embryonnaires, les défauts à toute étape du développement des cellules NC, de l'induction de la différenciation finale, peut provoquer des syndromes congénitaux nommés neurocristopathies ^6. Emanipulation Xperimental de la NC en développement à différents stades - Spécification, EMT, de migration et de différenciation - permettra d'améliorer notre compréhension de neurocristopathies et permettre la conception de stratégies thérapeutiques potentielles.

L'embryon de Xenopus laevis est un modèle de choix pour étudier le développement NC. Un grand nombre d'embryons sont faciles à obtenir, et la fécondation externe donne accès aux toutes premières étapes du développement. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement X. laevis développement embryonnaire. Gain de fonction et knockdown gène sont faciles à effectuer par micro-injection de cellules individuelles de début blastulas. Tissus embryonnaires peuvent être coupés pour réassociation in vitro ^7-11 ou tests de back-greffes ^12,13.

Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer prémigratoire crânienne NC dans X. laevis neurulas fin, avant la migration. Ces explants peuvent être cultivées sur fibronectine coateplaques d pour étudier la migration et la différenciation en contrôlées in vitro conditions expérimentales. NC explants peuvent également être greffés sur des embryons normaux de l'hôte ou manipulées pour étudier leur migration et la différenciation in vivo.

Protocole

Les expériences sont conformes à la réglementation nationale et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et aux principes établis à l'échelle internationale de remplacement, de réduction et de raffinement.

Une. Préparation de plats fibronectine ¹⁴

1. Introduire à la pipette 500 ml de 10 mg / ml de fibronectine culture primaire dilué dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) dans une boîte de Petri en plastique standard (Ø 40 x 11 mm). Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: si vous utilisez des plats en verre ou des lamelles de verre pour l'imagerie ultérieure, utiliser un / ml solution fibronectine de 100 mg.
2. Rincer trois fois avec PBS 1x.
3. Remplacer PBS avec 500 ml de 1 x PBS contenant 0,1% albumine de sérum bovin (BSA). Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
4. Rincer trois fois avec PBS 1x.
5. Remplissez avec PBS 1x et conserve à 4 ° C jusqu'à utilisation (généralement pendant 24-48 h).

2. Dissection des explants NC

1. Préparer 3/4 normale amphibie moyen (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO _{3) 2,} 1 mM _MgSO4, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM de NaHCO _3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamycine ^10,15). Ne gardez pas plus de 1 semaine pour la dissection, conserver à 4 ° C. NAM plus ancien peut être utilisé pour la préparation de plats de dissection agarose revêtu (ci-dessous).
2. Préparer 60 mm boîtes de Pétri pour la dissection, revêtues avec 10 ml d'agarose à 2% dans 3/4 NAM.
3. Récupérer des outils de dissection: pipettes Pasteur en plastique, une broche plus beaux insectes monté sur support de broche (voir le tableau des matériaux pour la référence), un "couteau de sourcil" (en poils de sourcils inclus dans la paraffine à l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre ^16), deux beaux pinces à dissection, P1000 pipette et des conseils, un stéréoscope binoculaire avec un grossissement 8-40X à 50, une source de lumière brillante avec des guides de fibres optiques. Tous les outils de dissection doivent être maintenus propres, après chaque expérience, les rincer deux fois avec de l'eau distillée, une fois with 100% d'éthanol et laisser sécher. Conserver à l'abri de la poussière.
4. Remplissez le plat de dissection avec NAM frais presque au sommet.
5. Obtenir X. laevis embryons selon les procédures standard ¹⁰ et les vieillir jusqu'à ce qu'ils atteignent neurula étape 16 (selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement ^17).
6. Placez étape 16 embryons dans le plat de dissection à l'aide de la pipette Pasteur en plastique.
7. Effectuer toutes les étapes ultérieures dans le cadre du champ binoculaire. Retirer la membrane vitelline avec deux paires de pinces. Veillez à ne pas endommager la partie dorsale de l'embryon.
8. Attendez jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade 17 pour commencer la dissection. Etape 17 est approprié depuis la crête neurale est clairement mis à part le tube neural, contrairement aux étapes précédentes. Après l'étape 17, NC commence la migration et se mêlant à la mésenchyme environnant.
9. Creusez un petit trou dans l'agarose avec des pinces pour faire un créneau pour les embryons afin de maintenireux au cours de la dissection. Placez un embryon dorsale vers le haut. Remarque: la pâte à modeler peut être utilisé pour maintenir les embryons de creuser un trou à la place dans l'agarose.
10. Faire une incision dans la partie latérale du pli neural antérieur avec le couteau à sourcils et l'axe d'insecte. Veillez à ne pas aller trop loin dans l'embryon: viser à couper à travers 2-3 couches de cellules (jamais atteindre le plus profond que le archenteron!). Pendant tout le processus de dissection, ne laissez jamais les tissus disséqués pour entrer en contact avec l'interface air-liquide depuis X. tissus embryonnaires laevis sont lysées par la tension superficielle.
11. Faire un deuxième incision parallèle dans la partie la plus dorsale du pli de neurones en utilisant les mêmes instruments.
12. Si nécessaire, tourner le plat autour de 90 °. Faire une troisième incision avec le couteau perpendiculaire à sourcils et l'axe d'insecte, à la face postérieure des deux premières incisions. Le NC est une masse épaisse de cellules sous la couche externe pigmentée de l'ectoderme, latéraldans le tube neural.
13. Utilisez la pointe du couteau de sourcil de détacher la couche pigmentée de l'ectoderme NC sous-jacent, à partir du troisième bord de l'incision.
14. Utiliser le côté du couteau de sourcil pour détacher le tissu NC partir de la troisième incision. Le tissu NC est plutôt grisâtre, tandis que le mésoderme céphalique sous-jacente est blanc. Séparez délicatement le NC du mésoderme.
15. Détachez le tissu NC antérieure de la vésicule optique, et couper à ce niveau pour libérer l'expiant. Comme un contrôle de premières expériences, contrôle l'expression de snail2 (un marqueur NC canonique) dans certains explants par hybridation in situ est recommandée.

3. Les explants de placage sur la fibronectine

1. Remplissez le plat de fibronectine avec modification Danilchick moyen (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO ₃ 5 mM, K gluconate de 4,5 mM, Na gluconate de 32 mM, MgSO ₄ 1 mM, _CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, ajuster le pH à 8,3 avec 1 M Bicine ^18).
2. Transférer les explants dans le plat de la fibronectine revêtu à l'aide d'une pipette P1000. Ne laissez jamais les explants de toucher l'interface air-liquide. Tout d'abord, la pipette du liquide dans la pointe, puis les explants, puis certains nouveau liquide. Ne pas permettre à l'air dans la pointe tout en transférant les explants dans le plat de fibronectine. Une fois la pointe est à l'intérieur du liquide de la boîte de fibronectine, laisser les explants vont lentement par gravité, ou pousser très doucement. Évitez d'éjecter les explants trop vite.
3. Placez 10-30 explants dans le plat à l'aide du couteau de sourcil. Éviter les parois de la capsule, qui ne sont pas adéquats pour l'imagerie ultérieure.
4. Essayez de ne pas déplacer l'antenne jusqu'à ce que les explants ont attaché sur la fibronectine (cela prend environ 15-30 min). Si nécessaire, déplacez le plat très attentivement.
5. Placer le plat dans un incubateur réfrigéré (entre 15-20 ° C, pour le graphique de température voir ^17). Lorsqu'il est placé à 15 ° C, les cellules are la migration en général de manière efficace et de diffusion après 6 heures d'incubation (ce calendrier peut varier entre les expériences).

4. Greffage explants dans des embryons d'accueil

1. Coupez une lamelle de verre bien en très petits morceaux à l'aide de pinces grossières. La taille des pièces doit être d'environ 1,5 mm ^2. Plongez les morceaux dans une boîte de Pétri contenant 3/4 NAM ou PBS en utilisant une pince.
2. Préparation de l'embryon hôte: disséquer l'hôte NC à 3/4 NAM comme décrit dans 3) avec un soin particulier à ne pas endommager l'embryon hôte tout en enlevant la membrane vitelline et la dissection du NC. La tension du tissu tend à augmenter la taille de l'ablation: laisser l'embryon hôte soigne partiellement tout en disséquant le donneur d'embryon.
3. Dans un autre plat d'agarose revêtues ou dans une autre partie du même plat, disséquer l'expiant NC de l'embryon donneur tel que décrit dans le protocole 3. Transférer la greffe NC dans le plat contenant l'hôte avec soin, comme décrit dansProtocole 3.
4. Placer immédiatement l'expiant NC sur la zone d'ablation hôte en utilisant une pince. L'explantation devrait fixer partiellement. Placer un morceau de lamelle de verre sur l'embryon greffé à maintenir la greffe en place. Choisir un morceau de verre plus grand que l'embryon pour éviter de l'endommager. L'embryon sera un peu aplatie.
5. Attendez au moins 15-20 minutes, puis retirez délicatement la lamelle. Que l'embryon récupérer pendant 10 min et la pipette avec précaution dans un plat propre rempli de 3/4 NAM, en utilisant la pipette Pasteur en plastique.

Résultats

Lorsque plaqué sur la fibronectine, les explants de la crête neurale attachent rapidement (15-30 min) et l'expiant propage à plat dans 2 heures (figure 1A). Après 3-6 cellules h commencent à se disperser. À 24 heures à 15 ° C, de nombreuses cellules ont commencé à migrer loin de l'explant (Figures 1B et 1C). Jaune rend les cellules très lumineux sous contraste de phase (figure 1B). protubérances cellulaires (filopodes et lamellipodes) sont clair...

Discussion

Ce protocole décrit une technique facile à explantation prémigratoire crânienne NC dans X. laevis embryons. Les embryons utilisés pour de telles expériences doivent être robustes et bien guérir. Jetez un lot d'embryons malsaines. En outre, les embryons se développer à des températures différentes (de 12 à 18 à 20 ° C), afin d'exciser la crête neurale, à l'étape 17 et pas plus tard. Après l'étape 17, la crête neurale peut être mélangé avec du mésoderme céphalique et ne peut pas être complètement ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibronectine du plasma bovin	Sigma	F4759-1MG
Albumine sérique bovine, fraction V	Euromedex	04-100-811-C	qualité inférieure peut convenir à cette application
Épingles à insectes en acier inoxydable, taille 000	FST	26001
Pince Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm	FST	11252-20

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