Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La crête neurale (NC) est une population de cellules du tube neural dorsal transitoire qui subit une transition épithélium-à-mésenchyme (EMT) à la fin de la neurulation, migre beaucoup vers divers organes, et se différencie en de nombreux types de produits dérivés (neurones, cellules gliales, cartilage et l'os, les cellules pigmentées et endocriniens). Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer la prémigratoire crânienne NC de Xenopus laevis embryons, afin d'étudier le développement NC in vivo et in vitro. Le modèle de grenouille offre de nombreux avantages pour étudier le développement précoce; lots abondantes sont disponibles, les embryons se développent rapidement, le gain in vivo et la perte de stratégies de fonctions permettent la manipulation de l'expression des gènes avant NC dissection chez le donneur et / ou embryons hôtes. Les explants CN peuvent être plaqués sur la fibronectine et utilisés pour des études in vitro. Elles peuvent être mises en culture pendant plusieurs jours dans un milieu défini sans sérum. Nous décrivons également comment greffer NC explants de retourdans des embryons d'accueil pour l'étude de la migration et la différenciation NC in vivo.
Introduction
La crête neurale (NC) est une population de cellules embryonnaires transitoires qui se dégage du tube neural à la fin de la neurulation dans des embryons de vertébrés. Les événements de signalisation et génétiques qui contrôlent la spécification NC commencent dès la gastrulation. Le NC est spécifié à la frontière entre le neural et ectoderme non-neural par des signaux provenant de tissus dorsaux environnantes. A la fin de la neurulation, les cellules subissent une transition NC épithélium-mésenchyme à-(EMT) et migrent en détail dans la suite de l'embryon routes stéréotypés en répondant à des signaux de guidage entourant. Une fois qu'ils ont atteint leur desti....
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Protocole
Les expériences sont conformes à la réglementation nationale et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et aux principes établis à l'échelle internationale de remplacement, de réduction et de raffinement.
Une. Préparation de plats fibronectine 14
- Introduire à la pipette 500 ml de 10 mg / ml de fibronectine culture primaire dilué dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) dans une boîte de Petri en plastique standard (Ø 40 x 11 mm). Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: si vous utilisez des plats en verre ou des lamelles de verre pour l'imagerie ultérieure, utiliser un / ml ....
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Résultats
Lorsque plaqué sur la fibronectine, les explants de la crête neurale attachent rapidement (15-30 min) et l'expiant propage à plat dans 2 heures (figure 1A). Après 3-6 cellules h commencent à se disperser. À 24 heures à 15 ° C, de nombreuses cellules ont commencé à migrer loin de l'explant (Figures 1B et 1C). Jaune rend les cellules très lumineux sous contraste de phase (figure 1B). protubérances cellulaires (filopodes et lamellipodes) sont clair.......
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Discussion
Ce protocole décrit une technique facile à explantation prémigratoire crânienne NC dans X. laevis embryons. Les embryons utilisés pour de telles expériences doivent être robustes et bien guérir. Jetez un lot d'embryons malsaines. En outre, les embryons se développer à des températures différentes (de 12 à 18 à 20 ° C), afin d'exciser la crête neurale, à l'étape 17 et pas plus tard. Après l'étape 17, la crête neurale peut être mélangé avec du mésoderme céphalique et ne peut pas être complètement .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs remercient Adeline Dolly pour les photos de expiant sur la fibronectine, Eric Theveneau pour des discussions utiles et dans les animaleries de l'Institut Curie. CM est un stage postdoctoral de la Région Ile de France (Domaine d'Intérêt Majeur souches Pole), Université Paris Sud (Attaché Temporaire d'Enseignement et de Recherche), et l'Agence Nationale de la Recherche. Ce travail a été financé par l'Université Paris Sud (Attractivité 2011), le Centre National de la Recherche Scientifique (Programme d'Action Thématique et Incitative), Association pour la Recherche contre le cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le cancer, et l....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Fibronectine du plasma bovin | Sigma | F4759-1MG | |
| Albumine sérique bovine, fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | qualité inférieure peut convenir à cette application |
| Épingles à insectes en acier inoxydable, taille 000 | FST | 26001 | |
| Pince Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm | FST | 11252-20 |
Références
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to....
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Réimpressions et autorisations
