Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Résumé

Un procédé basé sur des protéines fluorescentes de cellules vivantes pour éclairer des vacuoles cellulaires (inclusions) contenant Chlamydia est décrit. Cette stratégie permet une détermination rapide et automatisée de l’infectiosité de Chlamydia dans les échantillons et peut être utilisée pour étudier quantitativement la dynamique de croissance des inclusions.

Résumé

La bactérie intracellulaire obligatoire Chlamydia fait peser un lourd fardeau sur la santé publique mondiale. C. trachomatis est la principale cause bactérienne d’infection sexuellement transmissible et également la principale cause de cécité évitable dans le monde. Un déterminant essentiel du succès de l’infection des cellules hôtes par la chlamydia est la capacité de la bactérie à manipuler la signalisation de la cellule hôte à partir d’un nouveau compartiment vacuolaire appelé inclusion. De l’intérieur de l’inclusion, Chlamydia acquiert les nutriments nécessaires à sa croissance développementale de 2 à 3 jours, et elle sécrète en outre un panel de protéines effectrices sur la face cytosolique de la membrane de la vacuole et dans le cytosol de l’hôte. Cependant, les lacunes dans notre compréhension de la biologie de Chlamydia présentent des défis importants pour la visualisation et l’analyse de ce compartiment intracellulaire. Récemment, une stratégie d’imagerie inverse permettant de visualiser l’inclusion à l’aide de cellules hôtes exprimant la GFP a été décrite. Cette approche exploite rationnellement l’imperméabilité intrinsèque de la membrane d’inclusion aux grosses molécules telles que la GFP. Dans ce travail, nous décrivons comment les cellules hôtes exprimant la GFP ou la mCherry sont générées pour la visualisation ultérieure des inclusions de chlamydia. De plus, il a été démontré que cette méthode se substitue efficacement aux méthodes coûteuses de dénombrement basées sur les anticorps, peut être utilisée en tandem avec d’autres marqueurs fluorescents, tels que Chlamydia exprimant la GFP, et peut être exploitée pour obtenir des données quantitatives clés sur la croissance des membranes d’inclusion à partir d’une gamme d’espèces et de souches de Chlamydia.

Introduction

Les maladies infectieuses causées par des espèces de la bactérie Chlamydia intracellulaire suscitent un fardeau important sur ​​la santé mondiale, y compris les maladies sexuellement transmissibles, la maladie inflammatoire pelvienne, la cécité, la pneumonie et, éventuellement, l'athérosclérose ^1-4. La capacité de Chlamydia d'interagir avec la cellule hôte, à partir de l'intérieur d'une vacuole (appelée inclusion), est un facteur déterminant de leur infection réussie de cellules et de l'hôte. L'inclusion est un compartiment pathogène roman qui permet la croissance de la chlamydia et est modifié dynamiquement tout a....

Protocole

1. Génération de lignées cellulaires hôtes Fluorescent

1. Jour 1. Plate cellules 293T (ou autre ligne d'emballage retroviral) sur des plaques à 6 puits à 2 x 10 ⁶ cellules / puits, à ~ 75% de confluence le lendemain. Si on le souhaite, la plaque de puits en double pour chaque rétrovirus à être utilisés.
2. Jour 2. Aspirer cellules et ajouter 2 ml de milieu de croissance frais (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamine). Transfecter des cellules avec 5-8 ug de chaque vecteur retroviral (contenant la GFP) et le vecteur de l'emballage (par ex., PVSVg) en utilisant de la Lipofectamine 2000 ou similaire réactif et en suivant les in....

Résultats

Les cellules de mammifères exprimant des protéines cytosoliques fluorescents (par exemple, GFP) peuvent être conçus pour permettre un éclairage d'inclusions à Chlamydia, dans des cultures de cellules infectées vivantes. Lors de l'infection à Chlamydia, les inclusions sont facilement visibles sous forme de taches noires dans les cellules hôtes (figure 1). La clarté des inclusions de fluorescence manque peut être exploitée pour l'identification automatique des inclus.......

Discussion

Nous décrivons ici la stratégie expérimentale pour générer des cellules hôtes fluorescents pour de vrai visualisation et l'analyse des inclusions de Chlamydia temps. Cette approche vacuole de visualisation confère la capacité puissante pour éclairer, de suivre et de mesurer quantitativement les propriétés dynamiques des inclusions à Chlamydia dans les populations de cellules ou dans des cellules individuelles au fil du temps. Inclusions de Chlamydia dans les cellules de protéine marquée fluorescent.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µ ; filtres m	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 sans rouge phénol	Cellgro	17-105-CV
Pénicilline G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Plats à fond en verre	MatTek	P35G-1.5-14-C
Lames de chambre, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534