Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

Résumé

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Résumé

Les microARN (miARN) constituent une couche puissante de la régulation des gènes en guidant RISC à cibler des sites situés sur des ARNm et, par conséquent, en modulant leur répression de la traduction. Changements dans l'expression des miARN ont été révélés être impliqués dans le développement de toutes les grandes maladies complexes. En outre, des études récentes ont montré que les miARN peuvent être sécrétées dans l'environnement extracellulaire et dans la circulation sanguine et d'autres fluides corporels où ils peuvent circuler avec une grande stabilité. La fonction de ces miARN circulation reste largement insaisissable, mais des approches à haut débit systématiques, telles que miRNA tableaux de profilage, ont conduit à l'identification de signatures miRNA dans plusieurs conditions pathologiques, y compris les maladies neurodégénératives et plusieurs types de cancers. Dans ce cadre, l'identification de miARN profil d'expression dans le liquide céphalo-rachidien, comme indiqué dans notre étude récente, rend miARN candidats intéressants pour l'analyse de marqueurs biologiques. _content "> Il existe plusieurs outils disponibles pour le profilage de microARN, comme les puces, quantitative PCR en temps réel (qPCR), et le séquençage profond. Ici, nous décrivons une méthode sensible au profil microARN dans liquide céphalo-rachidien par PCR quantitative en temps réel. Nous utilisé les panneaux droits Exiqon microARN prêts à l'emploi PCR I et II V2.R, qui permet la détection de 742 microARN humains uniques. Nous avons effectué les tableaux en triple courses et nous avons traité et analysé les données en utilisant le logiciel GenEx Professional 5.

En utilisant ce protocole, nous avons profilé succès microARN dans divers types de lignées cellulaires et des cellules primaires, CSF, le plasma et les tissus inclus en paraffine fixés au formol.

Introduction

Les microARN appartiennent à la famille de la petite (21-23 nt de long) non codantes des ARN qui régulent l'expression des gènes post-transcriptionnel. microARN peuvent être sécrétées dans l'espace extracellulaire où ils semblent être relativement stables. Alors que la détermination des changements dans l'expression des miARN peut être une étape importante vers l'identification de biomarqueurs, effectuer profils miRNA et la manipulation d'une grande quantité de données peut être intimidant.

Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer les changements dans l'expression des miARN dans le liquide céphalo-rachidien....

Protocole

Le protocole suivant décrit la procédure standard pour isoler l'ARN du CSF et profil microARN en utilisant des plaques de PCR prêts. Notez que l'extraction en phase organique est facultatif, et en ce qu'un ARN de support est ajouté à l'échantillon pendant l'extraction assurant la récupération maximale de l'ARN. Par conséquent, il n'est pas nécessaire de quantifier l'ARN.

Dans l'ensemble, une moyenne de 6-8 plaques peut être exécuté en un jour si l'ADNc est synthétisé la veille (environ 2 heures). L'analyse des données est effectuée lorsque tous les échantillons ont été profilée et chargé dans le....

Résultats

Les résultats de cette étude ont été publiés ^1. Figure 1 montre les résultats de l'analyse des micro-ARN de référence de candidats en utilisant l'application geNorm. En conséquence, deux microARN, miR-622 et miR-1266, ont été identifiés comme gènes de référence et ont été utilisés pour normaliser les valeurs de miARN.

Pour l'étude du LCR, nous avions trois groupes d'échantillons: le VIH (n = 10), HIVE (n = 4), et le VIH + sans enc.......

Discussion

Les microARN sont de petits ARN non codantes qui régulent l'expression des gènes par l'inhibition de la traduction et / ou de promotion de la dégradation de l'ARNm ^2. En raison de leur grande stabilité dans des conditions exemptes de cellules, les microARN ont été détectés dans de nombreux fluides corporels. En outre, le profil d'expression de microARN distinct a été corrélée avec le stade et / ou de la progression dans une variété de cancers chez l'homme ^9.3.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Table 3. Liste des équipements.
Finnpipette Novus Pipette multicanaux	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Tubes PCR transparents	Biorad	TLS0801
Bandes à capuchon plat	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Système de PCR en temps réel	Roche
LightCycler 480 Sealing Foil		>Roche 04 729 757 001
Centrifugeuse réfrigérée 5804R	Eppendorf
Rotor à godet pivotant, 4 places	Eppendorf	A-4-44
Mini centrifugeuse de paillasse	Fisher	05-090-100
Vortex de paillasse	Fisher
1,5 ml Tubes de microcentrifugation, stérilisés	Fisher	02-681-5
Matrix Réservoir de réactifs, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Mini centrifugeuse de paillasse Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Tableau 4. Liste des réactifs.
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Eau distillée ultrapure Dnase, Sans Rnase	Invitrogen	10977-015
MicroARN Panels humains PCR prêts à l’emploi (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana Kit d’isolement des miARN, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 Transporteur d’ARN	Roche Applied Science	10165948001
2-mercaptoéthanol 98 %	Sigma Aldrich	M3148-25ml
éthanol 100 %	Carlo Erba	64-17-5
eau sans nucléases	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	AM9780