Article de méthode

Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

DOI :

10.3791/51185

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15 janvier 2014

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1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Dans cet article

Résumé

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Les protéines antigel (AFPs) se lient à des plans de glace spécifiques pour prévenir ou ralentir la croissance de la glace. L’analyse d’affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence est une modification de la méthode originale de gravure sur glace pour la détermination des plans de glace liés à l’AFP. Les ADP sont marqués par fluorescence, incorporés dans des cristaux de glace simples macroscopiques et visualisés sous la lumière UV.

Résumé

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Les protéines antigel (AFPs) sont exprimées dans une variété d’organismes résistants au froid pour prévenir ou ralentir la croissance interne de la glace. Les ALP se lient à des plans de glace spécifiques à travers leurs surfaces de liaison à la glace. L’analyse d’affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence est une technique modifiée utilisée pour déterminer les plans de glace auxquels les APL se lient. L’APIE est fondé sur la méthode originale de gravure sur glace pour déterminer les avions à glace liés à la PFA. Il produit des images plus claires dans un temps expérimental raccourci. Dans l’analyse APIE, les AFA sont marqués par fluorescence à l’aide d’une étiquette chimérique ou d’un colorant covalent, puis lentement incorporés dans un cristal de glace unique macroscopique, qui a été préformé dans un hémisphère et orienté pour déterminer les axes a et c. L’hémisphère de glace lié à l’AFP est céf sous la lumière UV pour visualiser les plans liés à l’AFP à l’aide de filtres pour bloquer la lumière non spécifique. Le étiquetage fluorescent des AFP permet une surveillance en temps réel de l’adsorption de la PFA dans la glace. Il a été constaté que les étiquettes n’influencent pas les avions auxquels les ALP se lient. L’analyse APIE introduit également la possibilité de lier plus d’un AFP étiqueté différemment sur le même cristal de glace unique pour aider à différencier leurs plans de liaison. Ces applications de l’APIE nous aident à mieux comprendre comment les AFP se lient à la glace pour arrêter sa croissance et pourquoi de nombreux organismes producteurs de PFA expriment de multiples isoformes de la PFA.

Introduction

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La production de protéines antigel (ADP) est un mécanisme de survie important de certains organismes qui vivent dans des environnements chargés de glace. Jusqu’à récemment, on pensait que la seule fonction des ADP était de prévenir ou de ralentir la croissance des cristaux de glace internes qui bloqueraient la circulation, causeraient des lésions tissulaires et un stress osmotique. Les organismes qui ne tolèrent aucun degré de congélation, comme les poissons, expriment des ADP pour inhiber complètement la croissance des cristaux de glace1. D’autres, comme l’herbe, sont tolérants au gel et expriment des ADP pour inhiber la recristallisation de la glace, ce qui réduit la formation de gros cristaux de glace dans leurs tissus2. La stabilisation des membranes à basse température est encore une autre fonction qui a été suggérée pour les AAP3. Récemment, un nouveau rôle a été suggéré pour l’AFP d’une bactérie antarctique, Marinomonas primoryensis, provenant de lacs saumâtres recouverts de glace4. Cet AFP fait partie d’une protéine adhésine5 beaucoup plus grande qui est censée attacher la bactérie à la glace pour un meilleur accès à l’oxygène et aux nutriments6. D’autres microbes sont connus pour sécréter des ADP, ce qui pourrait modifier la structure de la glace dans laquelle ils vivent7.

Des ADP ont été trouvés chez certains poissons, insectes, plantes, algues, bactéries, diatomées et champignons. Ils ont des séquences et des structures remarquablement divergentes compatibles avec leur évolution à partir de différents progéniteurs à diverses occasions; et pourtant ils se lient tous à la glace et inhibent sa croissance par le mécanisme d’adsorption-inhibition8. Les AAP ont chacun une surface spécifique qui agit comme son site de liaison aux glaces (SII). Ceux-ci ont généralement été identifiés par mutagenèse dirigée vers le site des résidus de surface9-11. On présume que l’IBS dispose les molécules d’eau selon un motif semblable à celui de la glace qui correspond à des plans de glace spécifiques. Ainsi l’AFP forme son ligand avant de s’y lier5, 12. Les plans de glace peuvent être définis par leurs indices de Miller, et différents AAP peuvent se lier à différents plans. Ainsi, l’AFP de type I de la plie rouge se lie aux 20-21 plans pyramidaux13,l’AFP de type III lie à la fois le prisme primaire et le plan pyramidal à l’aide d’une surface de liaison à la glace composée11,14, tandis que la tordeuse des bourgeons de l’épinette AFP, une AFP hyperactive, se lie simultanément aux plans primaire et basal15,16. D’autres AFP hyperactifs, tels que mpAFP, se lient à plusieurs avions de glace comme le montre leur couverture complète des hémisphères de cristal de glace simples5,17. On le présume, que la capacité des AAP hyperactifs à lier le plan basal, ainsi que d’autres plans, peut expliquer leur activité 10 fois plus élevée que les AOP modérément actifs18. Bien que l’efficacité des ADP hyperactifs soit bien documentée, leur capacité à se lier à plusieurs avions de glace n’est toujours pas comprise.

La méthode originale pour déterminer les avions de glace à destination de l’AFP a été développée par Charles Knight13,19. Dans cette méthode, un cristal de glace unique macroscopique est monté sur une tige métallique creuse (doigt froid) et formé dans un hémisphère en le submergeant dans une tasse hémisphérique remplie d’eau dégazée. Ensuite, l’hémisphère est immergé dans une solution diluée d’AFP et une couche de glace est cultivée à partir de la solution AFP sur l’hémisphère cristallin de glace pendant plusieurs heures contrôlées par la température de l’éthylène glycol circulant à travers le doigt froid. Le cristal de glace est retiré de la solution, détaché du doigt froid et placé dans une salle de congélation de -10 à -15 °C. La surface est grattée avec une lame tranchante pour éliminer le film de surface congelé de la solution protéique antigel et le cristal de glace est laissé sublimer pendant au moins 3 heures. Après sublimation, les plans de glace liés par les AFFA peuvent être vus comme des motifs gravés blancs dérivés de protéines résiduelles. L’hémisphère de glace peut être orienté vers ses axes cet a,pour localiser les plans basal et prisme de la glace, et déterminer les indices de Miller des taches gravées.

Nous décrivons ici une modification de la méthode originale de détermination des plans de glace liés à l’AFP, une méthode que nous appelons affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence11. Les AFP sont marqués par fluorescence soit avec une étiquette chimérique, telle que la protéine fluorescente verte (GFP)11,16,17,20,soit avec un colorant fluorescent lié de manière covalente à l’AFP5,21. Les ADP marqués par fluorescence sont adsorbés sur un seul cristal de glace et envahis par la prolifération en utilisant la même procédure expérimentale que les expériences originales de gravure sur glace. L’étendue de la liaison de l’AFP à l’hémisphère de glace en croissance peut être surveillée tout au long de l’expérience à l’aide d’une lampe ultraviolette (UV). Une fois l’expérience terminée, l’hémisphère peut être directement retiré du doigt froid et ességé, sans sublimation. Cependant, si vous le souhaitez, l’hémisphère peut être laissé à sublimer pour visualiser une gravure sur glace traditionnelle. Les modifications apportées à la méthodologie de l’APIE raccourcissent de plusieurs heures le protocole traditionnel de gravure sur glace. De plus, il est possible d’imager simultanément plusieurs AFP, chacun avec une étiquette fluorescente différente, pour visualiser les modèles qui se chevauchent des plans de glace liés à l’AFP.

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Protocole

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1. Cultiver des cristaux de glace simples

  1. Prenez une casserole en métal propre (15 cm de diamètre, 4,5 cm de haut) qui s’intègre dans un bain de refroidissement à l’éthylène glycol et peut flotter sur celui-ci.
  2. Préparer des moules cylindriques en polychlorure de vinyle (PVC) (4,5 cm de diamètre, 3-4 cm de haut, 4 mm d’épaisseur), en sciant des sections d’un tuyau.
    1. Couper une encoche (1 mm de large, 2 mm de haut) d’un côté (figure 1A).
    2. Préparez autant de moules pouvant s’insérer confortablement dans la casserole (Figure 1B).
      Note: Une étude a montré que l’alcool polyvinylique (PVA) peut affecter la nucléation de la glace22. Cependant, dans notre système de PVC à moule ouvert, nous n’avons pas rencontré de problèmes de formation de glace atypique.
  3. Appliquez un film léger de graisse sous vide sur l’anneau de surface inférieur de chaque moule, qui est la surface avec l’encoche découpée. Scellez cette surface graissée et entaillée sur une casserole métallique avec les encoches orientées loin du centre de la casserole. Veillez à ne pas remplir ou obstruer les encoches avec de la graisse.
  4. Ajouter 0,22 μm d’eau filtrée et dégazée/désionisée au centre de la casserole, mais à l’extérieur des moules, et laisser l’eau entrer lentement dans les moules par les encoches. Attention à ne pas introduire de bulles. La couche d’eau doit avoir une profondeur d’environ 5 mm.
  5. Placer la casserole dans un bain d’éthylène glycol à température contrôlée refroidi à -0,5 °C. La casserole doit être parfaitement plane. Ajouter des poids de lest sur les côtés de la casserole si nécessaire.
  6. Une fois que la casserole et l’eau ont atteint -0,5 °C, ajoutez un petit morceau de glace au milieu de la casserole, à l’extérieur des moules.
    1. Cela nucléera la croissance de la glace dans l’eau surcoolée à travers la casserole et dans les moules. La petite encoche au fond de chaque moule ne permet qu’à un seul cristal de glace de se propager à travers, ce qui donne un seul cristal de glace dans chaque moule.
    2. Incuber pendant la nuit pour former une couche de glace.
  7. Au cours des trois jours suivants, ajouter 13 ml d’eau dégazée/désionisée à 4 °C à chaque moule une fois par jour et faire baisser la température du bain d’éthylène glycol après chaque ajout à -0,8 °C le premier jour, à -1,1 °C le deuxième jour et à -1,5 °C le troisième jour.
    1. Incuber à ces températures pendant la nuit.
    2. Au quatrième jour, les moules doivent être complètement remplis de glace.
  8. Retirez les moules de la casserole, poussez les cristaux de glace hors des moules et conservez-les sur une surface propre, comme un bateau de pesage, dans un congélateur à -20 °C pendant environ 1 heure avant de les manipuler.
  9. Plutôt que de préparer de nombreux petits cristaux de glace simples, un grand cristal de glace unique de plusieurs litres en volume peut être préparé dans un incubateur à température constante comme décrit par Knight23. Le gros cristal de glace peut être conservé pendant un an ou plus s’il est conservé dans un congélateur de -15 à -20 °C. Des portions de monocristallin peuvent être coupées du bloc de glace avec une scie au besoin.

2. Détermination de la singularité et de l’orientation du cristal de glace

  1. Déterminer si la glace expulsée du moule est un monocristallin en observant dans une salle de congélation, entre deux polaroïds croisés (Figure 1D).
    1. Si le cristal de glace est simple, aucune fissure ou discontinuité ne doit être vue, et la direction de la lumière ne doit pas changer à l’intérieur du cristal de glace.
      Remarque : Si une salle de congélation n’est pas disponible, une chambre froide peut être utilisée à la place dans toutes les étapes requises, en faisant preuve de prudence pour travailler rapidement et manipuler la glace avec parcimonie.
  2. En raison de la biréfringence de la glace, on peut déterminer l’orientation de l’axe cen même temps. Utilisez les informations suivantes pour déterminer l’orientation :
    1. Lorsque l’axe cest exactement parallèle à la lumière incidente, en théorie, aucune lumière ne traversera les polaroïds croisés. Si la lumière incidente est légèrement intitulée de parallèle à l’axe c,un spectre uniforme multicolore de lumière est transmis à travers le cristal lorsqu’il est tourné entre les polaroïds croisés. Cette transmittance uniforme résulte de l’inactivité optique de la glace Ih le long de son axe c24. Le plan basal du cristal de glace est normal à l’axe c.
    2. Lorsque l’axe cest plus éloigné du parallèle à la lumière incidente et que le cristal de glace est tourné entre les polaroïds croisés, la lumière transmise alternera entre 0 et 100% de transmittance avec chaque rotation de 90 ° du cristal.
    3. Le plus souvent, l’axe csera normal au plan circulaire du cristal de glace cylindrique.
  3. Déterminer l’orientation des a-axespar des piqûres de glace25, ce qui se fait en enveloppant étroitement le cristal de glace dans une feuille d’aluminium, en creusant un petit trou avec une aiguille à travers la feuille dans la glace sur le plan basal (normal à l’axe c)et en le plaçant sous vide pendant 20 min.
    1. Ce traitement produira une gravure à symétrie hexagonale sur le plan basal, où les axes atraversent les sommets de l’étoile à six côtés (Figure 2A).
    2. Si vous le souhaitez, le cristal de glace peut être coupé avec une scie parallèle ou perpendiculaire à un côté de l’hexagone pour le monter avec un plan de prisme primaire ou secondaire perpendiculaire au doigt froid, respectivement (Figure 3).

3. Adsorption de protéines antigel marqués par fluorescence sur un seul cristal de glace

  1. Montez un seul cristal de glace sur le doigt froid (figure 1C) en alésant d’abord une cavité dans le haut du cristal. Pour ce faire, alternez la fonte de la glace avec deux tiges d’aluminium de diamètre légèrement différent, mais similaire au diamètre du doigt froid, pour former la cavité dans laquelle le doigt froid peut s’insérer.
  2. Refroidir le doigt froid à -0,5 °C, placer dans la cavité de glace et maintenir le cristal de glace en place jusqu’à ce qu’il gèle sur le métal (figure 2B). Évitez les bulles d’air lorsque vous fixez le cristal au doigt car elles entravent le transfert efficace de la chaleur du doigt à la tige.
  3. Remplissez une coupelle hémisphérique d’environ deux fois le diamètre du cristal de glace avec de l’eau ou un tampon désionisé filtré, refroidi à environ 4 °C. Plongez le cristal de glace froid lié aux doigts dans la tasse et enlevez l’excès d’eau ou de tampon de sorte que le sommet du cristal de glace soit à peu près au niveau de la couche liquide et que la glace ne touche pas les parois de la tasse.
    1. Couvrez la tasse d’isolant et abaissez la température à -5 °C.
    2. Attendez environ 1 heure que le cristal de glace se forme dans un hémisphère, en vérifiant son état environ toutes les 20 minutes (Figure 2C).
    3. La glace prendra la forme de la coupe hémisphérique en fondant et en faisant pousser le cristal de glace, mais elle ne devrait jamais envahir pour toucher les parois de la coupe. Il devrait y avoir un espace d’au moins 1 cm entre le mur et l’hémisphère et le doigt froid ne devrait pas dépasser de la glace.
  4. Retirez la tasse du cristal de glace et ajoutez la solution de protéine fluorescente à un volume final de 25-30 ml et à la concentration d’analyse souhaitée, en prenant soin de garder le volume total de liquide dans la tasse inchangé. Une concentration typique d’AFP est de 0,1 mg/ml.
    1. Ressoumisez le cristal de glace dans la tasse de sorte que le sommet du cristal de glace soit au niveau du liquide et que le cristal de glace ne touche pas les parois de la tasse (figure 2D).
    2. Faites tomber la température froide du doigt à -8 °C et laissez la solution protéique geler dans le cristal de glace pendant 2-3 heures, en remuant souvent la solution. La glace formée à partir de la solution protéique doit être d’au moins 5 mm avant d’arrêter la croissance de la glace.
  5. Retirez le cristal de glace de la tasse tout en restant attaché au doigt froid. Détachez la glace de ce dernier en réchauffant le liquide de refroidissement à travers le doigt froid à un peu plus de 0 °C et attendez que le cristal de glace fonde.
  6. Placez le côté plat cristallin sur une surface propre, comme un plat de pesée, en prenant soin de ne pas toucher la glace nouvellement forme et de la conserver à -20 °C pendant au moins 20 minutes avant de la remettre.

4. Visualisation des plans de glace liés aux protéines antigel

  1. La visualisation de la fluorescence se fait dans un congélateur ou une chambre froide assombrie, en plaçant le côté plat du cristal de glace sous les lampes avec des filtres d’excitation spécifiques à la longueur d’onde pour exciter l’étiquette fluorescente et des filtres d’émission de caméra pour bloquer toute autre lumière non spécifique. D’après le modèle, les avions de glace qui sont liés par des ADP peuvent être estimés (figure 4).
  2. Si les lumières spécifiques à la longueur d’onde ne sont pas disponibles, une boîte de lumière UV peut être utilisée à la place.
  3. Les gravures à glace traditionnelles peuvent également être effectuées simplement en permettant à l’hémisphère de glace de se sublimer à -20 °C pendant au moins 3 heures, après quoi la poudre de protéines résiduelles peut devenir visible à la surface de la glace (figure 5).
  4. L’étape 2.3 peut être répétée afin de déterminer l’orientation des axes ade l’hémisphère de glace terminé.

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Résultats

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La préparation et le montage du cristal de glace unique sont les deux étapes de la procédure d’APIE où les erreurs sont le plus souvent commises. Pour déterminer si le cristal de glace préparé est unique, on peut l’examiner à travers des polaroïds croisés (figure 1D),comme indiqué à l’étape 2.1 de la section du protocole. Si un cristal de glace multicristallin est utilisé pour l’analyse APIE, il en résultera une liaison discontinue des AIP sur l’hémisphère sans motif de liaison cohérent (figure 6...

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Discussion

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Le développement de la méthode de gravure sur glace par Charles Knight pour la détermination des avions à glace liés à l’AFP a considérablement fait progresser les études sur le mécanisme de liaison à la glace par les AFP. Alors que les structures des AFP pouvaient être résolues par cristallographie aux rayons X26,27, il n’existait pas de méthode évidente pour déduire la surface complémentaire sur la glace à laquelle l’AFP se limitait. Lorsque l’AFP de type I de la plie rouge a été initialement caractérisée, o...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Remerciements

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PLD est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en génie des protéines. Ces travaux ont été financés par une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada à la PLD. Ce travail a également été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (n ° 23310171) et de la Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Nous sommes reconnaissants aux Drs Chris Marshall et Mike Kuiper pour leur travail de pionnier qui a mené à l’APIE. Nous sommes également reconnaissants au Dr Sakae Tsuda d’avoir fourni des installations pour certains de ces travaux et au Dr Laurie Graham d’avoir mis en place les filtres d’excitation et d’émission de lumière fluorescente.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
NESLAB RTE Bain frigorifique/CirculateursThermo ScientificRTE7
Éthylène glycol, prémélangé Antigel/Liquide de refroidissementCertifié29-3037-0Antigel automobile commun
Doigt froidnon disponiblenon disponibleFabriqué sur mesure en laiton (9 cm de long, 1,5 cm de diamètre extérieur)
Tasse hémisphériquenon disponiblenon disponibleFabriqué sur mesure avec de la résine (8 cm de diamètre extérieur, 6 cm de diamètre intérieur)
Système d’éclairage à double sortie élevéeLightools ResearchLT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FXDes filtres d’excitation supplémentaires et personnalisés peuvent être achetés auprès de Lightools
Research CameraCanonEOS 50D
Filtres d’émissionLightools ResearchLT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVGUn adaptateur de bague de filtre peut être nécessaire pour installer le filtre sur l’objectif de l’appareil photo

Références

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Mots-clés

Ice Crystal GrowthProtein LabelingIce Hemisphere FormationCold Room ImagingWavelength Specific FiltersIce Plane VisualizationProtein Solution Freezing

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