Bottom-up et de fusil de chasse protéomique pour identifier une complète Cochlear protéome

Résumé

l'analyse de protéome de l'épithélium sensoriel cochléaire peut être difficile en raison de sa petite taille et parce que les protéines membranaires sont difficiles à isoler et à identifier. Les deux protéines membranaires et solubles peuvent être identifiés par la combinaison de plusieurs méthodes de préparation et les techniques de séparation avec haute résolution spectrométrie de masse.

Résumé

La protéomique est une approche couramment utilisé qui peut fournir des informations dans les systèmes biologiques complexes. L'épithélium sensoriel cochléaire qui contient des récepteurs transduisent l'énergie mécanique de l'énergie sonore dans un électro-chimique traitées par les systèmes nerveux périphérique et central. Plusieurs techniques de protéomique ont été développés pour étudier l'oreille interne cochléaire, tels que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel de différence (2D-DIGE), des puces à anticorps, et la spectrométrie de masse (MS). MS est l'outil le plus complet et polyvalent en protéomique et en conjonction avec les méthodes de séparation peut fournir un protéome en profondeur des échantillons biologiques. méthodes de séparation combinés avec MS a la capacité d'enrichir les échantillons de protéines, de détecter de bas poids moléculaire et de protéines hydrophobes, et identifier des protéines de faible abondance par la réduction de la plage dynamique du protéome. Différentes stratégies de digestion peuvent être appliqués à tout ou lysat à fractionnée lysat protéique pour améliorer le peptide et la protéineune couverture de séquence. L'utilisation de différentes techniques de séparation, y compris l'échange de cations fort (SCX), en phase inverse (RP), et le liquide électrophorèse fraction de piégeage de gel-élué (GELFrEE) peut être appliquée pour réduire la complexité de l'échantillon avant l'analyse MS pour l'identification des protéines.

Introduction

La protéomique est l'étude des systèmes biologiques complexes par l'analyse de l'expression des protéines, la fonction, les modifications, et les interactions ^1. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour l'analyse du protéome de l'oreille interne, y compris l'anticorps microarray ^2, électrophorèse bidimensionnelle sur gel ^3-5, et DIGE ^6. Toutefois, seul un nombre limité de protéines ont été identifiées et caractérisées ^2,7-10, par rapport aux plus de 10.000 gènes et des marqueurs de séquences exprimées (EST) identifiés dans l'oreille interne ^11,12, MS est la technique la plu....

Protocole

Déclaration d'éthique

Des expériences sur des souris tissu ont été approuvés par l'Université de Floride du Sud institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Commission (protocoles 3931R, 3482R) comme figurant sous les lignes directrices des National Institutes of Health.

Une. Extraction des protéines

1. Isoler épithélium sensoriel cochléaire de 16 à 30 jours-vieux (P30) des souris CBA / J et conserver à -80 ° C.
2. Le jour de l'expérience, le tissu de lavage avec 500 ul de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Centrifuger 3 min à 1000 xg, et retirer le surnageant. Répéter p....

Résultats

Pour obtenir le protéome la plus complète de l'épithélium sensoriel cochléaire, la dissection des tissus rapide est nécessaire avant l'extraction de la protéine et la préparation des échantillons. Deux techniques protéomiques peuvent être utilisés, fusil de chasse et de bas en haut de la protéomique. Pour préparer des échantillons pour la protéomique de fusil de chasse, FASP procédure de digestion a été utilisé comme l'illustre la figure 1. La méthode de FASP permet de concentration des protéines, l'éli.......

Discussion

Les étapes clés pour maximiser l'identification des protéines à partir de l'épithélium sensoriel cochléaire sont: 1) l'utilisation de multiples endoprotéinases pour la digestion, 2) l'utilisation de techniques de séparation multiples, et 3) l'utilisation d'un spectromètre de masse à haute résolution. L'application de plusieurs enzymes augmente le nombre de peptides et améliore la couverture de la séquence de protéine, d'où l'amélioration du nombre de protéines identifiées à part.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cartouche 8 % tris-acétate  ;	Protein Discovery	42103
Acétone	Sigma-Aldrich	179124
Acétonitrile	Honeywell	015-1L
AEBSF	Calbiochem	101500
Formate d’ammonium	Fisher Scientific	AC16861
Aprotinin	Calbiochem	616370
ASB-14  ;	Calbiochem	182750-5GM
Albumine sérique bovine	BioRad	500-0112
C18 colonne  ;	Nouvel objectif	A25112	75 &mu ; m x 10 cm  ;
DC Protein Assay	BioRad	500-0116	Protocole de dosage des microplaques
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Endoprotéinase Lys-C	Sigma-Aldrich	P3428
FASP Protein Digestion Kit	Protein Discovery	44250
Acide formique  ;	Fluka	94318
GELFrEE Système de fractionnement	Protein Discovery	42001	GELFrEE 8100
Leupeptin	Calbiochem	108975
MacroSpin Column	The Nest Group	SMM SS18V	Silice C18
Microcystine	Calbiochem	475815
Pepstatin	Sigma-Aldrich	P5318
Polysulfoéthyle A Column	The Nest Group	202SE0503
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Démembreur sonique  ;	Thermo Fisher	15-338-53	Modèle 100
Trypsine	Sigma-Aldrich	T6567	Qualité protéomique