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Article de méthode

Isolation de Double Negative αβ cellules T du rein

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DOI :

10.3791/51192

⸱

16 mai 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

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Résumé

Cellules DNabT sont rares chez les cellules T périphériques; cependant, ils sont abondants dans certains tissus non lymphoïdes. Difficulté d'isoler les cellules T DN à partir de tissus non lymphoïdes entrave leur analyse fonctionnelle malgré l'augmentation reconnu l'importance physiopathologique. Nous décrivons un nouveau protocole pour l'isolement de cellules T DN hautement purifiés à partir de rein de souris.

Résumé

Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules T DN à partir des tissus non lymphoïdes, malgré leur implication de plus en plus rapportée dans diverses réponses immunitaires. DN cellules T sont un type de cellule immunitaire unique qui a été impliquée dans la régulation des réponses immunitaires et de la tolérance aux allogreffes et auto-immunes 6.1. Cellules T DN sont cependant rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions rate et les ganglions), mais sont des résidents du rein normal. On sait très peu sur leur fonction physiopathologique 7 en raison de leur rareté dans la périphérie. Nous avons récemment décrit une analyse phénotypique et fonctionnelle complète de cette population dans le rein 8 dans l'état d'équilibre et pendant les lésions de reperfusion de l'ischémie. Analyse de la fonction des cellules T DN sera grandement améliorée par l'élaboration d'un protocole pour l'isolement du rein.

Ici, nous décrivons un nouveau protocole qui permet isolation de cellules hautement purs ab CD4 + CD8 + T et les cellules T DN du rein murin. En bref, nous digérer le tissu rénal en utilisant de la collagénase et d'isoler les cellules mononucléaires (rein) KMNC par gradient de densité. Ceci est suivi par deux étapes pour enrichir les cellules T hématopoïétiques de 3% à 70% de KMNC. La première étape consiste en une sélection positive des cellules hématopoïétiques CD45 + en utilisant un kit d'isolement. Dans la seconde étape, les cellules T sont isolées à DN négativement par élimination des cellules non désirées à l'aide de CD4, CD8, CMH de classe II et les anticorps monoclonaux et CD1d α-GalCer tétramère. Cette stratégie conduit à une population de plus de 90% de cellules T DN purs. la coloration de la surface avec les anticorps mentionnés ci-dessus, suivie par une analyse FACS est utilisée pour confirmer la pureté.

Introduction

Périphérique αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double négatif cellules (DN) T sont divisés en différents sous-ensembles qui possèdent des phénotypes et des fonctions distinctes 1-4. Cellules T DN sont mal compris, mais de plus en plus impliqués dans les réponses immunitaires physiopathologiques dans différents modèles de maladies 4-6.

Cellules DN T sont un type de cellule immunitaire unique qui est de plus en plus impliqué dans la régulation de diverses réponses immunitaires et auto-immunes et la modulation de la tolérance allogreffe. 4-6, 9 Ils sont rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions de la rate et des ganglions lymphatiques ). Cependant, ils sont les principaux habitants du rein et de l'intestin épithélium normal 10-12. On sait très peu sur leur fonction 7 dans le rein à l'état stationnaire et dans des conditions pathologiques telles que l'insuffisance rénale aiguë (IRA) associée à rein transplfourmi.

En raison des rôles complexes de cellules immunitaires différentes dans la régulation des réponses immunitaires, y compris alloresponses, définissant le rôle de chaque joueur est critique dans la compréhension alloresponses et la conception de nouveaux produits thérapeutiques. Étant donné le nombre important de cellules T DN présents dans le rein dans des conditions physiologiques et pathologiques différentes, les cellules T DN sont susceptibles de jouer un rôle critique dans la régulation des réponses immunitaires et auto-immunes chez la souris et chez l'homme, et alloresponses chez les greffés. Accumuler si la preuve encore dispersés implique cellules T DN dans les deux fonctions pathogènes et immunosuppresseurs, mais il est mal compris pourquoi et comment ils présentent une fonction nuisible ou suppressive spécifique et comment l'environnement influe sur leurs décisions.

En raison de leur faible abondance dans le rein, l'amélioration des méthodes d'isolement sont nécessaires.

Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules de T DN Tes tissus non lymphoïdes. Notre protocole décrit un nouveau procédé pour l'isolement de cellules provenant du rein DN T; Cependant, le procédé peut également être utilisé pour divers tissus non lymphoïdes.

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Protocole

1. Préparation des instruments, de la culture des médias et réactifs

  1. Instruments: Préparer les réactifs dans des conditions stériles et utiliser sous une hotte à flux laminaire.
  2. Préparer 1 litre de milieu de culture RPMI tissulaire, ajouter 5% de sérum fœtal bovin, 2,1 g de bicarbonate, de 10 ml de glutamate 100x, 10 mg d'HEPES, du pyruvate de sodium à 1 mg et de 10 ml de 100x de la pénicilline / streptomycine.
    Note: le milieu de culture tissulaire recommandé, RPMI, est interchangeable avec DMEM.
  3. Préparer une solution à 5% de collagénase "D" (5 ml de collagénase "D" à 9 ml de milieu de culture de tissu).
  4. Ajoutez la solution de Percoll à trois concentrations différentes: 100%, 80% et 40%. Les concentrations suivantes sont calculées pour 1 échantillon. Conserver les solutions à la température ambiante.
    1. Solution de Percoll: ajouter 9 ml de Percoll (non dilué de solution mère); ajouter 1 ml de PBS 10x.
    2. Solution de Percoll: ajouter 8 ml de Percoll 100%; ajouter 2 ml de PBS 1x.
    3. Solution de Percoll:ajouter 4 ml de Percoll 80%; ajouter 4 ml de PBS 1x.
  5. Ajoutez 1 L de cellules activé par fluorescence (FACS) tampon; ajouter 5 ml 10% de BSA (BSA à 0,1%), l'azoture de sodium 1 ml de 10% (0,1%), l'agent 2 ml d'EDTA, faire jusqu'à 1000 ml avec PBS 1x.

2. Préparation du rein Digestion

  1. Ayant acquis une approbation institutionnel nécessaire, sacrifier et être exsangue la souris avec les méthodes standard et en suivant les réglementations en vigueur et des directives de protection des animaux.
    1. Anesthésier les souris avec du pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Passez à la saignée.
    3. Placez la souris dans une position couchée sur une table d'opération.
    4. Pulvériser la zone abdominale avec 70% d'éthanol.
  2. Ajouter 10 ml de solution de collagénase D de la boîte de Pétri.
  3. Retirez et décapsuler les deux reins de chaque souris.
    1. Ouvrir la cavité de abdomimal en faisant une incision médiane abdominale à travers la peau et du péritoine du sternum aule pubis.
    2. Exposer le rein gauche en déplaçant l'intestin latéralement sur le côté.
    3. Séparez délicatement la capsule gauche avec la pince.
      Remarque: La capsule apparaît comme une couche transparente qui entoure le rein et partiellement recouvert par le tissu adipeux périrénal.
    4. Retirez le rein gauche en coupant les vaisseaux pédiculaires en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux.
    5. Répétez cette procédure pour le rein droit.
      Remarque: Le rein droit est plus crânienne et plus proche de la ligne médiane (pédicelles sont plus courts).
  4. Placez le rein dans la boîte de Pétri.
  5. Couper le tissu rénal en petits morceaux (1 à 2 mm en dimension) en utilisant une lame de mise en forme régulière de métal et placer les morceaux dans la solution de collagénase pendant 30 à 45 min dans un incubateur à 37 ° C (figure 1).

3. Préparation des cellules mononucléées du rein (KMNC) à partir de la digestion du rein

  1. Obtenir une suspension de cellules du reindigestion par perturbant mécaniquement le tissu à l'aide d'une passoire (70 um) et remettre en suspension dans 25 ml de milieu de culture de tissus et mélanger.
  2. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter la suspension cellulaire.
  3. Re-suspendre le culot dans 4 ml d'une solution de Percoll à 40% et doucement superposer à 4 ml d'une solution de Percoll à 80% avec une pipette de transfert de matière plastique, très lentement et avec précaution. Cela se traduira en deux phases nettement séparées par une couche translucide. Sur le sommet sera une couche jaune correspondant aux lipides.
  4. Centrifuger à 1500 g pendant 30 min à température ambiante avec la centrifugeuse dans le mode frein.
  5. Retirer par aspiration de la couche supérieure jaune et épaisse (environ 1-2 ml).
  6. Ne recueillir que la légère couche translucide blanchâtre de l'interface des deux phases avec une pipette de transfert. Transférer très soigneusement cette suspension dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de milieu de culture tissulaire, puis ajouter 13 ml de milieu pour obtenir un volume total de15 ml.
  7. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C.
  8. Remettre en suspension les échantillons dans 1 ml de milieu.
  9. Comptez le nombre de KMNC utilisant exclusion au bleu trypan sur un hématimètre et exprimer les résultats sous forme de nombres de KMNC par ml par rein.
  10. Laver une fois comme ci-dessus.

4. Isolation de hématopoïétiques (CD45 +) Les cellules de KMNC (étape I)

  1. Remettre en suspension les cellules jusqu'à 10 7 dans 90 ul de tampon de migration.
  2. Ajouter 10 ul de microbilles CD45 et incuber pendant 15 min à 4 ° C.
  3. Ajouter 1 ml de tampon courante pour arrêter la réaction. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul de tampon de migration.
  4. Préparer la colonne magnétique en plaçant à l'aimant et rincer avec 3 ml de tampon de migration.
  5. Faire passer la suspension de cellules à travers la colonne magnétique et de recueillir les cellules non marquées qui passent à travers la colonne.
  6. Laver les cellules trois fois avec 3 ml de runntion tampon. Ramassez ensuite l'effluent.
  7. Supprimez la colonne du séparateur et la pipette 5 ml de tampon fonctionnant sur les colonnes et débusquer la fraction marqué immédiatement. Cette fraction contient des cellules CD45 +. Compter les cellules.
  8. Pour calculer le nombre absolu de cellules T différents sous-ensembles dans les reins de multiplier le nombre total de KMNC par le pourcentage de cellules positives déterminé par cytométrie de flux (Figure 2).

5. L'isolement de cellules T DN CD45 + de préparation par une sélection négative (étape II)

  1. Ajouter 2,5 pi (0,5 mg / ml, 1,25 ug) de chacun des anticorps biotinylés suivants: anti-CD4, anti-CD8, anti-récepteur Fc (CD16/32), anti-CMH de classe II (I-Ab), anti- CD1d PBS-57 tétramère pour 10 cellules hématopoïétiques 7.
  2. Incuber les cellules pendant 30 min dans une chambre froide.
  3. Ajouter 1 ml microbilles anti-biotine.
  4. Incuber pendant 30 min dans une chambre froide.
  5. Placer le tube dans til aimant et procéder à l'épuisement.
  6. Compter le nombre de cellules viables pour déterminer le nombre total de cellules T DN dans la fraction négative en utilisant un hématimètre.
  7. Vérifiez la pureté des cellules T DN cytométrie de flux en suivant cette stratégie de déclenchement: première porte CD45 +, deuxième porte TCRaß +. Exclure CD1d cellules +. Terrain CD4 + CD8 + contre pour identifier les cellules T DN (Figure 3).
  8. Multipliez le nombre total par le pourcentage déterminé en pureté.
    Note: L'utilisation de ce protocole pour résultat une population de plus de 90% de cellules T DN pures.

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Résultats

Type sauvage C57BL / 6 (B6) rein contient environ 1.5 à 2.1 x 10 6 cellules mononucléées par les reins. Environ moins de 10% de CD45 + des cellules hématopoïétiques. Pour la préparation de cellules mononucléaires (rein KMNC), les reins sont découpés en petits morceaux comme le montre la figure 1, suivie par la digestion à l'aide de 5% de la collagénase.

Ceci est suivi par l'exécution d'une centrifugation en gradient de densité à collecter KM...

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Discussion

Il ya un intérêt croissant dans les cellules T DN car ils sont impliqués dans différentes pathologies telles que les troubles auto-immunes, le cancer, la tolérance du greffon, et les maladies primaires du rein, y compris insuffisance rénale aiguë (IRA), la glomérulonéphrite 8, 13. Par conséquent, il est nécessaire de mieux comprendre et caractériser les fonctions physiopathologiques de cellules T DN. Toutefois, actuellement, il ya un manque de compréhension de la fonction de ces cellules par rapport aux cellu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le NIH PBS (R21 AI095484). Nous remercions l'installation centrale de tétramère INSA de CD1d tétramère.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hotte à flux laminaire  ;Baker Company, IncOu équipement équivalent  ;
CentrifugeuseBeckman CoulterOu équipement équivalent  ;
HémocytomètreMicroscopie électronique Sciences63514-11
Incubateur à atmosphère contrôléeFisher Scientific  ;( 37 ° ; C avec 5 % de CO2)
Cytomètre analytiqueen flux LSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
Collagénase DRoche11088858001
Percoll  ;GE Healthcare17-0891-01
Sérum fœtal bovin  ;Corning Cellgro35-011-CV
Azoture de sodium à 0,1 % (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Tampon salin tamponné au phosphate (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
Tampon EDTA  ;Colonnes Sigma-AldrichE1161
LS  ;MiltenyiBiotec130-042-401
Microbilles CD45+MiltenyiBiotec6.78E-51
Microbilles de biotine  ;MiltenyiBiotec130-090-485
anti-CD45 (clone : 30-F11)  ; PerCP  ;eBioscienceG1397
anti-CD45 (clone : 30-F11)  ; APC-Cy7Biolegend103116
anti-TCR Pacific Blue  ; (ab-chain, clone : H57-597)InvitrogenHM3628
anti-CD4 PEeBioscience12-0043
anti-CD8 FITCeBioscience8011-0087
anti-CD4 biotinylé (GK1.5)BD553728
anti-CD8 biotinylé  ; (clone 53-6.7)BD553029
anti-CMH classe II (I-A b) biotinyléBD553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  ;MIlteny I Biotec130-091-221
C57BL/6J sourisJackson Labs000664Reins - Ganglions lymphatiques Boîte de
Pétri  ;BD Biosciences356517
70 μ ; Filtre M  ;Fisher Scientific22363548
Plunger  ;Ou équipement équivalent  ;
GeneMate Tubes 50 mlBioexpressC-3394-3Ou équipement équivalent  ;
GeneMate Tubes 15 mlBioexpressC-3394-1Ou équipement équivalent  ;
CD1d α ;-galcer tétramèreNHI

Références

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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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